Introduction
Under de senaste decennierna har den extracellulära matrisen (ECM) bli erkänd som ett mångsidigt, dynamisk och komplex miljö som är involverad i flera cell fysiologiska och patologiska processer. På vävnadsnivå, påverkar ECM cellsignalering, rörlighet, differentiering, angiogenes, stamcellsbiologi, tumörbildning, fibros, etc. 1,2. Studiet av ECM organisation och ECM beroende processer har sålunda breda implikationer för cellbiologi och vävnadsfysiologi. För att nå en mekanistisk förståelse av ECM sammansättning, organisation, och funktionella egenskaper, metoder för noggrann isolering av ECM erfordras. Medan den tidigaste identifiering av ECM-proteiner som åberopats isolering från vävnader 3, har framställningen av ECM från odlade celler nu blivit vanligare.
Isoleringen och analys av cell härledd ECM är komplicerat av två skäl. För det första, närvaron av celler ochir rikliga intracellulära proteiner kan göra det svårt att isolera ECM som en diskret extracellulär struktur. En del ECM-proteiner har roller inuti cellen liksom i ECM 4; Därför är det effektivt avlägsnande av intracellulära proteiner från cell-derived ECM avgörande om studier av proteiner inom ECM är inte att förväxla med sina roller inne i cellen. För det andra, är cellhärledda ECM består av många stora, oligomera proteiner, som ofta är kovalent tvärbunden på ECM montering och därför är olösliga i vanliga rengöringsmedel. Dessa egenskaper kan komplicera utvinning och ytterligare analys av ECM. Att hantera dessa frågor, är en metod som krävs som möjliggör effektiv separation av ECM-proteiner från cellulära komponenter.
Flera metoder har beskrivits i litteraturen för isolering av ECM från antingen cellkultur eller vävnadsextrakt. Många av dessa metoder syftar till utvinning av den rikliga ECM protein, kollagen, från vävnader och innefattar användningen av neutrala salter 3, sura betingelser 5,6, eller pepsin 7. Isolering av total-ECM från vävnadsextrakt innebär ofta decellularisering av vävnaden före isoleringen av ECM. Till exempel har en sekventiell extraktionsmetod beskrivits som isolerar ECM från human hjärtvävnad 8. Först var löst bundna ECM-proteiner extraherades med 0,5 M NaCl före natriumdodecylsulfat (SDS) användes för att avlägsna cellerna. Slutligen, var de återstående ECM-proteiner utvinns med hjälp av 4 M guanidin 8. ECM kan också lösas från decellulariserade prover med användning av 8 M urea 9. Andra tekniker använder detergenter, såsom deoxicholsyra 10, för att extrahera både celler och ECM före separation olösliga ECM-proteiner från den lösliga cellysatet genom centrifugering.
Metoden för isolering och analys av cell härledd ECM beskrivs i denna rapport ger en reproskapas metod för att avlägsna cellmaterial, vilket lämnar cellhärledda ECM som kan analyseras genom in situ-immunofluorescens eller extraheras för vidare biokemisk analys. Denna metod kan anpassas för någon adherent celltyp och kan skalas upp för nedströms förfaranden, såsom immunoblotting eller masspektrometri, eller för användning av den isolerade ECM i funktionella studier. Metoden kan även användas tillsammans med konfokal mikroskopi av levande celler för att spåra ECM avsättning av ett märkt protein av intresse i realtid. Detta uppnås genom användning av en förnätade, glasbottnad skål. Sammantaget ger det tillvägagångssätt en exakt isolering av cell härledd ECM och även möjligheter att identifiera och övervaka avsättningen och dynamiken i enskilda ECM-proteiner.
Protocol
1. Avlägsnande av celler med ammoniumhydroxidlösning
- Förbered Vidhäftande celler genom Plätering på lämplig densitet.
OBS: Cellerna kan vara någon adherent celltyp som producerar tillräcklig ECM för analys. Här beskriver vi användningen av COS-7-celler, en afrikansk grön apnjure fibroblast-liknande cellinje som innehåller SV-40 virala DNA-sekvenser; RCS, en råtta kondrosarkom cellinje; eller normala humana dermala fibroblaster (HDF) stammar från ungdoms förhuden. HDF används från passagen 1 till endast passagen 8.- Plattan cellerna på täck för avbildning av levande celler och ECM, för fluorescensmikroskopi studier av fast ECM, eller för framställning av cell-derived ECM för småskaliga funktionella analyser. Plattan cellerna på cellodlingsskålar för SDS-PAGE-analys, immunblot eller proteomikstudier.
OBS: De cellodlingsbetingelser (antal celler för att platta och odlingsmedium) kommer att bero på celltypen. Cellantalet till plattan kommer att behövafastställas empiriskt för den speciella cellinje eller cellstam. - Tillåta en lämplig tid för cellerna att avsätta ECM, typiskt> 16 h. OBS: Tidsperioden kommer att bero på celltypen och kommer att behöva bestämmas empiriskt. Om genomföra ektopisk uttryck, tillåter lämplig tidpunkt för att uttrycka det transfekterade proteinet av intresse och för avsättning av ECM.
