Introduction
Nel corso degli ultimi decenni, la matrice extracellulare (ECM) è stato riconosciuto come un ambiente vario, dinamico e complesso che è coinvolto in più processi delle cellule-fisiologici e patologici. A livello dei tessuti, l'ECM influenza segnalazione cellulare, la motilità, la differenziazione, l'angiogenesi, biologia delle cellule staminali, tumorigenesi, la fibrosi, ecc 1,2. Lo studio dell'organizzazione ECM e dei processi ECM-dipendente ha quindi ampie implicazioni per la biologia cellulare e fisiologia dei tessuti. Per raggiungere una comprensione meccanicistica della composizione ECM, organizzazione, e le proprietà funzionali, sono necessari metodi per l'isolamento accurata di ECM. Considerando che la prima identificazione di proteine ECM invocate isolamento da tessuti 3, la preparazione di ECM dalle cellule in coltura è diventato più prevalente.
L'isolamento e l'analisi di ECM derivato dalle cellule è complicato per due motivi principali. In primo luogo, la presenza di cellule eir abbondanti proteine intracellulari possono rendere difficile isolare l'ECM come struttura extracellulare discreta. Infatti, alcune proteine ECM hanno ruoli all'interno della cellula e nella ECM 4; Pertanto, la rimozione efficiente delle proteine intracellulari da ECM derivato dalle cellule è vitale se lo studio delle proteine all'interno della ECM è non confondere con i loro ruoli all'interno della cellula. In secondo luogo, ECM derivato dalle cellule è composto di molte grandi, proteine oligomeriche, spesso covalentemente reticolata upon ECM montaggio e sono quindi insolubile in detergenti standard. Queste proprietà possono complicare l'estrazione e l'ulteriore analisi della ECM. Per affrontare questi problemi, un metodo è necessario che consente la separazione efficiente di proteine ECM da componenti cellulari.
Diversi metodi sono stati descritti in letteratura per l'isolamento di ECM sia da colture cellulari o estratti di tessuto. Molti di questi metodi sono finalizzate alla estrazione del abbondante pr ECMotein, collagene, da tessuti e comprendono l'uso di sali neutri 3, condizioni acide 5,6 o pepsina 7. Isolamento di ECM totale da estratti di tessuto spesso comporta decellularization del tessuto prima all'isolamento della ECM. Ad esempio, un metodo di estrazione sequenziale è stato descritto che isola ECM dal tessuto cardiaco umano 8. Innanzitutto, proteine ECM vagamente-legati sono stati estratti con 0,5 M NaCl prima sodio dodecil solfato (SDS) è stato utilizzato per rimuovere le cellule. Infine, le proteine ECM rimanenti sono stati estratti utilizzando 4 M guanidina 8. ECM può anche essere solubilizzato da campioni decellularized utilizzando 8 M urea 9. Altre tecniche utilizzano detergenti, come l'acido desossicolico 10, per estrarre entrambe le celle e ECM prima di separare proteine ECM insolubili dal lisato cellulare solubile per centrifugazione.
Il metodo per l'isolamento e l'analisi di ECM derivato dalle cellule descritto in questo rapporto fornisce una ReproMetodo riducibile per rimuovere il materiale cellulare, lasciando ECM derivato dalle cellule che può essere analizzato in situ immunofluorescenza o estratto per ulteriori analisi biochimica. Questo metodo può essere adattato per qualsiasi tipo di cellula aderente e può essere scalata per procedure valle, come immunoblotting o spettrometria di massa, o per utilizzazione ECM isolato in studi funzionali. Il metodo può essere utilizzato anche in combinazione con la microscopia confocale di cellule vive per monitorare la deposizione ECM di una proteina codificata di interesse in tempo reale. Questo risultato è ottenuto attraverso l'uso di un piatto di vetro a fondo reticolata. Nel complesso, l'approccio fornisce un isolamento accurata di ECM derivato dalle cellule e anche lo scopo di identificare e monitorare la deposizione e la dinamica delle singole proteine ECM.
Protocol
1. rimozione delle cellule con idrossido di ammonio Soluzione
- Preparare cellule aderenti placcando alla densità adeguata.
NOTA: Le cellule possono essere qualsiasi tipo di cellula che produce aderenti ECM sufficiente per l'analisi. Qui, descriviamo l'uso di cellule COS-7, una linea cellulare africano scimmia verde reni fibroblasti-like che contiene SV-40 sequenze di DNA virale; RCS, una linea di cellule di ratto condrosarcomi; o normale cutanea umana fibroblasti (HDF) ceppi dal prepuzio giovanile. HDF sono utilizzati dal passaggio 1 al passaggio 8 solo.- Piastra le cellule su vetrini per l'imaging cellule vive e ECM, per gli studi di microscopia a fluorescenza di ECM fisso, o per la preparazione di ECM derivato dalle cellule per test funzionali su piccola scala. Piastra le cellule su piatti di coltura di cellule per l'analisi SDS-PAGE, immunoblot, o gli studi di proteomica.
