We present a protocol to isolate the auditory bulla, capsule, and ossicles from postnatal mice for whole mount and histological analysis.
在大多数哺乳动物中,在中耳听小骨,包括锤骨,砧骨和镫骨,是最小的骨头。在小鼠中,骨性结构称为听觉泡容纳小骨,而听觉胶囊包封内耳,即耳蜗和半规管。鼠小骨是极大的兴趣在耳鼻喉科领域的研究人员和听觉因此,至关重要,但它们的代谢,发育和进化是其他领域密切相关。改变的骨代谢能影响听力功能在成年小鼠和各种基因缺陷小鼠显示在子宫内听小骨的形态发生变化。尽管鼠听小骨是微小的,它们的操作是可行的,如果人理解他们的解剖定位和三维结构。在这里,我们将介绍如何剖析听泡和出生后的小鼠胶囊,然后通过去除肺大泡的一部分分离单个听小骨。我们还讨论了如何EM床在不同的方向的泡和胶囊,以产生石蜡或冰冻切片适于制备锤骨的纵向,横向,或正面部的。最后,我们列举小鼠和人类听小骨之间的解剖学差异。这些方法将在分析听小骨的病理,发育和进化方面和小鼠中耳有用。
中耳的三个听小骨,即锤骨,砧骨和镫骨,形成从鼓膜到内耳或耳蜗1,2-发送声音的哺乳动物特异性听觉链。听力功能可在小鼠中通过测量听性脑干反应(ABR)阈值3-6,和鼓膜可使用激光多普勒Vibrometry(LDV)7监视后面锤骨的振动来评价。通过结合ABR,LDV和畸变产物耳声发射(DPOAE)的测量,传导性听力损失可以从感减值8歧视。
耳条件动物模型都需要,给予听觉和耳部健康的患者的青睐福祉的重要性。例如,中耳炎是人类婴儿和儿童,以及严重,急性中耳炎看到一种极为常见的耳部感染,如果康迪其并发症可能会出现化是不是适当的抗生素治疗9。中耳炎小鼠模型可以证明在了解发病机制和开发治疗10,11有用。
鼠小骨,其中(除了锤骨的goniale部分)由软骨内骨化12,13形成的,是对骨代谢和形态发生的研究高度相关。首先,它们的小尺寸允许骨头高分辨率分析用X射线或荧光显微镜14一个完整的骨膜。其次,异常骨代谢,如过度或不足骨吸收或骨细胞15名受损的相互作用,可以分析作为一个潜在的贡献者听力损失3,4,7。第三,异常小骨形态发生报道在几个基因缺陷型小鼠,如缺乏HOXA2 16-19,MSX1 20-22 Prrx1 23,Goosecoid动物(GSC)24,25,Bapx1 13,Tshz1 26,DUSP6(Mkp3)27, 头蛋白 ( 木栓 )28,29 FGFR1,甲状腺激素受体(THRA,THRB)5,Bcl2的 30和其他1,31或过表达的小鼠HOXA2 32。最后,尽管其体积小,听小骨与诸如肌肉33和关节34,35相关的结构进行访问。
鼠标小骨比人听小骨小,但值得注意的是,鼠标中耳不是其人力对应的微缩版。例如,在小鼠中,镫骨动脉,穿过镫骨的环,持续整个生命36,而在人类中,该胚胎镫骨动脉妊娠期间消失。此外,鼠标锤骨的形态不同于第的不同Ë人骨( 见图6)。在小鼠中,听觉(鼓膜)泡包围充满空气的中耳腔,而在人类中,在颞骨小梁骨组成乳突气房容纳小骨,而不是一个大泡37。在这两个物种中,听觉胶囊(耳囊,骨迷路)包围耳蜗及内耳半规管。中耳的比较与进化生物学已经被广泛的审查38-40。
下面首先提供的协议描述了如何解剖分别出听泡和胶囊,其主要包括中耳和内耳。该协议还演示了如何隔离听觉泡锤骨,砧骨和镫骨。最后,它显示了如何定向听泡和胶囊制剂中嵌入的听骨组织切片。
在这里,我们提出来隔离在出生后小鼠听泡和胶囊有用的方法。在此之前P12,组织是脆弱和孤立过程中可能会损坏。 P12之后,听觉泡和胶囊可以容易地从周围组织中分离。切片之前解剖从头部泡具有几个优点。首先,发生汽蚀产后和听泡的增长率从P6起最积极,是由P14 50完成。鼓膜和耳蜗壁之间的间充质组织是由空气通过气蚀过程所取代。在中耳腔所得空气可阻碍期间固定,脱钙和嵌入组织和液体之间的接触。这是比较容易通过切断的前端(styliform处理),而不是试图在未分离大疱这样做从分离的听觉泡除去空气。第二,锤骨(和鼓膜)的方向不垂直在头部。它是一节中所希望的平面内的锤骨嵌入分离的听觉泡和胶囊在给定的取向,因此更容易。
一旦分离,听泡和胶囊可用于多种分析非常有用。例如,高清晰度的X射线显微CT可以揭示骨微结构的形态,例如在锤骨14成骨毛细管。所述stereofluorescence解剖显微镜是可视化中评价表达在中耳或内耳33荧光蛋白报告小鼠结构的有力工具。此外,各种在体内或离体荧光标记的方法和整装免疫检测可以进行。光片荧光显微镜也用于三维分析51是有用的。虽然这里没有描述,与听觉泡和胶囊如外周神经,血管相关多样的解剖结构,并在中耳的鼓膜也可使用此协议进行评价。
注意,石蜡切片需要嵌入前骨组织脱钙,因此不允许矿化的分析。与此相反,可以在不脱钙进行用于制备冰冻切片的川本膜的方法43,适合使用体内骨标记技术或特殊染色,如茜素染色矿化研究。冰冻切片条件应根据基于鼠标的年龄进行优化。例如,在低温恒温室内的较少凉爽温度推荐为老年小鼠的标本尽量减少部分的损坏。
在鼠标的锤骨的突出的半球形突起正确的术语是“圆形隆起”。尽管如此,术语“突短”已被广泛地用于指示更多次的圆形隆起一个二十年,特别是在小鼠的发育生物学家16,20,22-25。 “短突”原指横向过程(突外侧),它从圆形隆起不同。在人类中,横向处理类似的轻微锥形突起形成附着于鼓膜总路线,从柄(未示于图6B中 ,内侧视图)延伸。在小鼠中,横向过程也是在相对端的壳顶48上的柄的投影。鼓膜的鼓膜松弛部是上述锤骨的横向过程。圆形隆起是不被人类锤骨显而易见。
The authors have nothing to disclose.
The authors thank Masaki Yoda and Elise Lamar for critical reading of the manuscript, Kazumasa Takenouchi for help with histology, Mari Fujiwara for help with microscopy and Makoto Morikawa for help in photographing human and mouse auditory ossicles.
