Abstract
ברוב היונקים, ossicles השמיעה באוזן התיכונה, כולל "פטיש, incus ו מִשׁוֶרֶת, הם העצמות הקטנות ביותר. בעכברים, מבנה גרמי שנקרא בולת שמיעת בתי ossicles, ואילו הקפסולה השמיעה המקיפה את האוזן הפנימית, כלומר השבלול ותעלות בצורת חצי עיגול. ossicles Murine חיוניים לדיון ובכך עניין רב החוקרים בתחום אף אוזן גרון, אבל חילוף החומרים, פיתוח, וההתפתחות שלהם רלוונטיות מאוד בתחומים אחרים. מטבוליזם העצם שינה יכול להשפיע על תפקוד שמיעה בעכברים בוגרים, ועכברי גן מחסר שונים להראות שינויי morphogenesis של ossicles שמיעה ברחם. למרות ossicles שמיעה בעכברים הם זעירים, המניפולציה שלהם אינה ריאלית אם אחד מבין אורינטציה אנטומיים שלהם ומבנה 3D. כאן אנו מתארים כיצד לנתח את הבולה השמיעתית הקפסולה של עכברים לאחר לידה ולאחר מכן לבודד ossicles פרט על ידי הסרת חלק הבולה. אנו גם לדון כיצד emבולה ואת הקפסולה המיטה נטיות שונות כדי ליצור פרפין או חלקים קפואים מתאים להכנת סעיפים אורכים, אופקיים, או חזיתיים של "פטיש. לבסוף, אנו למנות הבדלים אנטומיים בין עכבר ossicles שמיעה האנושי. שיטות אלו תהיינה שימושיות בניתוח היבטים פתולוגיים, התפתחותיים האבולוציונית של ossicles שמיעתי באוזן התיכונה בעכברים.
Introduction
השלושה ossicles השמיעה של האוזן התיכונה, כלומר "פטיש, incus, ו מִשׁוֶרֶת, יוצרת שרשרת שמיעה יונקת ספציפית המשדר צלילים מן התוף אל האוזן הפנימית, או שבלול 1,2. פונקציה שמיעה ניתן להעריכם עכברים על ידי מדידת בדיקת ABR (ABR) ספי 3-6, ורעידות של "פטיש מאחורי עור התוף ניתן לנטר באמצעות לייזר דופלר Vibrometry (LDV) 7. על ידי שילוב של ABR, LDV, ועיוות מוצרי Otoacoustic הפליטה (DPOAE) מדידות, אובדן שמיעת מוליך יכול להיות מופלה מירידה חושית-8.
במודלים של בעלי חיים בתנאי אוזן הנדרשים, בשים לב לחשיבות של שמיעת בריאות מאוזנת לרווחתם של חולים בכל הגילים. לדוגמא, דלקת אוזן תיכונה היא דלקת אוזניים נפוצה מאוד לראות תינוקות אנושיים וילדים, וחמור, דלקת אוזן תיכונה חריפה וסיבוכיה יכולים להתרחש אם קונדיtion אינה מטופלת עם antimicrobials 9 המתאים. מודלי עכבר של דלקת אוזן תיכונה יכולים להיות שימושיים בהבנת המחלה ו בפיתוח טיפולים 10,11.
Ossicles Murine, אשר (למעט חלק goniale של "פטיש) נוצרים על ידי התאבנות endochondral 12,13, רלוונטי מאוד בחקר מטבוליזם ומורפוגנזה עצם. ראשית, גודלם הקטן מאפשר ניתוח ברזולוציה גבוהה של עצמות עם periosteum שלם באמצעות רנטגן או פלואורסצנטי מיקרוסקופיה 14. שנית, עצם מטבוליות סוטה, כגון ספיגת עצם מוגזמת או חסרה, או אינטראקציות נפגעות בין תאי עצם 15, ניתן לנתח כתורם פוטנציאלי לשמוע 3,4,7 פסד. Morphogenesis ossicle שלישית, חריגה מדווח בכמה עכברים הגן מחסר, כגון בעלי חיים ללא Hoxa2 16-19, Msx1 20-22, 23 Prrx1, Goosecoid(GSC) 24,25, 13 Bapx1, 26 Tshz1, Dusp6 (Mkp3) 27, שהגולגולת (נוג) 28, 29 Fgfr1, קולטני הורמון בלוטת התריס (Thra, Thrb) 5, Bcl2 30 ואחרים 1,31, או בעכברים overexpressing Hoxa2 32. לבסוף, למרות גודלם הקטן, מבנים הקשורים ossicles כגון שרירים ומפרקים 33 34,35 נגישים.