NOTA: Le condizioni di coltura cellulare (numero di cellule per piastra e mezzo di coltura) dipenderà dal tipo di cellula. Il numero di cellule di targa sarà necessarioessere stabilito empiricamente per la particolare linea cellulare o ceppo cellulare. - Dopo un tempo adatto per le celle di depositare ECM, tipicamente> 16 h. NOTA: Il periodo di tempo dipende dal tipo di cellula e dovrà essere determinati empiricamente. Se conduzione espressione ectopica, lasciare il tempo adeguato per l'espressione della proteina trasfettate di interesse e per la deposizione di ECM.
- Piastra le cellule su vetrini per l'imaging cellule vive e ECM, per gli studi di microscopia a fluorescenza di ECM fisso, o per la preparazione di ECM derivato dalle cellule per test funzionali su piccola scala. Piastra le cellule su piatti di coltura di cellule per l'analisi SDS-PAGE, immunoblot, o gli studi di proteomica.
- In un Cappa, Preparare 20 mM ammonio idrossido in un recipiente adatto, diluendo la soluzione della 1/14 con H deionizzata 2 O.
- Rimuovere le cellule dal termostato e rimuovere delicatamente terreno di coltura. Aggiungere tampone fosfato (PBS) senza Ca 2+ / Mg 2+ versando delicatamente contro le pareti del piatto. Oscillare la pietanza due volte e rimuovere il liquido con una pipetta di plastica trasferimento. Ripetere altre due volte.
- In una cappa aspirante, inclinare ogni piatto e rimuovere la PBS dal punto 1.2 con una pipetta di trasferimento di plastica. Aggiungere 3mL di idrossido di ammonio a piatto 100 mm e incubare a temperatura ambiente per 5 min. Durante il periodo di incubazione di 5 minuti, agitare delicatamente il piatto ogni min per assicurare la lisi di tutte le cellule. Passi 1,4-1,7 saranno anche effettuate nella cappa aspirante.
NOTA: la rimozione delle cellule Alternativa reagenti includono 2 M o 8 M urea, che vengono incubate con le cellule per 10 min. - Aggiungere abbondante deionizzata H 2 O per ogni piatto, almeno 20 ml per piatto 100 mm, con dondolo. Eliminare ammonio idrossido solubilizzato materiale che è composto di idrossido di ammonio, cellule lisate, e deionizzata H 2 O-per aspirazione con una pipetta di trasferimento. Trasferire questa soluzione rifiuti in un contenitore per rifiuti liquidi.
- Lavare il livello ECM insolubile in abbondante deionizzata H 2 O quattro volte per assicurare la rimozione completa di tutto il materiale idrossido di ammonio solubilizzato.
- Per l'esame della ECM mediante immunofluorescenza, fissare la ECM con l'aggiunta di 2%paraformaldeide (PFA, 3 mL per piatto 100 mm) a temperatura ambiente per 10 min.
Attenzione: PFA è molto pericoloso in caso di pelle o gli occhi e grave sovraesposizione può produrre danni ai polmoni, soffocamento, perdita di coscienza, o la morte. Si deve essere maneggiato solo in una cappa aspirante, e dispositivi di protezione individuale deve essere indossato. - Lavare ogni campione fisso due volte con PBS, come al punto 1.2, e smaltire la soluzione PFA in un contenitore adatto rifiuti liquidi. Se necessario, conservare i campioni ECM in PBS a 4 ° C prima di preparare per microscopia a fluorescenza.
2. Monitoraggio deposizione di una proteina ECM dal Microscopia confocale Imaging di cellule vive
- Contare le cellule con un emocitometro. Per COS-7 cellule, Piatto 250.000 cellule su un piatto di coltura cellulare di 60 mm per la trasfezione.
NOTA: Per l'imaging cellulare dal vivo, le cellule devono essere trasfettate con un vettore che codifica la proteina ECM di interesse, fusa nel telaio con una fluorescenza geneticamente codificatotag nt. Questo per consentire l'identificazione della proteina ECM di interesse durante l'imaging live-cell. - Dopo un tempo adatto per l'espressione della proteina (ad esempio, 16 h) rimuovere le cellule dal piatto con una soluzione di tripsina-EDTA, li contano in un emocitometro, e la piastra ~ 150.000 cellule su un piatto fondo di vetro da 35 mm con griglia per l'imaging. Consentire 2 h per le celle per ricollegare e cominciare deposizione di ECM (il periodo di tempo dipenderà dal tipo di cellula e deve essere stabilito empiricamente).
NOTA: Utilizzare un supporto cella che non contiene rosso fenolo, come questo può dare una sfumatura di rosso che colpisce la qualità delle immagini. - Durante il periodo di cui sopra 2 h, ha istituito un microscopio confocale con un C camera 37 ° incubatore e una fornitura di CO 2. Lasciare la temperatura nella camera e nel piatto si stabilizzi a 37 ° C prima di imaging; questo può richiedere fino a 1 ora.