Tools/Equipment | |||
Paper towel | DAIO PAPER CORPORATION | 703347 | can be purchased from other vendors |
Glass Jar | Various | can be purchased from other vendors | |
14cm surgical scissors | Fine Science Tools (F.S.T.) | 91400-14 | can be purchased from other vendors |
Extra fine scissors-straight | Fine Science Tools (F.S.T.) | 14084-08 | can be purchased from other vendors |
Fine Forceps Angled 45° | Fine Science Tools (F.S.T.) | 11063-07 | can be purchased from other vendors |
Dissecting microscope | Nikon | SMZ800N | for routine dissection |
Dissecting microscope | Nikon | SMZ18 | for movies |
Injection needle 27G | TERUMO | NN-2719S | |
Syringe (1ml) | TERUMO | SS-01T | |
Marking Pin | Various | ||
Tube rotator RT-50 | TAITEC | 0000165-000 | can be purchased from other vendors |
Cryostat | Leica | CM3050S | http://www.leicabiosystems.com/histology-equipment/cryostats/details/product/leica-cm3050-s/ |
TC-65 Tungsten blade | Leica | 14021626379 | for Kawamoto's firm method |
Stainless containers | Leica | for Kawamoto's firm method | |
Cryofilm type IIC | Leica | for Kawamoto's firm method | |
Silane coated slide (New Silane II) | Muto Pure Chemicals | 511617 | can be purchased from other vendors |
Cover glass | Matsunami | can be purchased from other vendors | |
Tissue processor | Sakura Finetek | VIP-5 | can be purchased from other vendors |
Tissue Embedding Console System | Sakura Finetek | Tissue-Tek TEC 5 | can be purchased from other vendors |
Sliding microtome for paraffin | Yamato Kohki Industrial | REM-710 | can be purchased from other vendors |
Path Blade+pro for hard tissue | Matsunami | PB3503C | for paraffin section |
Micro-CT | RIGAKU | R_mCT2 | http://www.rigaku.com/en |
Fluorescence microscope | KEYENCE | BZ-9000 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Reagents | |||
Isoflurane | Maruishi pharmaceutical Co. Ltd | ||
NaCl | wako | 191-01665 | for PBS |
KCl | wako | 285-14 | for PBS |
Na2HPO4 12H2O | wako | 196-02835 | for PBS |
KH2PO4 | wako | 287-21 | for PBS |
Paraformaldehyde(EM Grade) | TAAB | P001 | |
EDTA-2Na | wako | 15111-45 | |
Trizma base | Sigma | T1503-1KG | |
Super Cryoembedding Medium | Leica | for Kawamoto's firm method | |
Dry Ice | Various | for Kawamoto's firm method | |
Hexane | wako | 080-03423 | for Kawamoto's firm method |
Super Cryomouting Medium type R2 | Leica | for Kawamoto's firm method | |
Paraffin | Sakura Finetek | 781001A0107 | |
Histo-Clear | NDS | HS-200 | |
Calcein | DOJINDO | 340-00433 | |
Hematoxylin | wako | 131-09665 | |
Eosin | wako | 051-06515 |