ossicles העכבר הם קטנים יותר מאשר ossicles אדם, אך ראוי לציין כי אוזן העכבר האמצעית אינה גרסה מיניאטורית של מקבילו האנושי שלה. לדוגמא, בעכברים, עורק stapedial, אשר עובר דרך הטבעת של מִשׁוֶרֶת, נמשך לאורך כל חיים 36, ואילו אצל בני אדם, עורק stapedial העוברי נעלם במהלך הריון. בנוסף, את המורפולוגיה של "פטיש העכבר שונה מזו של הדואר עצמות אדם (ראה איור 6). בעכברים, הבולה השמיעתית (תוף) המקיפה את חלל האוזן התיכון מלא האוויר, ואילו בבני אדם, תאי אוויר פטמו מורכב עצם trabecular בתוך עצם הטמפורלית בתי ossicles ולא בולה 37. בשני המינים, הקפסולה השמיעה (קפסולה otic, מבוך גרמי) סוגרת שבלול ותעלות חצי עגולות של האוזן הפנימית. ביולוגיה השוואתית האבולוציונית של האוזן התיכונה נבדקה בהרחבה 38-40.
פרוטוקול להלן הראשון מתאר כיצד לנתח את הבולה ואת הקפסולה השמיעה, אשר מורכב בעיקר של האוזן התיכונה והאוזן הפנימית, בהתאמה. פרוטוקול זה גם מדגים כיצד לבודד את "פטיש, incus ו מִשׁוֶרֶת מן בולה השמיעה. לבסוף, הוא מראה כיצד לכוון את הבולה השמיעתית הקפסולה להטבעה כהכנת חתך רקמות של ossicles שמיעה.
Protocol
הנהלים כל חיה שבוצעה במחקר זה מאושרים על ידי טיפול בבעלי חיים מוסדיים אוניברסיטת Keio ועדת שימוש (IACUC - מספר אישור: 09,221) ופעל לפי הנחיות מוסדיים על ניסויים בבעלי חיים ב Keio University לשימוש בבעלי חיים למחקר. דגימות אנושיות בודדו פגר נתרם המחלקה לאנטומיה, אוניברסיטת Keio לרפואה, ושימשו בהתאם לתקנות מוסדיים.
1. ניתוק של שמיעתי בולה ו Capsule
- להרדים עכברים בתוך צנצנת המכילה פלטפורמה מעל מגבות נייר ספוגה isoflurane או sevoflurane עד אוורור הנשימה נפסקת למשך יותר דקות ולאחר מכן לבצע פריקה צוואר הרחם. היזהר, כדי למנוע מגע ישיר של עכברים עם מגבות נייר ספוגה.
- ביצוע חתך רוחבי קטן על הגב בצד של הצוואר ומושך עור בנפרד לכיוון הראש והזנב בשני הידות לחשוף mu צוואר הבסיסירקמת scle.
- לערוף עכברים באזור צוואר הרחם באמצעות 14 ס"מ מספריים כירורגיות חדה.
- עור פיל לחלוטין לכיוון האף. חותכים כל העור יחד עם החוטם ו החותכות.
- הכנס מספרי לתוך הפה ופצע שרירי masseter משני הצדדים.
- פתח את הלסת בזהירות להסיר את הלשון והלסת התחתונה יחד.
- בעזרת מספריים חדים, גולגולת פיצול ובסיס גולגולת לשני חצאים לאורך מטוס midsagittal (איור 1 א ', ב').
- בעזרת מלקחיים, להסיר את אונות המוח והמוח קטנות ואת גזע המוח. הבולה ואת הקפסולה השמיעה ממוקמים לרוחב במוח הקטן גזע המוח. ראוי לציין, כי הבולה השמיעתית היא עוד לרוחב הקפסולה השמיעה (איור 1 ג ', ד').
- לנתח את הבולה ואת הקפסולה עם עצם הגולגולת שמסביב (איור 1E).