- Plattan cellerna på täck för avbildning av levande celler och ECM, för fluorescensmikroskopi studier av fast ECM, eller för framställning av cell-derived ECM för småskaliga funktionella analyser. Plattan cellerna på cellodlingsskålar för SDS-PAGE-analys, immunblot eller proteomikstudier.
- I en Piano, Förbered 20 mM ammoniumhydroxid i ett lämpligt kärl genom att stamlösningen späds 1/14 med Avjoniserat H2O
- Ta bort celler från inkubatorn och försiktigt bort odlingsmedium. Lägg fosfatbuffrad saltlösning (PBS) utan Ca2 + / Mg2 + genom att försiktigt hälla mot väggarna i skålen. Rock skålen två gånger och avlägsna vätskan med en plast överföringspipett. Upprepa ytterligare två gånger.
- I en köksfläkt, luta varje maträtt och ta bort PBS från steg 1,2 med en plast överföringspipett. lägg 3mL ammoniumhydroxid per 100-mm skål och inkubera dem vid rumstemperatur under 5 min. Under 5-min inkubationstid, skaka försiktigt skålen var min för att säkerställa att lys av alla celler. Steg 1,4-1,7 kommer också att genomföras i fläkten.
OBS: Alternativ cell borttagning reagens innefattar 2 M eller 8 M urea, som inkuberas med cellerna under 10 min. - Lägg till kopiösa mängder avjoniserat H2O till varje skål, åtminstone 20 ml per 100 mm skål med gunga. Förfoga över ammoniumhydroxid-solubiliserade materialet-som är sammansatt av ammoniumhydroxid, lyserade celler, och avjoniserat H2O-genom aspiration med en överföringspipett. Överför denna avfallslösning i en behållare för flytande avfall.
- Tvätta den olösliga ECM skiktet i kopiösa avjoniserat H 2 O fyra ytterligare gånger för att säkerställa fullständigt avlägsnande av all ammoniumhydroxid-solubiliserade materialet.
- För undersökning av ECM genom immunofluorescens, fixa ECM genom att tillsätta 2%paraformaldehyd (PFA; 3 ml per 100 mm skål) vid rumstemperatur under 10 min.
Varning: PFA är mycket farlig i fall av hud- eller ögonkontakt och svår överexponering kan producera lungskador, kvävning, medvetslöshet eller död. Det bör endast hanteras i en köksfläkt, och personlig skyddsutrustning ska bäras. - Tvätta varje fast prov två gånger med PBS, som i steg 1,2, och förfoga över PFA lösning i en lämplig behållare flytande avfall. Om så är nödvändigt, förvara ECM prover i PBS vid 4 ° C innan förbereda dem för fluorescensmikroskopi.
2. Spårning Deponering av en ECM protein genom konfokalmikroskopi avbildning av levande celler
- Räkna cellerna under en hemocytometer. För COS-7-celler, plattan 250.000 celler på en 60 mm cellodlingsskål för transfektion.
OBS: För levande cell imaging, måste cellerna transfekteras med en vektor som kodar för ECM proteinet av intresse, sammansmält i ram med en genetiskt kodad fluorescerarnt tag. Detta är för att möjliggöra identifiering av ECM proteinet av intresse under levande cell imaging. - Efter en lämplig tid för proteinuttryck (t.ex. 16 timmar) avlägsnande av cellerna från skålen med trypsin-EDTA-lösning, räkna dem i en hemocytometer, och platt ~ 150.000 celler på en 35-mm inrutade, glas botten maträtt för avbildning. Tillåt 2 h för cellerna att sätta tillbaka och börja ECM nedfall (tidsperioden beror på celltyp och måste fastställas empiriskt).
OBS: Använd en cell medium som inte innehåller fenolrött, eftersom detta kan ge en röd nyans som påverkar bildkvaliteten. - Under den ovan 2 h period, skapa en konfokalmikroskop med en 37 ° C inkubator kammaren och en CO-2 tillförsel. Att temperaturen i kammaren och i skålen stabiliseras vid 37 ° C innan avbildning; detta kan ta upp till en timme.
- Inkubera cellerna ströks ut på de 35 mm inrutade skålen med en fluorescerande cellmarkör i 30 min. Då, tvätta cellernatvå gånger i fenolrött-fritt odlingsmedium före avbildning.
ANMÄRKNING: En cytoplasmatisk fluorescerande markör kan användas för att visualisera cellvolymer, eller en membran införliva markören kan användas för att visualisera cellkanter. - Med hjälp av 20X objektiv och faskontrast på ett konfokalmikroskop, identifiera ett lämpligt kvadratiskt rutmönster som innehåller ett antal (> 3) av vidhäftande, friska celler. Bekräfta uttrycket av målproteinet val i de celler i kvadrat valda gallret med hjälp av 63X eller 100X mål och lämpliga våglängder inom fluorescensmikroskopi.
- Inrätta fluorescens och faskontrast tidsförlopp avbildning med en z-stack programvara. Ställ in "börjar" stack att vara strax under ECM skiktet och "End" stack att vara precis ovanför cellkroppen. Ställa in z-stegstorleken till 0,3 | j, m och z-volymen till mellan en 5 och 10 | j, m djup i totalt, beroende på celltypen. Detta kommer att ge mellan 15-30 Z-profiler per tidpunkt.