- Incubare le cellule placcato sui 35 mm piatto a griglia con un marcatore fluorescente cella per 30 min. Quindi, lavare le celluledue volte in fenolo terreno di coltura aneritro prima di imaging.
NOTA: un marcatore fluorescente citoplasmatica può essere utilizzato per visualizzare i volumi di cella, o un marcatore membrana incorpora può essere utilizzato per visualizzare i bordi delle celle. - Utilizzando l'obiettivo 20X e contrasto di fase su un microscopio confocale, identificare un quadrato della griglia appropriato che contiene un numero (> 3) di aderenti, le cellule sane. Confermare l'espressione della proteina bersaglio di scelta nelle cellule all'interno del quadrato della griglia selezionato utilizzando gli obiettivi 63x o 100X e le lunghezze d'onda appropriate in microscopia a fluorescenza.
- Impostare fluorescenza e contrasto di fase time-lapse imaging utilizzando un software z-stack. Collocare la pila "Begin" per essere appena sotto lo strato di ECM e lo stack "End" per essere appena sopra il corpo cellulare. Impostare la dimensione z-step a 0,3 micron e z-volume tra 5 e 10 micron di profondità in totale, a seconda del tipo di cellula. Questo darà tra 15-30 z-sezioni per ogni punto del tempo.
- Capture di fluorescenza (per la proteina fluorescente rossa (RFP), di eccitazione = 555 nm ed emissione = 584 nm) e le immagini a contrasto di fase periodicamente nel corso di un periodo di tempo stabilito. Ad esempio, utilizzare il software di time-lapse per impostare l'intervallo di tempo a 2 minuti e la durata di 2 ore. Selezionare il pulsante "Start" per avviare la cattura di immagini z-sezione nel periodo di tempo definito.
- Alla fine del periodo di tempo, rimuovere le cellule dal piatto, come descritto nei passaggi 1,1-1,5, per confermare la localizzazione della proteina fluorescente-tag di interesse nella ECM.
- Utilizzare l'imaging a contrasto di fase e l'obiettivo 20X per riposizionare il quadrato della griglia di riferimento.
- Passare l'obiettivo 63X e identificare lo strato di ECM in microscopia a fluorescenza. Confrontare questa immagine per l'immagine pre-estrazione
3. Preparazione sterile di ECM Cell-derivati per Cell test funzionali
- Crescere una popolazione di cellule (le cellule "produttore matrice") su vetrini e un'altra popolamento (le cellule "test") nella cultura di serie in un piatto di coltura cellulare 100 mm per almeno 24 ore.
NOTA: Questi possono essere tutti i due diversi tipi di cellule aderenti, e il disegno sperimentale possono includere trasfezione delle popolazioni uno o entrambi i cellulari per esprimere una proteina ECM fluorescenti-taggato. - In una cappa a flusso laminare, come quello usato per la coltura cellulare, preparare soluzioni sterili di PBS senza Ca 2 + / Mg2 +, 20 mM ammonio idrossido (vedi punto 1.3), e deionizzata H 2 O passando ognuna una sterile 0,2 Filtro micron in un contenitore sterile adeguato.
- Il mantenimento di una tecnica sterile, lavare delicatamente le cellule "produttori matrice" su vetrini tre volte con PBS sterile (vedi punto 1.2).
- Rimuovere il PBS mediante aspirazione con una pipetta sterile e disporlo in un adatto contenitore di rifiuti liquidi. Aggiungere 20 mM ammonio idrossido sterile (3 mL / 100 mm piatto) e incubare per 5 min a dondolo a intervalli.
- Aggiungere copiosa quantitàsterile deionizzata H 2 O al piatto "produttore matrice", di almeno 20 ml per piatto 100 mm con dondolo, e versare via il lisato cellulare in un contenitore di rifiuti idoneo.
- Ripetere passaggio 3.5 altre quattro volte per assicurare la completa rimozione del materiale idrossido di ammonio-solubilizzato.
NOTA: L'ECM depositati dalle cellule "produttore" a matrice i coprioggetti fornisce quindi un ECM sterile per test funzionali con le cellule di prova di interesse. - Incubare le cellule test dal cellulare stock piatto con 1,5 mL di soluzione di tripsina-EDTA a piatto 100 mm (0,05% w / v tripsina e 0,02% w / v EDTA in soluzione salina bilanciata di Hank) finché le celle di prova sono staccati dal piatto . Aggiungere mezzo cellulare, centrifugare le celle di prova a 400 xg per 5 minuti, e rimuovere il liquido surnatante.
- Risospendere le cellule di prova in acqua dolce, mezzo sterile e contare in un emocitometro. Placcare un numero adeguato di queste celle di prova sul sterili, ECM isolato su coverslips. li Culture nel mezzo cella appropriata per 2-3 h, o per il periodo di tempo richiesto per il disegno sperimentale.