- מעביר את הדגימה כדי בצלחת המכילה פוספט שנאגר המלוח (PBS) pH 7.4 ב RT.
- Under מיקרוסקופ לנתח משקף, להשתמש במלקחיים כדי לפרק את העצמות ומספריות סביב לחתוך את הגבול התיר סביב בולה ואת הקפסולה (האיור 1F). העצמות שמסביב הסיר הם basioccipital (גבול גחון), exoccipital (הגבול אחורי-ventro), supraoccipital (גבול אחורי), interparietal, הקודקודית (גבול גב), squamosal (גבול dorso-קדמי), alisphenoid (גבול קדמי), ו basisphenoid (אנטרו-גחון גבול) עצמות. ראוי לציין, כי תהליך דְמוּי חֶרֶט (SP), התומך פתיחת התוף של חצוצרת השמע 41, היא נבדלת תהליך styloid של העצם הטמפורלית.
בידוד 2. השמיעתי ossicles: "פטיש, Incus ו מִשׁוֶרֶת
- "פטיש
- שימוש בשני מספרי מלקחיים קטנים, הוצא את החלק של לרוחב תעלת שמע החיצוני אל tympanicus מענית כך התוף גלוי (איור 2 א ', ב').
- סור חלק עור התוף ועצמות הטימפאנית ליד malleal processus brevis (apophysis והמעוגל, ראה דיון), הוא על הגחון (מנוקד) ואת אחורי (#) קירות (איור 2 ג). שריר tympani "פטיש ו מותח צריך להיחשף עכשיו (איור 2 ד, ה).
- הרם את "פטיש (איור 2F) וחותכים את השריר tympani מותח עם הקצה המחודד של מחט 27 G (איור 2G). ראוי לציין, כי manubrium malleal מייחס בחוזקה אל עור התוף, כפי שנראה יונקים אחרים.
- לנתק את עור התוף בקפידה מתוך manubrium, שהוא שברירי. הסר את העצם הטימפאנית לחשוף שלושה ossicles השמיעה.
- לנקוע "פטיש מן incus במפרק ossicular (2H איור).
- לבודד את "פטיש ידי שבירה בתהליך הקדמי ליד goniale.
- Incus ו מִשׁוֶרֶת
- לבודד tהוא incus ידי ניתוק הרצועה האחורית של incus על היחידות להחלפה עצמית הקצרות (איור 3 א).
- לבודד את מִשׁוֶרֶת ידי ניתוק העורק stapedial ליד מִשׁוֶרֶת אחדות מן הקצה המחודד של מחט 27 G (איור 3B, C). במידת הצורך, לחתוך את הגיד של השריר stapedial לעבר תהליך של שרירי מִשׁוֶרֶת עם המחט.
- הכנס מחט תפירה (או סיכה לציון) לתוך נקב האטם של מִשׁוֶרֶת והרמת את מִשׁוֶרֶת. לאחר הסרת מִשׁוֶרֶת, פתיחת החלון הסגלגלה צריכה להיות גלוי לעין (איור 3D).
Embedding 3. שמיעתית בולה ו Capsule
- הכנה להטבעה בבלוקי פרפין
- לבודד את הבולה ואת הקפסולה כמתואר בסעיף 1.
- חותכים את הקצה הקדמי של בולה (תהליך דְמוּי חֶרֶט) במספריים, לטבול את הבולה ואת הקפסולה paraformaldehyde 4% (PFA) ב- PBS ב 4 °C, ולאפשר מקבע להיכנס הבולה. אם האוויר הופך לכוד בתוך בולה, להסיר אותו עם מחט ומזרק. השאירו את הבולה ואת כמוסה מקבע ב 4 ° CO / N על הכתף צינור.
זהירות: PFA הוא רעיל וצריך להיות מטופל בזהירות. - שטפי פעם עם PBS.
- Decalcify הבולה ואת הקפסולה במשך שבוע ב 4 ° C ב 10% מימית מלח ethylenediaminetetraacetic חומצה Disodium (EDTA-2Na), 100 מ"מ טריס בסיס, pH 7.0, בתוך שפופרת מ"ל 2. שינוי למאגר בכל יום אחר.
- שטפי פעם עם PBS. דוגמאות ניתן לאחסן 70% אתנול במים על 4 מעלות צלזיוס. לחלופין, להעביר אתנול 70% באמצעות סדרת אלכוהול מדורג (30%, 50%, 70% במים).