- Capture fluorescens (för rött fluorescerande protein (RFP), excitation = 555 nm och emission = 584 nm) och fas-kontrastrika bilder med jämna mellanrum under en viss tidsperiod. Använd till exempel time-lapse programvara för att ställa in tidsintervallet på 2 minuter och varaktigheten till två timmar. Välj "start" knappen för att börja fånga z-sektionsbilder under definierad tidsperiod.
- Vid slutet av tidsperioden, avlägsna cellerna från skålen, som beskrivs i steg 1,1-1,5, för att bekräfta lokaliseringen av fluorescerande-märkta proteinet av intresse i ECM.
- Använd faskontrast avbildning och 20X mål att flytta relevant ruta.
- Växla till 63x objektiv och identifiera ECM skiktet under fluorescensmikroskopi. Jämför denna bild till pre-extraktion bild
3. Steril Beredning av Cell-derived ECM för Cell funktionella analyser
- Odla en population av celler (de "matris producent" celler) på täck och annan popuning ( "test" celler) i standard kultur i en 100 mm cellodlingsskål i minst 24 timmar.
OBS: Det kan finnas några två olika vidhäftande celltyper, och experimentell design kan inkludera transfektion av en eller båda cellpopulationer att uttrycka en fluorescerande-märkta ECM protein. - I en huv med laminärt flöde, som används för cellodling, förbereda sterila lösningar av PBS utan Ca2 + / Mg2 +, 20 mM ammoniumhydroxid (se steg 1.3), och avjoniserat H2O genom att passera varje genom ett sterilt 0,2 pm filter i en lämplig steril behållare.
- Att upprätthålla steril teknik, försiktigt tvätta "matris producent" celler på täck tre gånger med steril PBS (se steg 1,2).
- Avlägsna PBS genom aspiration med en steril pipett och kassera den i en lämplig behållare flytande avfall. Tillsätt 20 mM steril ammoniumhydroxid (3 ml / 100 mm skål) och inkubera dem under 5 min med gungning vid intervaller.
- Lägg till kopiösa mängdersterilt avjoniserat H2O till "matris producent" skålen, åtminstone 20 ml per 100 mm skål med gunga och häll bort cellysatet i en lämplig avfallsbehållare.
- Upprepa steg 3,5 fyra gånger för att säkerställa fullständigt avlägsnande av ammoniumhydroxid-upplöst material.
OBS! ECM deponerats av "matris producent" celler på täck ger sedan en steril ECM för funktionella analyser med alla testceller av intresse. - Inkubera testcellerna från cell lager skålen med 1,5 ml trypsin-EDTA-lösning per 100 mm skål (0,05% vikt / vol trypsin och 0,02% vikt / volym EDTA i Hanks balanserade saltlösning) tills testcellerna frigörs från skålen . Lägg cellmedium, centrifugera testcellerna vid 400 xg under 5 minuter, och avlägsna den överstående vätskan.
- Resuspendera testcellerna med färskt, sterilt medium och räkna dem i en hemocytometer. Plätera ett lämpligt antal av dessa provceller på den sterila, isolerad ECM på coverslips. Kultur dem i lämplig cell medium för 2-3 timmar, eller under den tid som krävs för experimentell design.
- För att undersöka organisationen av aktin cytoskelettet, fixera testcellerna i 2% PFA och färga dem med fluoresceinisotiocyanat (FITC) -phalloidin (excitation = 490 nm och emission = 525 nm) för att visualisera F-aktin och med 4 ', 6 -diamidino-2-fenylindol (DAPI, excitation = 358 nm och emission = 461 nm) för att visualisera kärnor 11.
OBS: Jämför morfologi och aktin organisation i testcellerna pläterade på heterolog cell-derived ECM med testceller ströks ut på egen ECM.
4. Isolering av ECM för SDS-PAGE, immunoblotanalys, eller proteomik
- Väx vidhäftande celler av intresse på 100 mm cellodlingsskålar (5 till 10 rätter för proteomik eller 1-2 rätter för immunoblotting) för 24-96 timmar, beroende på celltypen, för att möjliggöra sekretion och deponering av ECM.
- Ta bort celler som described i steg 1,1-1,5.
- Luta varje platta i en vinkel för att dränera återstående H2O till botten av skålen, och försiktigt avlägsnande av eventuellt kvarvarande H2O med en p200 pipett tills plattan är helt torr.
- Parallellt värme SDS-PAGE-provbuffert innehållande 100 mM ditiotreitol (DTT) till 95 ° C under 2 min med användning av ett värmeblock, och sedan lägga till den till plattan. 200 mikroliter provbuffert per 100 mm platta är lämpligt för prover som skall undersökas av immunoblot.
- För att analysera ECM genom masspektrometri, uppnå en mer koncentrerad prov genom att samla provbufferten SDS-PAGE från skålen (som beskrivs i steg 4,5 och 4,6, nedan), återuppvärmning till 95 ° C, och med användning av samma prov över 2-3 ytterligare plattor.