- Per esaminare l'organizzazione del citoscheletro, fissare le celle di prova nel 2% PFA e macchiare con isotiocianato di fluoresceina (FITC) -phalloidin (eccitazione = 490 nm ed emissione = 525 nm) per la visualizzazione di F-actina e con 4 ', 6 -diamidino-2-phenylindole (DAPI; eccitazione = 358 nm ed emissione = 461 nm) di visualizzare i nuclei 11.
NOTA: Confrontare la morfologia e l'organizzazione actina in cellule di prova placcato su eterologa ECM derivato dalle cellule con celle di prova placcato in proprio ECM.
4. L'isolamento di ECM per SDS-PAGE, analisi immunoblot, o Proteomica
- Crescere cellule aderenti di interesse sui piatti di coltura cellulare 100 mm (da 5 a 10 piatti per la proteomica o 1-2 piatti per immunoblotting) per 24-96 ore, a seconda del tipo di cellula, per consentire la secrezione e la deposizione di ECM.
- Rimuovere le cellule come described in passi 1,1-1,5.
- Tilt ciascuna piastra ad angolo per drenare residua H 2 O al fondo del piatto, e rimuovere eventuale residuo H 2 O con una pipetta p200 finché la piastra è completamente asciutta.
- In parallelo, il calore tampone campione SDS-PAGE contenente 100 mM ditiotreitolo (DTT) a 95 ° C per 2 minuti utilizzando un blocco di calore, e quindi aggiungere alla piastra. 200 ml di tampone per piastra 100 millimetri è appropriato per i campioni da esaminare da immunoblot.
- Per analizzare ECM mediante spettrometria di massa, ottenere un campione più concentrato raccogliendo il tampone campione SDS-PAGE dal piatto (come descritto ai punti 4.5 e 4.6, sotto), ri-riscaldamento a 95 ° C, e usando la stessa aliquota di tutti 2-3 piastre aggiuntive.
- Utilizzare un raschietto cellulare per raschiare a fondo la ECM fuori dal piatto, in modo che tutte le aree del piatto sono stati raschiati.
- Con il raschietto cellulare, raccogliere il campione ad un lato del piatto e rimuoverlo con un 200microlitri punta della pipetta in una provetta.
- Trasferire qualsiasi residuo SDS-PAGE tampone campione estratto dalla punta raschietto cellulare nel tubo per minimizzare la perdita di materiale ECM. Per un campione concentrato, ri-riscaldare la stessa SDS-PAGE tampone campione un'aliquota di 95 ° C e ri-utilizzarlo in tutto 2-3 piastre supplementari.
- Risolvere le proteine ECM per SDS-PAGE 12, utilizzando il 7% o 4-7% gel gradiente di poliacrilamide.
NOTA: E 'comodo da usare marcatori proteici pre-colorato. - Per aumentare la risoluzione delle proteine ECM alto peso molecolare, prolungare il tempo di gelificazione di funzionamento tali che il marcatore di peso molecolare 37 kDa corre vicino al fondo del gel e marcatori di peso molecolare <37 kDa hanno eseguito il gel.
- Per l'analisi proteomica delle proteine ECM, macchiare il gel con una macchia di proteine e catturare un'immagine. Tagliare le bande di interesse dal gel, li digerire con tripsina, e analizzarle da matrix-assisted laser desorbimento / ionizzazione (MALDI) spettrometria -Mass <sup> 13.
- In alternativa, per un'analisi più completa dell'estratto ECM e di analizzare l'intero campione, affettare la corsia di gel in sezioni, li digerire con tripsina, ed eseguire spettrometria di cromatografia-massa liquida (LC-MS) 14.
- In alternativa, per immunoblotting 15, trasferire proteine dal gel SDS-PAGE su fluoruro di membrana di polivinilidene (PVDF) a 15 V per almeno 1 h 10 min (metodo semi-secco) per assicurare il trasferimento delle proteine ECM alto peso molecolare . Visualizzare la proteina totale trasferito alla membrana con una macchia Ponceau S.
- Seguendo passo 4.11, utilizzare gli anticorpi per stabilire la presenza e / o fare un'analisi semi-quantitativa delle singole proteine ECM 15.
- Bloccare la membrana con 2% (w / v) di latte in TBS-Tween 20 (tampone bloccante) notte a 4 ° C. Diluire anticorpi specifici per proteine ECM in tampone di bloccaggio e incubare con la membrana per 1,5 ore a temperatura ambiente (anticorpi fibronectin diluito 1/600 e anticorpi per trombospondina-1 diluito 1/150; Tabella supplementare 1).
- Testare la qualità dell'isolamento ECM da ri-probing stesso blot con anticorpi abbondanti proteine intracellulari, come actina o tubulina (anti-actina diluito 1 / 10.000 e anti-tubulina diluito 1 / 5.000).