- על מעבד רקמות, מייבש דגימות בסדרה מדורגת של פתרונות אתנול (70%, 2x 95%,% 3x 100, כל 1 ח), ברורות קסילן (4x, כל h 1 ב 40 ° C), ולחדור דגימות עם שעוות פרפין מותך 42. לחלופין, קסילן תחליף עם להכשיר רקמות מסחריותפתרון g (למשל, HISTO-נקה).
- לפרוק דגימות מהמעבד, ולהוציא אותם הקלטות שלהם.
- על מערכת קונסולת הטבעת רקמות, מקום דגימות לתוך תבניות מלאות שעוות פרפין מותכת. המשך הטבעה (סעיף 4).
- הכן להטבעה בבלוקים קפוא (שיטת הסרט של קאוואמוטו) 43
- לבודד את הבולה ואת הקפסולה כמתואר בסעיף 1.
- חותכים את הקצה הקדמי של בולה (תהליך דְמוּי חֶרֶט) במספריים, לטבול את הבולה ואת הקפסולה מקבע (2% או 1% PFA ולא 4% ב PBS לשמר antigenicity) בשעה 4 מעלות צלזיוס. אם נלכד אוויר בולה, להסיר אותו באמצעות מחט מזרק. השאירו את הבולה ואת כמוסה מקבע ב 4 ° CO / N על הכתף צינור.
- לשטוף הבולה ואת הקפסולה במהירות PBS ומיד לטבול במתחם הטבעה-קריו נוזלי ב 4 ° C..
- חשוב: הסר בועות אוויר אם בכלל באמצעוהחיצוניים אוזן באמצעות שאיפה ידי מחט, ועל ידי הוספת מתחם ההטבעה עם מלקחיים. המשך הטבעה (סעיף 4).
4. כיווניות לדוגמא והטבעה
ההערה: בולה ואת הקפסולה כולה צריכים להיות מסודרת כיוון מסוים במהלך ההטבעה לחתוך חלקים רצויים. הנהלים המפורטים להלן משמשים לבתר את "פטיש אוריינטציות שונות.
- חתך אורך (parasagittal) של "פטיש
- שים בצד הלטרלי של בולה או meatus השמיעה החיצונית למטה פרפין חם (או תרכובת הטבעה-קריו). לשנות את הכיוון כך lamina הצוואר והרוחבי של "פטיש מקביל התחתון האופקית של מנת ההטבעה (איור 4 א - ג). ראוי לציין, כי עור התוף נוטה בזווית של כ 30 מעלות אל אנכי בראש העכבר (איור 4 א; איור 59 ב Kampen
- שים בצד הלטרלי של בולה או meatus השמיעה החיצונית למטה פרפין חם (או תרכובת הטבעה-קריו). לשנות את הכיוון כך lamina הצוואר והרוחבי של "פטיש מקביל התחתון האופקית של מנת ההטבעה (איור 4 א - ג). ראוי לציין, כי עור התוף נוטה בזווית של כ 30 מעלות אל אנכי בראש העכבר (איור 4 א; איור 59 ב Kampen
- חתך אופקי של "פטיש
- מניח את הרכס הגבה אופקי פרפין חם (או תרכובת ההטבעה-קריו). לשנות את הכיוון של הבולה ואת הקפסולה כך lamina הצוואר ורוחבי של "פטיש הם ניצבים אל החלק התחתון של המנה הטבעה (4D איור - F).
- חתך פרונטלי (חתכים) של קרום manubrium ואת התוף 5
- מניחים את manubrium malleal פרפין חם (או תרכובת הטבעה-קריו) כך שיהיה ניצב בתחתית צלחת הטבעה.
- מגניב במורד הרחוב לטמפרטורות מתאימות להקשיח פראפין על מערכת קונסולת הטבעת רקמות (לחלופין, להשתמש מתחם ההטבעה-קריו באמבט קרח / הקסאן יבש).
- תהליך לחסום רקמות וחתכים לחתוך באמצעות פרוצדורות שגרתיות. לדוגמה, חלקים פרפין הכתם עם hematoxylin ו eosin (H & #38; E), safranin O (עבור סחוס), או לפעילות Tartrate עמיד phosphatase חומצה (TRAP) (עבור osteoclasts) 3, או על ידי אימונוהיסטוכימיה. Cryosections Undecalcified מתאימים תיוג העצם באמצעות fluorochromes 14, מכתים אדום פואית עבור סידן, immunofluorescence 42.