- Använd en cell skrapa för att grundligt skrapa ECM utanför skålen, se till att alla delar av skålen har skrapats.
- Med cellskrapa, samla provet till en sida av skålen och ta bort den med ett 200mikroliter pipettspets till ett rör.
- Över allt återstående SDS-PAGE-provbuffert utdrag ur cellskrapa spetsen in i röret för att minimera förlusten av ECM-material. För ett koncentrerat prov, åter värma samma SDS-PAGE-provbuffert alikvot till 95 ° C och återanvända den över 2-3 ytterligare plåtar.
- Lös de ECM-proteiner genom SDS-PAGE 12, med användning av antingen 7% eller 4-7% gradient polyakrylamidgeler.
OBS: Det är bekvämt att använda pre-färgade proteinmarkörer. - För att öka upplösningen av hög molekylvikt ECM-proteiner, förlänga gel drifttid så att 37 kDa molekylviktsmarkör löper nära botten av gelén och molekylviktsmarkörer <37 kDa har rymt gelen.
- För proteomik analys av ECM-proteiner, färga gelen med en protein fläck och ta en bild. Klipp band av intresse från gelén, smälta dem med trypsin, och analysera dem genom matrisassisterad laserdesorption / jonisering (MALDI) -mass spektrometri <sup> 13.
- Alternativt, för en mer omfattande analys av ECM extrakt och analysera hela provet, skiva gel körfält i sektioner, smälta dem med trypsin, och utföra vätskekromatografi-masspektrometri (LC-MS) 14.
- Alternativt, för immun 15 överföra proteiner från SDS-PAGE-gel på polyvinylidenfluorid (PVDF) membran vid 15 V under åtminstone 1 timme 10 minuter (halvtorr metod) för att säkerställa överföringen av hög molekylvikt ECM-proteiner . Visualisera det totala proteinet överförs till membranet med en Ponceau S.
- Efter steg 4,11, använda antikroppar för detektion och / eller göra en semi-kvantitativ analys av enskilda ECM-proteiner 15.
- Blockera membranet med 2% (vikt / volym) mjölk i TBS-Tween 20 (blockeringsbuffert) över natten vid 4 ° C. Späd specifika antikroppar till ECM-proteiner i blockerande buffert och inkubera med membranet under 1,5 h vid rumstemperatur (antikropp till FIBronectin utspädd 1/600 och antikropp mot trombospondin-1 utspätt 1/150; Kompletterande Tabell 1).
- Testa kvaliteten på ECM isolering genom åter sondering samma blöt med antikroppar mot rikliga intracellulära proteiner, såsom aktin eller tubulin (anti-aktin späds 1 / 10.000 och anti-tubulin späddes 1/5000).
Representative Results
Protokollet som beskrivs i steg 1,1-1,5 verkar för att avlägsna celler och lämnar bakom cell härledd ECM. Protokollet utfördes på COS-7-celler som odlats under 96 h på täckglas av glas, och cellen härledda ECM analyserades med fluorescensmikroskopi. Ammoniumhydroxid behandling avlägsnas cellerna effektivt, i enlighet med förlusten av cellkärnor och aktin cytoskelettet, enligt DAPI och falloidin färgning, respektive (Figur 1). Extraktionen av celler med 2 M urea var inte lika effektivt som ammoniumhydroxid; spår av DAPI och phalloidin färgning detekterades efter behandling. 8 M urea hade en liknande effekt som ammoniumhydroxid (Figur 1). Härnäst tillsattes cellhärledda ECM visualiseras före och efter ammoniumhydroxid behandling (steg från 2,1 till 2,11). COS-7-celler transfekterades med ett monomert rött fluorescerande protein (mRFP)-märkt trombospondin-1 C-terminal trimer, (mRFPovTSP1C) 11 och odlades på en 35 mm skålen med en inrutade glas bas.
Två timmar efter plätering, en lämplig ruta som innehöll flera friska celler som uttrycker mRFPovTSP1C visualiserades under ett konfokalmikroskop. En referens faskontrast bilden togs av detta område, och sedan fluorescens time-lapse avbildning utfördes varje 1 minut under 2 timmar (Figur 2A). Cellerna avlägsnades sedan med hjälp av ammoniumhydroxid, och samma ruta på skålen flyttades i faskontrast och sedan analyseras på nytt genom fluorescensmikroskopi. Cellerna var inte längre förekommer i ruta, men mRFPovTSP1C kvar inom ECM, detekteras genom fluorescensmikroskopi som karakteristiska puncta (Figur 2A). Någon mRFPovTSP1C deponeras i ECM före avlägsnandet cell identifierades genom att jämföra fluorescensmönstret före och efter avlägsnande av celler. Den fluorescerande puncta identifierades i båda bilderna (Figure 2A, exempelvis pil) är sluta att associeras med ECM.