Representative Results
Il protocollo descritto ai punti 1.1-1.5 atti a rimuovere le cellule e lasciarsi alle spalle la ECM derivato dalle cellule. Il protocollo è stato effettuato su COS-7 cellule cresciute per 96 h su vetrini e l'ECM derivato dalle cellule è stata analizzata mediante microscopia a fluorescenza. Il trattamento con idrossido di ammonio rimosso le cellule efficace, come stabilito dalla perdita dei nuclei cellulari e citoscheletro actina, secondo DAPI e colorazione phalloidin rispettivamente (Figura 1). L'estrazione di cellule con 2 M urea non era efficace come idrossido di ammonio; tracce di DAPI e falloidina colorazione sono stati rilevati dopo il trattamento. 8 M urea ha avuto un effetto simile a idrossido di ammonio (Figura 1). Successivamente, ECM derivato dalle cellule è stato visualizzato prima e dopo il trattamento con idrossido di ammonio (passaggi 2,1-2,11). COS-7 cellule sono state trasfettate con un monomerica proteina fluorescente rossa (MRFP) -tagged trimero trombospondina-1 C-terminale, (mRFPovTSP1C) 11 e coltivate su un piastra da 35 mm, con una base di vetro reticolata.
Due ore dopo la placcatura, un adeguato quadrati griglia che contenevano più cellule sane che esprimono mRFPovTSP1C è stata visualizzata al microscopio confocale. Un contrasto di fase immagine di riferimento è stato preso di questa zona, e quindi imaging di fluorescenza time-lapse è stata effettuata ogni 1 min per 2 ore (Figura 2A). Le cellule sono state poi rimosse con idrossido di ammonio, e la stessa piazza griglia sul piatto è stata trasferita sotto contrasto di fase e poi ri-analizzati mediante microscopia a fluorescenza. Le cellule non erano più presenti in piazza della griglia, ma mRFPovTSP1C rimasti all'interno della ECM, rilevato da microscopia a fluorescenza come caratteristica puncta (Figura 2A). Qualsiasi mRFPovTSP1C depositato nella ECM prima della rimozione delle cellule è stato identificato confrontando il pre modello di fluorescenza e post-rimozione delle cellule. Il puncta fluorescente identificato in entrambe le immagini (Figure 2A, ad esempio freccia) sono dedotto di essere associati con la ECM.
trattamento con idrossido di ammonio è stato poi utilizzato per isolare ECM nativo coltivate, cellule aderenti. fibroblasti dermici umani (HDF) sono state coltivate su vetrini per 96 h. Le cellule sono state rimosse con idrossido di ammonio, e l'ECM è stato sondato con un anticorpo anti-I collagene, che ha dimostrato una caratteristica fibrillare e reticolo Colorazione 16 (Figura 2B). Fibronectina patterning è stata esaminata, non permeabilizzate cellule intorno fisse ratto condrosarcoma (RCS) e all'interno della ECM dopo la rimozione delle cellule RCS (Figura 2C). L'isolamento di idrossido di ammonio di ECM è stata effettuata anche in condizioni sterili in modo che le cellule "test" potrebbero essere ri-placcato sul ECM per fenotipiche o studi funzionali. Ad esempio, "test" COS-7 cellule sono state piastrate per 2 ore su ECM sterile prodotta dalle cellule RCS e tgallina erano fissati, permeabilizzate, e analizzati per l'organizzazione F-actina by FITC-falloidina colorazione, in confronto al COS-7 cellule che producono il proprio ECM (passi 3,1-3,9) (Figura 3).
Su scala più ampia, il metodo è stato usato per isolare ECM per biochimici. Ad esempio, le cellule sono state coltivate su RCS due piatti di coltura cellulare 100 mm per 7 giorni, e sono state seguite le procedure nei passaggi 4.1-4.7. Le proteine della ECM derivato dalle cellule sono stati raccolti da raschiando in tampone campione SDS-PAGE caldo e sono state separate mediante SDS-PAGE su un gel di poliacrilammide 7% in condizioni riducenti. Il gel è stato colorato per le proteine, e le quattro bande principali sono stati ciascun isolato ed analizzato mediante spettrometria di massa (Figura 4A). Un certo numero di proteine ECM, compresa la fibronectina, trombospondina 1 (TSP1), thrombospondin 5 / cartilaginea oligomerica matrice proteina (TSP5 / COMP), e matrilin-1 sono stati identificati (Figura 4B).
In alternativa, i preparati su scala ridotta di ECM possono essere valutati da immunoblot. Ad esempio, cellule derivate ECM dalle cellule COS-7 che esprimono ectopicamente mRFPovTSP1C è stato separato per SDS-PAGE, trasferiti su una membrana PVDF e rilevazione per RFP con un anticorpo anti-RFP (Figura 4C). Questa tecnica è abbastanza sensibile da rilevare le differenze di deposizione tra un trimero nativo di TSP1 (mRFPovTSP1C) ed un pentamero Engineered della regione TSP1 C-terminale (MRFP-TSP-5-1C) 17 (Figura 4C). Per studiare l'ECM endogena di HDF, la presenza di proteine specifiche in lisato cellulare o la ECM isolato è stata esaminata mediante immunoblotting. La caratteristica proteine ECM fibronectina e trombospondina-1 sono stati rilevati nel ECM, mentre le abbondanti proteine intracellulari α-tubulina e β-actina erano assenti dalla ECM isolato (Figura 4D).