Representative Results
פרוטוקול זה מציג שיטה לבודדת ossicles מן בולת שמיעת עכבר. ראשית, בולה ואת הקפסולה הם גזורים החוצה כמקשה אחת מהגולגולת (איור 1). הבולה גזור לאחר מכן נעשה שימוש כדי להכין את "פטיש (איור 2) ואת incus ו מִשׁוֶרֶת (איור 3). ציוני דרך של הבולה ואת הקפסולה השמיעה הם תהליך דְמוּי חֶרֶט בקצה הקדמי של בולה, הרכס הגבי, תעלה חצי עגול הקדמי, ואת fossa subarcuate (איור 1F). הדמיה טומוגרפיה Microcomputed (CT) מגלה ossicles ב הבולה השמיעה וכן אוריינטציות אופטימלי עבור חתך האורך האופקי של ossicles אלה (איור 4).
עבור חתך פרפין האורך של "פטיש, הבולה ואת הקפסולה היו decalcified ב EDTA על 4 מעלות צלזיוס למשך שבוע, מוטבע paבלוק raffin בבית אוריינטציה שמוצג באיור 4 א '- ג', מחולק ב 4 מיקרומטר, ולאחר מכן מוכתמים באמצעות H & E. "פטיש המצורפת עור התוף של בולה השמיעה חשף התאבנות endochondral מתמשך לעבר P14 (איור 5 א). כדי להמחיש היווצרות העצם החדש, calcein (30 מיקרוגרם / g משקל גוף) שהוזרק peritoneally לעכבר P20, ו הבולה ואת הקפסולה בודדו 24 שעות מאוחר יותר ב p21. המדגם ללא decalcification ננעץ קפוא ואז cryosectioned ב -6 מיקרומטר באמצעות סרט הדבקה על בסיס שיטת קאוואמוטו 43. לאחר מכתים הגרעיני עם DAPI (4 ', 6-diamidino-2-phenylindole), בסעיף נצפה תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי. אותות calcein (ירוק) חשפו היווצרות עצם חדשה "פטיש (מ '), בולה ואת הקפסולה (איור 5). עבור חתך אופקי של "פטיש, הבולה השמיעתית מבודד עכבר 5 שבועות בן ננעצה קפוא ללא decalcification (עבורהנטייה לראות איור 4D - F), cryosectioned ב -6 מיקרומטר בשיטת קאוואמוטו, ומוכתמת באמצעות H & E. חתך אופקי של brevis malleal processus (MPB) גם מראה שבלול (איור 5 ג).
מבט המדיאלי של ossicles התקין השמיעה מבודדת עכבר P31 תערוכות מאפיינים טיפוסיים של העכבר "פטיש, כלומר, "דאייה מעל שחף-כנף כמו" (או 45 דמוית חרב פרסי) manubrium, brevis processus בולט (apophysis ומעוגל ראו דיון), ואת lamina משוכל (איור 6). ראוי לציין, כי התהליך הקדמי (processus הקדמי) היה שבורת ההליך לנתיחה ברחבי goniale והופרד מזירת התוף (ectotympanic). מדגם מייצג זו המוצגים מפרק שלם incudomalleolar בין "פטיש ו incus, ואילו המפרק incudostapedial הוסטה ממקומה. הוספות Tendinous לתוך malleal ותהליכים שרירי stapedial ניתנים לזיהוי (איור 6 א, כוכביות).