Ammoniumhydroxid behandling användes sedan för att isolera nativt ECM från odlade, vidhäftande celler. Humana dermala fibroblaster (HDF) odlades på täckglas för 96 h. Celler avlägsnades genom att använda ammoniumhydroxid och ECM sonderades med en anti-kollagen I-antikropp, vilket visade en karakteristisk fibrillärt och meshwork färgningsmönster 16 (figur 2B). Fibronektin mönstring undersöktes runt fasta, icke-permeabiliserade råtta kondrosarkom celler (RCS) och inom ECM efter avlägsnandet av RCS-celler (figur 2C). Ammoniumhydroxid isolering av ECM utfördes också under sterila förhållanden, så att "test" celler kan åter klädd på ECM för fenotypiska eller funktionella studier. Till exempel, "test" COS-7-celler ströks ut i 2 h på sterila ECM produceras av RCS-celler, och thöna de fixerades, permeabiliserades och analyserades med avseende F-aktin organisation av FITC-falloidin färgning, jämfört med COS-7-celler som producerar sin egen ECM (steg från 3,1 till 3,9) (Figur 3).
I större skala, var den metod som används för att isolera ECM för biokemisk. Till exempel var RCS celler odlas på två 100 mm cellodlingsskålar i 7 dagar, och procedurerna i stegen 4.1-4.7 följdes. Proteiner i cellen härledda ECM uppsamlades genom skrapning dem i varm SDS-PAGE-provbuffert och separerades genom SDS-PAGE på en 7% polyakrylamidgel under reducerande betingelser. Gelén färgades med avseende på protein, och de fyra huvudband var och isolerades och analyserades genom masspektrometri (Figur 4A). Ett antal ECM-proteiner, inklusive fibronektin, trombospondin 1 (TSP1), trombospondin 5 / brosk oligomera matrixprotein (TSP5 / COMP), och matrilin-1 identifierades (Figur 4B).
Alternativt kan mindre skala beredningar av ECM utvärderas av immunläsk. Exempelvis cellhärledda ECM från COS-7-celler ektopiskt uttrycker mRFPovTSP1C separerades genom SDS-PAGE, överfördes till ett PVDF-membran, och sonderades för RFP med en anti-RFP-antikropp (Figur 4C). Denna teknik är tillräckligt känsliga för att upptäcka skillnader i avsättning mellan en nativ trimer av TSP1 (mRFPovTSP1C) och en konstruerad pentamer av TSP1 C-terminala regionen (mRFP-TSP-5-1C) 17 (figur 4C). För att undersöka den endogena ECM av HDF, bestämdes närvaron av specifika proteiner i cellysat eller den isolerade ECM undersöktes genom immunoblotting. Den karakteristiska ECM-proteiner fibronektin och trombospondin-1 detekterades i ECM, medan den rikliga intracellulära proteiner α-tubulin och β-aktin var frånvarande från det isolerade ECM (Figur 4D).
Figur 1: Jämförelse av metoder för Cell borttagning. COS-7-celler odlades vid hög densitet under 96 timmar på täck, som fastställs i 2% PFA, och permeabiliserades i 0,5% Triton X100, eller behandlades som anges för att avlägsna cell. Täckglasen färgades sedan med FITC-falloidin för att visualisera F-aktin och DAPI att visualisera kärnor. Skalstreck = 25 | im. Denna siffra är modifierad från en original- publikation i Journal of Cell Science 11. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Identifiering av ECM proteiner i isolerade ECM. (A) faskontrast och fluorescens bilder avCOS-7-celler som uttrycker mRFPovTSP1C och odlas på en 35 mm skål med en glasbottnad, inrutade bas för 2 h. Bilder ska visas före och efter avlägsnande av cellerna genom ammoniumhydroxid. Kanten av galler bokstaven indikeras i bilderna faskontrast med en prickad linje. Vita pilar indikerar exempel på fluorescerande puncta som fanns före och efter avlägsnande cell. (B) Upptäckt av kollagen I i HDF ECM genom indirekt immunofluorescens. HDF odlades under 96 h och avlägsnas med ammoniumhydroxid, och den ECM färgades för human fibrillärt kollagen I. ECM var även färgas med FITC-konjugerad anti-kanin sekundär antikropp enbart. (C) Lokalisering av fibronektin runt RCS celler eller inom isolerade RCS ECM, som detekteras genom indirekt immunofluorescens. RCS-celler odlades under 48 h, fixerades i 2% PFA, och färgades för fibronektin och med DAPI. I parallella rätter, avlägsnades cellerna med 20 mM ammoniumhydroxid och ECM färgades för FIBRonectin och med DAPI. Cellerna färgades också med FITC-konjugerat anti-mus-IgG-antikropp enbart. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Användning av sterilt ECM för funktionella studier. RCS "matris producent" -celler odlades under 48 h på täckglas av glas och behandlas sedan med 20 mM ammoniumhydroxid under sterila betingelser för att avlägsna cellerna. COS-7 "test" celler ströks ut på täckglas med eller utan isolerade RCS ECM under 2 h, fixerades i 2% PFA, permeabiliserades i 0,5% Triton X100, och färgades med FITC-falloidin för att visualisera F-aktin och DAPI att visualisera kärnor . COS-7-celler ströks ut på RCS ECM spridas i större utsträckning och bildade stora filament buntar (t.ex. pil) och kant ruffles. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Identifiering av proteiner från isolerat ECM genom SDS-PAGE, masspektrometri, eller immunoblotting. (A) RCS celler odlades under 7 dagar och tas bort med 20 mM ammoniumhydroxid; ECM skrapades upp i varm SDS-PAGE-provbuffert innehållande 100 mM DTT. ECM beredningen separerades genom SDS-PAGE på en 7% polyakrylamidgel under reducerande betingelser. Fyra signifikanta band (pilar 1-4) identifierades genom proteinfärgning. (B) Proteiner från RCS ECM band 1-4 identifierades genom MALDI masspektrometri. (C) COS-7-celler som uttrycker antingen mRFPovTSP1C (trimer) eller mRFP-TSP-5-1C (pentamer) odlades under 48h och avlägsnas med 20 mM ammoniumhydroxid, och den var ECM isolerades i het SDS-PAGE-provbuffert innehållande 100 mM DTT. ECM beredningen separerades genom SDS-PAGE på en 7% polyakrylamidgel under reducerande betingelser, överfördes till ett PVDF-membran, och sonderades med en anti-RFP-antikropp. Denna panel är modifierad från en ursprunglig publicering i Bioscience Reports 17. (D) HDF odlades under 96 timmar och sedan behandlas antingen med 2% deoxicholsyra i PBS (cellysat) eller med 20 mM ammoniumhydroxid för att avlägsna celler. ECM skrapades in i het SDS-PAGE-provbuffert. De två fraktionerna separerades genom SDS-PAGE på en 10% polyakrylamidgel under reducerande betingelser, överfördes till ett PVDF-membran, och sonderades med antikroppar, såsom anges. I varje panel, är positionerna för molekylviktsmarkörer anges i kDa. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Discussion
Kritiska steg i protokollet
Metoden har några viktiga steg som måste följas för att säkerställa en framgångsrik isolering och analys av ECM. Till exempel är ammoniumhydroxid som används för att avlägsna cellerna och för att isolera ECM för analys. Även om ammoniumhydroxid är stabilt i vattenlösningar i mörker och kan lagras vid rumstemperatur, flaskor måste vara tätt återförseglas mellan varje användning. Eftersom gasen kan avdunsta från lösningen, vilket minskar koncentrationen, vi rekommenderar att starta en ny flaska var 6-8 veckor. Dessutom bör den verksamma lösningen göras färskt för varje experiment. Det är också väsentligt att cellerna är helt avlägsnas med kopiösa tvättar i avjonat vatten. Om dessa åtgärder inte utförs på lämpligt sätt, kan cellmaterial kvar på skålen och förorena analyser nedströms. Om celler har odlats i 10 dagar eller längre, kan ytterligare vattentvättningar behövas. Det är viktigt att nOTE som den isolerade ECM skiktet är typiskt mycket tunn i jämförelse med cellerna 11, så vård behövs vid identifiering ECM under avbildning. För effektiv extraktion av den isolerade ECM i SDS-PAGE-provbuffert, är det väsentligt att provbufferten innehåller ett reduktionsmedel. För det mest effektiva borttagandet av ECM, måste kokning-hot-provbuffert användas. För experiment där ECM prover kommer att lösas genom SDS-PAGE-elektrofores för proteinfärgning eller proteomik, är det viktigt att uppnå en koncentrerad prov genom att skrapa flera plåtar-värde av ECM i samma portion av provbuffert.
Ändringar och felsökning
Produktion och sekretion av ECM-proteiner kan variera avsevärt mellan celltyper, så tidsperioder för sekretion och deponering av ECM bör bestämmas de novo för varje celltyp. Det är också viktigt att vara medveten om att ECM sammansättning kommer att förändras dynamiskt i förhållande to celltäthet och tid i odling 18. Denna faktor bör beaktas vid utformningen av experiment. Det är uppenbart att valet av en celltyp för denna metod viktigt, särskilt vid extrahering ECM för analys med masspektrometri, vilket kan kräva en avsevärd mängd av den totala ECM protein.