Figura 1: Confronto di metodi di rimozione delle cellule. COS-7 cellule sono state coltivate ad alta densità per 96 h su vetrini, fissati in 2% PFA e permeabilizzate in 0.5% Triton X100, o sono state trattate come indicato per la rimozione delle cellule. Vetrini sono stati poi colorati con FITC-falloidina di visualizzare F-actina e DAPI di visualizzare i nuclei. Barra di scala = 25 micron. Questa cifra viene modificato da una pubblicazione originale nel Journal of Cell Science 11. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Identificazione della ECM proteine nella regolazione isolata ECM. (A) le immagini a contrasto di fase e fluorescenza diCOS-7 cellule che esprimono mRFPovTSP1C e coltivate su un piatto 35 millimetri con una base a griglia con fondo trasparente per 2 ore. Immagini sono mostrati prima e dopo la rimozione delle cellule da idrossido di ammonio. Il bordo della lettera griglia viene indicato nelle immagini a contrasto di fase con una linea tratteggiata. frecce bianche indicano esempi di puncta fluorescente che erano presenti prima e dopo la rimozione delle cellule. (B) Individuazione di collagene I in HDF ECM mediante immunofluorescenza indiretta. HDF sono state coltivate per 96 h e rimosso con idrossido di ammonio, e la ECM era macchiato di I. collagene fibrillare umano L'ECM era macchiato con l'anticorpo secondario anti-coniglio coniugato con FITC solo. (C) La localizzazione della fibronectina intorno alle cellule RCS o all'interno isolato RCS ECM, come rilevato mediante immunofluorescenza indiretta. cellule RCS sono state coltivate per 48 ore, fissate in 2% PFA, e colorate per fibronectina e con DAPI. In piatti paralleli, le cellule sono state rimosse con 20 mm di idrossido di ammonio e l'ECM era macchiato per FIBRonectin e con DAPI. Le cellule sono state anche colorate con anticorpi anti-IgG di topo coniugato con FITC alone. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3: l'uso di sterile ECM per studi funzionali. RCS "produttori matrice" cellule sono state coltivate per 48 h su vetrini e poi trattati con idrossido di ammonio 20 mM in condizioni sterili per rimuovere le cellule. COS-7 cellule "test" sono stati piastrati su vetrini con o senza isolata RCS ECM per 2 h, fissato 2% PFA, permeabilizzate in 0,5% Triton X100, e colorati con FITC-falloidina visualizzare F-actina e DAPI visualizzare nuclei . COS-7 cellule placcato su RCS ECM diffondere più ampiamente e formano grandi fasci di microfilamenti (esempio freccia) e Ruff bordoles. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Identificazione di proteine da isolato ECM mediante SDS-PAGE, spettrometria di massa, o immunoblotting. (A), le cellule sono state coltivate RCS per 7 giorni e rimossi con idrossido di ammonio 20 mm; l'ECM è stato raschiato fino in tampone campione caldo SDS-PAGE contenente 100 mM DTT. La preparazione ECM è stato separato mediante SDS-PAGE su un gel di poliacrilammide 7% in condizioni riducenti. Quattro bande significative (frecce 1-4) sono stati identificati mediante colorazione delle proteine. (B) Le proteine da RCS bande ECM 1-4 sono stati identificati mediante spettrometria di massa MALDI. (C) COS-7 cellule che esprimono sia mRFPovTSP1C (trimero) o MRFP-TSP-5-1C (pentamero) sono state coltivate per 48h e rimosso con 20 mM idrossido di ammonio, e l'era ECM isolati in tampone campione caldo SDS-PAGE contenente 100 mM DTT. La preparazione ECM è stato separato mediante SDS-PAGE su un gel di poliacrilammide 7% in condizioni riducenti, trasferiti su una membrana PVDF, e sondato con un anticorpo anti-RFP. Questo pannello viene modificato da una pubblicazione originale in Bioscience Reports 17. (D) HDF sono state coltivate per 96 ore e poi trattato sia con acido desossicolico 2% in PBS (lisato cellulare) o con idrossido di ammonio 20 mM per rimuovere le cellule. L'ECM è stato raschiato in tampone campione SDS-PAGE caldo. Le due frazioni sono state separate mediante SDS-PAGE su un gel di poliacrilammide 10% in condizioni riducenti, trasferiti su una membrana PVDF, e sondato con anticorpi, come indicato. In ogni pannello, le posizioni dei marcatori di peso molecolare sono indicati in kDa. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa fifigura.