איור 6 השווה עכבר ossicles שמיעה אנושי באותו ההגדלה. הבדלי מינים, מלבד גודל, כוללים את הבאים. Manubrium malleal הוא אגף דמוי בעכברים אבל במועדון כמו אצל בני אדם. הזווית בין ציר אנטומיים (או ציר הסיבוב, הקו בתהליך הקדמי של "פטיש ואת התהליך הקצר של incus) ואת manubrium היא הרבה יותר קטנה בעכברים ושתיים כמעט במקביל, בניגוד כמעט בניצב בבני אדם 6,46-48. בשנת ossicles האדם, מחקרים vibrometric לחשוף כי המפרק incudo-malleolar הוא נייד ולא 49 קבוע מבחינה תפקודית. העכבר "פטיש מפגין lamina משוכל רחב, רזה, שטוחה לא תמיד ניתן להבחין בבני אדם 47. בעכברים, הקדמי processus נתיכים לעצמות קרומיות, כלומר goniale ואת tympaniג טבעת, בעוד בני האדם הקדמי processus מצטמצם spicule קטן של העצם 41. מִשׁוֶרֶת של עכברים ובני אדם גם שונה: אצל עכברים, היחידות להחלפה עצמית הקדמיות מתעקמת היחידות להחלפה עצמית האחוריות היא יותר ישר ואילו אצל בני אדם, היחידות להחלפה עצמית הקדמיות היא יותר ישר מאשר היחידות להחלפה עצמית האחורית. ראוי לציין כי ביחס ראש "פטיש לגודל גוף מוגדל מסיבי מינים כגון שומת הזהב, הוכחה שונה משמעותית ביחסי allometric של "הקטנות" עצמות 48.
באיור 1. Dissection של השמיעתי הבולה ו כמוס. (א) הגולגולת של עכבר P31 מחולק על ימין ועל שמאל חצי. A, קדמי; P, אחוריים; L, עזב; R, נכון. (ב) משטח המדיאלי של החצי הימני של הראש נחצה, עור. Cx, קליפת המוח; Cb, המוח הקטן; Bs, brainstem. D, הגבה; V, גחון. (ג) הסרת המוח עם מלקחיים. (ד) צפה המדיאלי של הקפסולה השמיעה בגולגולת התקינה. הציצה הגבה (ראשי החץ) שוכנת בין fossa גולגולתי באמצע (MCF) ו גומץ גולגולתי האחורי (PCF) ומפרידה dorso-קדמי ומשטחי ventro-האחורי של הקפסולה השמיעה. סרגל קנה מידה, 2 מ"מ. (E) גדלה גבוהה של בולה שמיעתית כמוסה (תצוגת המדיאלי). Co, שבלול; VII, עצב הפנים; VIII, vestibulocochlear עצב; AC, קדמי (מעולה) תעלה חצי עגול; SF, גומץ subarcuate, שבו שוכן paraflocculus והמוח הקטן. סרגל קנה מידה, 1 מ"מ. (F) מיקרוסקופ של בולה ואת הקפסולה שמיעה מבודדת (תצוגת המדיאלי). Sp, תהליך דְמוּי חֶרֶט. סרגל קנה מידה, 1 מ"מ. (A - E), עכבר P31. (F), עכבר P33. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2. Dissection של "פטיש. (א) להציג ventrolateral של בולה ואת הקפסולה שמיעה תקינה. מענית tympanicus (ST, חץ מקווקו) הוא האתר המצורף של עור התוף. לרוחב העצם אל ST הוא חלק האוזן החיצונית, ואת המדיאלי עצם אל ST מהווה את הרצפה של חלל האוזן התיכונה. A, קדמי; P, אחוריים; D, הגבה; V, גחון. (ב) הצג לאחר הסרת תעלת השמע החיצונית כדי לחשוף את עור התוף (TM) כולל pars flaccida (PF) ו pars Tensa (Pt). הסרה (C) של חלקים מעצם התוף (קווים מקווקווים ו #) ליד malleal processus brevis (MPB). מ ', "פטיש; מ"מ, manubrium malleal. חץ, בועת אוויר בתוך חלל האוזן התיכונה לראות דרך עור התוף. (ד) החשוף "פטיש. ראש "פטיש מותווה. מְנוּקָדקו מציין את השטח במפרק של incus. (E) גיד של שריר tympani המותח (TT) מצורף "פטיש. (ו) tympani מותח נמשך כאשר "פטיש יוסר. *, תהליך שרירים. (G) tympani טנסור נחתך באמצעות מחט. (H) שלושה ossicles השמיעה לאחר הסרת עור התוף. מפרק incudo-malleolar הוסט ממקומה. מ ', "פטיש; אני, incus; ים, מִשׁוֶרֶת; לך, goniale (התמזג טבעת "פטיש ואת התוף, TR). כל ברי הסולם, 0.5 מ"מ. (A, H), עכבר P33. (B - G), עכבר P31. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3. Dissection של Incus ו מִשׁוֶרֶת. (א) Incus ומִשׁוֶרֶת לאחר הסרת "פטיש. העורק stapedial (SA) עובר דרך מִשׁוֶרֶת (ים). קו מקווקו מציין את פני השטח במפרק של incus. ראוי לציין, כי היחידות להחלפה עצמית הקצרות (ICB, יחידות להחלפה עצמית ברווה) של incus (i) נקבעה על ידי הרצועה האחורית (לא מוצג). אסטריסק, תהליך של שרירי מִשׁוֶרֶת. (ב) מִשׁוֶרֶת לאחר הסרת incus. קצה המחט משמש לחתוך את העורק stapedial (SA). חץ, כיוון זרימת דם. קו מקווקו מציין משטח במפרק של מִשׁוֶרֶת. (ג) העורק stapedial יוסר מִשׁוֶרֶת. X מציין את הקצוות של העורק stapedial (SA). (ד) החלון הסגלגל (ני, ovalis fenestra או vestibuli fenestra) גלוי לאחר הסרת מִשׁוֶרֶת. RW, חלון עגול (רוטונדה fenestra או cochleae fenestra). ברי סולם, 0.5 מ"מ. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של זהדמות.