Begränsningar av tekniken
Celler som utsöndrar mycket låga nivåer av ECM-proteiner kommer att vara mer utmanande för användning med denna metod. Icke vidhäftande celler, 3D cellkulturer eller cellinvasionsanalyser är olämpliga för närvarande för ECM isolering genom denna metod. Metoden är mest lämpad för användning med standard "två-dimensionella" cellkulturer. Eftersom ammoniumhydroxid extraktion avlägsnar cellerna helt, ECM som är förknippade med de övre sidorna av cellerna och som utsöndras, men icke-tvärbunden, är ECM-proteiner också tas bort, varvid på skålen ett tunt skikt av sammansatt ECM underifrån och omkring baserna av cellerna 11,17
Betydelsen av tekniken med avseende på befintliga / alternativa metoder
Förmågan att genomföra en mängd olika experiment med isolerade ECM är viktigt i samband med cellbiologi och vävnadsfysiologi, och den har också implikationer för områdena vävnadsregenerering och vävnadsteknik. Metoden har fördelar jämfört med geler bildade av renade kollagener eller andra renat ECM-proteiner i att cellerna sammankoppla komplexa ECM strukturer på sin nativa storlek, med nativa tvärbindningsmekanismer och med enskilda ECM proteiner närvarande i förhållanden som är lämpliga för celltypen av ursprung. Till exempel, den proteomic studien av RCS ECM visade riklig matrilins och COMP / TSP5, som förväntat fören brosk ECM 19,20 (Figur 4). I allmänhet är en analys av cell härledd ECM hindras av sin natur en omfattande, multi-proteinnätverk som resulterar i kovalent tvärbindning och olöslighet av många ECM-proteiner, och även av den potentiella förorening av ECM extrakt med intracellulära proteiner. Ett flerstegsförfarande utformat för att isolera ECM fraktionen från vävnader för proteomik analys gav 8% av ECM-proteiner i den totala uppsättningen av proteiner som identifierats 21. Men peptider från ECM-proteiner var 73% av det totala antalet peptider som identifierats. Denna metod för isolering och analys av cell härledd ECM snabbt och tillförlitligt avlägsnar cellulärt material samtidigt som de behåller ECM-proteiner. Denna metod kan användas för en rad olika celltyper och efterföljande tillämpningar och underlättar analysen av ECM biologi och cell-ECM-interaktioner i cellkultur. Våra protokoll detalj hur metoden kan tillämpas i olika skalor för att hantera ett brett spektrum av experimental frågor när det gäller ECM organisation, dynamik, eller komposition, och de funktionella effekterna av isolerade ECM på celler.
Framtida tillämpningar eller riktningar efter behärska denna teknik
Om man ser framåt, kan metoden anpassas för användning med 3D-cellkulturer; Detta skulle utöka sin fysiologiska relevans. Decellulariserade naturliga vävnaden har stor potential som en byggnadsställning för regenerering av förlorad eller skadad vävnad och som ett alternativ till transplantation, till exempel efter hjärtsvikt 22. Den har potential att övervinna problemen med donator tillgänglighet och immunorejection. Framtida tillämpningar av den metod som beskrivs i denna rapport kan undersöka dess användning med 3D-cellkulturer eller vävnad decellularisering, vilket ytterligare skulle öka omfattningen av denna strategi.
Acknowledgments
Vi är mycket tacksamma till Dr Belinda Willard, proteomik och metabolomik Laboratory, Lerner Research Institute, Cleveland Clinic, för att genomföra proteomik analys av RCS ECM. Vi erkänner ekonomiskt stöd från theMedical Research Council i Storbritannien, bevilja nummer K018043 till JCA.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibody to COL1A1 | Novus | NB600-408 | Rabbit polyclonal. Reacts with other fibrillar collagens as well as collagen I. IF: 1/200 |
| Antibody to fibronectin | Sigma | F3648 | Rabbit polyclonal. WB: 1/600 for 1.5 h. IF: 1/200 |
| Antibody to thrombospondin 1 | ThermoFisher | MA5-13398 | Mouse monoclonal clone A6.1. WB: 1/150 for 1.5 h |
| Antibody to RFP | Abcam | ab62341 | Rabbit polyclonal. WB: 1/2,000 for 2 h |
| Antibody to β-actin | Sigma | A1978 | Mouse monoclonal clone AC-15. WB: 1/10,000 for 1.5 h |
| Antibody to α-tubulin | Sigma | T9026 | Mouse monoclonal clone DM1A. WB: 1/5,000 for 1.5 h |
| Cell Tracker Green | ThermoFisher | C2925 | Fluorescent cell marker. Use at 1 µM for 30 min |
| Fluorescein isothiocyanate (FITC)-Phalloidin | Sigma | P-5282 | Stock = 50 mg/mL in DMSO. 1/50 for 45 min |
| FITC-conjugated goat anti-mouse IgG | Sigma | F8771 | IF: 1/50 for 1 h |
| FITC-conjugated sheep anti-rabbit IgG | SIgma | F7512 | IF: 1/50 for 1 h |
| Horseradish peroxidase (HRP)-conjugated goat anti-mouse IgG | LI-COR | 926-80010 | WB: 1/50,000 for 1 h |
| HRP-conjugated goat anti-rabbit IgG | LI-COR | 926-80011 | WB: 1/100,000 for 1 h |
| Vectorshield mounting medium with DAPI | Vector | H-1200 | Store at 4 °C in the dark |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium | Sigma | D6429 | Warm before use |
| Fibroblast growth medium | PromoCell | C-23010 | Warm before use, supplement with 50 µg/mL ascorbic acid |
| Phenol red-free DMEM | ThermoFisher | 21063-029 | Warm before use |
| Trypsin-EDTA solution | Sigma | T3924 | Warm before use |
| Gridded glass-bottomed dish | MatTek | P35G-2-14-C-GRID | |
| NH4OH, 28-30% solution | Sigma | 221228 | Dilute to 20 mM in de-ionised water. Once opened store in the dark, tightly capped. |
| Paraformaldehyde, 16% solution | Alfa Aesar | 43368 | Dilute to 2% (v/v) in PBS |
| Deoxycholic acid | Sigma | D2510 | Use at 2% (v/v) final concentration |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | Dilute to 0.5% (v/v) final concentration |
| GelCode Blue stain reagent | ThermoFisher | 24590 | Protein stain for SDS-PAGE gels |
| Precision Plus protein standards | Biorad | 161-0374 | Protein standards for SDS-PAGE gels |
| Trans-Blot SD Semi Dry transfer cell | Biorad | 1703940 | Efficient transfer of high molecular weight proteins |
| PVDF transfer membrane | Millipore | ISEQ00010 | Immobilon-PSQ |
| Ponceau S stain | Sigma | P7170 | Reversible protein stain for PVDF membrane |
| WesternSure Enhanced chemiluminescence (ECL) substrate | LI-COR | 926-80200 | |
| High performance chemiluminescence film | GE Healthcare | 28906837 | |
| Sterile filtration unit, MILLEX-GV | Millipore | ML481051 | |
| SP8 AOBS confocal laser scanning microscope | Leica | Environmental chamber needed for temperature and CO2 control (Life Imaging Services) | |
| Key: IF, Immunofluorescence; WB, Western Blot | |||
References
- Bonnans, C., Chou, J., Werb, Z. Remodelling the extracellular matrix in development and disease. Nat Rev Mol Cell Biol. 15, 786-801 (2014).