Discussion
I passaggi critici all'interno del protocollo
Il metodo ha alcuni passaggi critici che devono essere seguite per garantire l'isolamento di successo e l'analisi di ECM. Ad esempio, idrossido di ammonio è utilizzato per rimuovere le cellule e per isolare ECM per l'analisi. Sebbene idrossido di ammonio è stabile in soluzione acquosa al buio e può essere conservato a temperatura ambiente, le bottiglie devono essere accuratamente richiusi tra ogni uso. Dato che il gas può evaporare dalla soluzione, riducendo così la concentrazione, si consiglia vivamente di iniziare una nuova bottiglia ogni 6-8 settimane. Inoltre, la soluzione di lavoro dovrebbe essere fresco per ogni esperimento. È anche essenziale che le cellule sono completamente rimossi con abbondante lavaggi in acqua deionizzata. Se queste operazioni non vengono eseguite in modo adeguato, materiale cellulare può rimanere sul piatto e contaminare le analisi a valle. Se le cellule sono state coltivate per 10 giorni o più, possono essere necessari ulteriori lavaggi con acqua. È importante nota che lo strato ECM isolata è tipicamente molto sottile rispetto alle celle 11, quindi è necessario porre attenzione quando si identifica il ECM durante l'imaging. Per l'estrazione efficace della ECM isolato in tampone campione SDS-PAGE, è essenziale che il buffer campione contiene un agente riducente. Per la rimozione più efficace della ECM, bollente tampone campione deve essere utilizzato. Per gli esperimenti in cui i campioni ECM saranno risolti mediante SDS-PAGE elettroforesi per la colorazione delle proteine o di proteomica, è fondamentale per ottenere un campione concentrato raschiando diversi piatti-vale la pena di ECM nella stessa aliquota di tampone campione.
Modifiche e risoluzione dei problemi
La produzione e la secrezione di proteine ECM possono variare significativamente tra i tipi di cellule, così periodi di tempo per la secrezione e la deposizione di ECM dovrebbero essere determinati de novo per ogni tipo di cellula. E 'anche importante notare che la composizione ECM cambierà dinamicamente in relazione to densità delle cellule e del tempo nella cultura 18. Questo fattore deve essere preso in considerazione durante la progettazione di esperimenti. Chiaramente, la selezione di un tipo di cellula per questo metodo è importante, soprattutto quando si estraggono ECM per l'analisi mediante spettrometria di massa, che può richiedere una notevole quantità di proteine totali ECM.
LIMITI DELLA TECNICA
Le cellule che secernono livelli molto bassi di proteine ECM saranno più impegnativo per l'uso con questo metodo. le cellule non aderenti, colture cellulari in 3D, o test di invasione delle cellule non sono adatti al momento per l'isolamento ECM con questo metodo. Il metodo è più adatto per l'uso con colture cellulari "2 dimensioni" standard. Poiché l'estrazione idrossido di ammonio rimuove le cellule completamente, ECM associato con i lati superiori delle cellule e secreto, ma non reticolato, proteine ECM vengono rimossi, lasciando sul piatto un sottile strato di ECM assemblato da sotto e intorno alle basi delle cellule 11,17
Importanza della tecnica con rispetto agli attuali metodi alternativi /
La possibilità di effettuare una vasta gamma di esperimenti con ECM isolato è importante nel contesto della biologia cellulare e fisiologia dei tessuti, e ha anche implicazioni per i campi di rigenerazione dei tessuti e ingegneria tissutale. Il metodo presenta vantaggi rispetto gel formate da collagene purificate o altre proteine purificate ECM in quanto le cellule assemblare strutture ECM complesse nelle loro dimensioni nativa, con meccanismi di reticolazione nativi e con singole proteine ECM presenti in rapporti adeguati al tipo di cellula di origine. Per esempio, lo studio proteomica di RCS ECM dimostrato matrilins abbondanti e COMP / TSP5, come previsto perun ECM cartilagineo 19,20 (figura 4). In generale, l'analisi della ECM derivato dalle cellule è ostacolata dalla sua natura una vasta rete, multi-proteina che si traduce in covalente reticolazione e l'insolubilità di molte proteine ECM, e anche dal potenziale contaminazione ECM estrae con proteine intracellulari. Una procedura multi-step progettata per isolare la frazione ECM da tessuti per l'analisi proteomica prodotto 8% di proteine ECM nel set totale di proteine identificate 21. Tuttavia, peptidi di proteine ECM sono stati il 73% del totale dei peptidi identificati. Questo metodo per l'isolamento e l'analisi di ECM derivato dalle cellule rapido e affidabile rimuove materiale cellulare pur mantenendo proteine ECM. Questo metodo può essere utilizzato per una varietà di tipi cellulari e applicazioni a valle e facilita l'analisi di biologia ECM e cellula-ECM interazioni in coltura cellulare. I nostri protocolli di dettaglio come il metodo può essere applicato a diverse scale per affrontare una vasta gamma di expdomande erimental in materia di organizzazione ECM, dinamiche, o la composizione, e per gli effetti funzionali della ECM isolato sulle cellule.
Le applicazioni future o Indicazioni Dopo aver imparato questa tecnica
Guardando al futuro, il metodo potrebbe essere adattato per l'uso con colture cellulari in 3D; questo sarebbe espandere la sua rilevanza fisiologica. Tessuto nativo decellularized ha un grande potenziale come impalcatura per la rigenerazione del tessuto perso o danneggiato ed in alternativa al trapianto, come ad esempio dopo infarto 22. Essa ha il potenziale per superare i problemi di disponibilità donatore e immunorejection. Le future applicazioni del metodo descritto in questo rapporto potrebbero indagare il suo utilizzo con colture cellulari 3D o decellularization tessuto, che avrebbe ulteriormente aumentare la portata di questo approccio.
Acknowledgments
Siamo molto grati al Dott Belinda Willard, proteomica e metabolomica Laboratorio, Lerner Research Institute, Cleveland Clinic, per condurre l'analisi proteomica di RCS ECM. Noi riconosciamo il sostegno finanziario della theMedical Research Council del Regno Unito, concedere il numero K018043, a JCA.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibody to COL1A1 | Novus | NB600-408 | Rabbit polyclonal. Reacts with other fibrillar collagens as well as collagen I. IF: 1/200 |
| Antibody to fibronectin | Sigma | F3648 | Rabbit polyclonal. WB: 1/600 for 1.5 h. IF: 1/200 |
| Antibody to thrombospondin 1 | ThermoFisher | MA5-13398 | Mouse monoclonal clone A6.1. WB: 1/150 for 1.5 h |
| Antibody to RFP | Abcam | ab62341 | Rabbit polyclonal. WB: 1/2,000 for 2 h |
| Antibody to β-actin | Sigma | A1978 | Mouse monoclonal clone AC-15. WB: 1/10,000 for 1.5 h |
| Antibody to α-tubulin | Sigma | T9026 | Mouse monoclonal clone DM1A. WB: 1/5,000 for 1.5 h |
| Cell Tracker Green | ThermoFisher | C2925 | Fluorescent cell marker. Use at 1 µM for 30 min |
| Fluorescein isothiocyanate (FITC)-Phalloidin | Sigma | P-5282 | Stock = 50 mg/mL in DMSO. 1/50 for 45 min |
| FITC-conjugated goat anti-mouse IgG | Sigma | F8771 | IF: 1/50 for 1 h |
| FITC-conjugated sheep anti-rabbit IgG | SIgma | F7512 | IF: 1/50 for 1 h |
| Horseradish peroxidase (HRP)-conjugated goat anti-mouse IgG | LI-COR | 926-80010 | WB: 1/50,000 for 1 h |
| HRP-conjugated goat anti-rabbit IgG | LI-COR | 926-80011 | WB: 1/100,000 for 1 h |
| Vectorshield mounting medium with DAPI | Vector | H-1200 | Store at 4 °C in the dark |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium | Sigma | D6429 | Warm before use |
| Fibroblast growth medium | PromoCell | C-23010 | Warm before use, supplement with 50 µg/mL ascorbic acid |
| Phenol red-free DMEM | ThermoFisher | 21063-029 | Warm before use |
| Trypsin-EDTA solution | Sigma | T3924 | Warm before use |
| Gridded glass-bottomed dish | MatTek | P35G-2-14-C-GRID | |
| NH4OH, 28-30% solution | Sigma | 221228 | Dilute to 20 mM in de-ionised water. Once opened store in the dark, tightly capped. |
| Paraformaldehyde, 16% solution | Alfa Aesar | 43368 | Dilute to 2% (v/v) in PBS |
| Deoxycholic acid | Sigma | D2510 | Use at 2% (v/v) final concentration |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | Dilute to 0.5% (v/v) final concentration |
| GelCode Blue stain reagent | ThermoFisher | 24590 | Protein stain for SDS-PAGE gels |
| Precision Plus protein standards | Biorad | 161-0374 | Protein standards for SDS-PAGE gels |
| Trans-Blot SD Semi Dry transfer cell | Biorad | 1703940 | Efficient transfer of high molecular weight proteins |
| PVDF transfer membrane | Millipore | ISEQ00010 | Immobilon-PSQ |
| Ponceau S stain | Sigma | P7170 | Reversible protein stain for PVDF membrane |
| WesternSure Enhanced chemiluminescence (ECL) substrate | LI-COR | 926-80200 | |
| High performance chemiluminescence film | GE Healthcare | 28906837 | |
| Sterile filtration unit, MILLEX-GV | Millipore | ML481051 | |
| SP8 AOBS confocal laser scanning microscope | Leica | Environmental chamber needed for temperature and CO2 control (Life Imaging Services) | |
| Key: IF, Immunofluorescence; WB, Western Blot | |||
References
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