- Hynes, R. O., Naba, A. Overview of the matrisome--an inventory of extracellular matrix constituents and functions. Cold Spring Harb Perspect Biol. 4, a004903 (2012).
- Gross, J., Highberger, J. H., Schmitt, F. O. Extraction of Collagen from Connective Tissue by Neutral Salt Solutions. Proc Natl Acad Sci U S A. 41, 1-7 (1955).
- Hellewell, A. L., Adams, J. C. Insider trading: Extracellular matrix proteins and their non-canonical intracellular roles. Bioessays. 38, 77-88 (2016).
- Li, D., Yang, W., Li, G. Y. Extraction of native collagen from limed bovine split wastes through improved pretreatment methods. Journal of Chemical Technology and Biotechnology. 83, 1041-1048 (2008).
- Strawich, E., Nimni, M. E. Properties of a collagen molecule containing three identical components extracted from bovine articular cartilage. Biochemistry. 10, 3905-3911 (1971).
- Kim, B. S., et al. Human collagen isolated from adipose tissue. Biotechnol Prog. 28, 973-980 (2012).
- Barallobre-Barreiro, J., Didangelos, A., Yin, X., Domenech, N., Mayr, M. A sequential extraction methodology for cardiac extracellular matrix prior to proteomics analysis. Methods Mol Biol. 1005, 215-223 (2013).
- Carter, W. G. Transformation-dependent alterations is glycoproteins of extracellular matrix of human fibroblasts. Characterization of GP250 and the collagen-like GP140. J Biol Chem. 257, 13805-13815 (1982).
- Sechler, J. L., Takada, Y., Schwarzbauer, J. E. Altered rate of fibronectin matrix assembly by deletion of the first type III repeats. J Cell Biol. 134, 573-583 (1996).
- Adams, J. C., Bentley, A. A., Kvansakul, M., Hatherley, D., Hohenester, E. Extracellular matrix retention of thrombospondin 1 is controlled by its conserved C-terminal region. J Cell Sci. 121, 784-795 (2008).
- Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227, 680-685 (1970).
- Hillenkamp, F., Karas, M. Mass spectrometry of peptides and proteins by matrix-assisted ultraviolet laser desorption/ionization. Methods Enzymol. 193, 280-295 (1990).
- Davis, M. T., et al. Automated LC-LC-MS-MS platform using binary ion-exchange and gradient reversed-phase chromatography for improved proteomic analyses. J Chromatogr B Biomed Sci Appl. 752, 281-291 (2001).
- Burnette, W. N. "Western blotting": electrophoretic transfer of proteins from sodium dodecyl sulfate--polyacrylamide gels to unmodified nitrocellulose and radiographic detection with antibody and radioiodinated protein A. Anal Biochem. 112, 195-203 (1981).
- Soucy, P. A., Werbin, J., Heinz, W., Hoh, J. H., Romer, L. H. Microelastic properties of lung cell-derived extracellular matrix. Acta Biomater. 7, 96-105 (2011).
- Hellewell, A. L., Gong, X., Scharich, K., Christofidou, E. D., Adams, J. C. Modulation of the extracellular matrix patterning of thrombospondins by actin dynamics and thrombospondin oligomer state. Biosci Rep. 35, (2015).
- Mumby, S. M., Abbott-Brown, D., Raugi, G. J., Bornstein, P. Regulation of thrombospondin secretion by cells in culture. J Cell Physiol. 120, 280-288 (1984).
- Myllyharju, J. Extracellular matrix and developing growth plate. Curr Osteoporos Rep. 12, 439-445 (2014).
- Roughley, P. J. Articular cartilage and changes in arthritis: noncollagenous proteins and proteoglycans in the extracellular matrix of cartilage. Arthritis Res. 3, 342-347 (2001).
- Naba, A., et al. The matrisome: in silico definition and in vivo characterization by proteomics of normal and tumor extracellular matrices. Mol Cell Proteomics. 11, M111 014647 (2012).
- Sanchez, P. L., et al. Acellular human heart matrix: A critical step toward whole heart grafts. Biomaterials. 61, 279-289 (2015).