איור 4. המכוון את השמיעה הבולה ו Capsule במהלך Embedding עבור אורכית (parasagittal, A - C) אופקי (D - E) חתך של "פטיש. (א - ג) lamina הצוואר והרוחבי של "פטיש ממוקם במקביל לחלק התחתון של הטבעת צלחת. (א) להציג צד: image מיקרו-CT להראות הטבעה של "פטיש ממש הבולה (pseudocolored כחול). "פטיש ו incus הם pseudocolored ירוק. קו מקווקו, מטוס החיתוך הרצוי. קו מוצק, בתחתית הטבעת צלחת. מ ', "פטיש; ראשי חץ, ציצה הגבה. M, המדיאלי; L, לרוחב; D, הגבה; V, גחון. (ב) לאור למעלה: תמונה מיקרו-CT. ראוי לציין, כי הקצה הקדמי של בולה (תהליך דְמוּי חֶרֶט) הוסר. אני, incus. (ג) צפה למעלה: מיקרוסקופ (שצולמו עםמסנן צבע). AC, קדמי (מעולה) תעלה חצי עגול; SF, גומץ subarcuate; Sp, תהליך דְמוּי חֶרֶט. A, קדמי; P, אחוריים; D, הגבה; V, גחון. (D - ו) processus brevis של "פטיש מושם בניצב לתחתית הטבעת צלחת. (ד) מבט צד: image מיקרו-CT להראות הטבעה של "פטיש תקין. קו מקווקו, מטוס החיתוך הרצוי. קו מוצק, בתחתית הטבעת צלחת. (ה) לאור למעלה: תמונה מיקרו-CT. מ"מ, manubrium malleal. (F) מבט עילי: מיקרוסקופ (נלקח עם מסנן צבע). ברי סולם, 1 מ"מ. תמונות מיקרו-CT התקבלו ברזולוציה voxel של 5 מיקרומטר, כפי שתואר לעיל 7. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Figure 5. היסטולוגיה. (א) H & E מכתים. סעיף אורך (parasagittal) של "פטיש ימנית מוטבע פרפין (מ ') בולה השמיעה (הקו המקווקו) ב P14. TM, עור התוף. (ב) תיוג עצם Calcein. חתך לאורך של "פטיש שמאל הקפוא, undecalcified (מ ') הבולה השמיעתית ב p21. Counterstain, DAPI. (ג) H & E מכתים. סעיף אופקי של קפוא, undecalcified עזב brevis processus malleal (MPB) ב בולה ואת הקפסולה השמיעה (עכבר 5 שבועות בן). Co, שבלול. ברי סולם, 1 מ"מ. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 6. המדיאלי צפו של השמיעתית ossicles. (א) ossicles שמיעת זכות P31 עכבר. A, קדמי; P, אחוריים; D, הגבה; V, גחון. סרגל קנה מידה, 1 מ"מ. ראש "פטיש (בנות mallei, Capitulum mallei); הצוואר (Collum mallei); lamina (lamina משוכל); מ"מ (manubrium mallei); כוכבי שחור (תהליך השרירי של "פטיש); MPA (Processus הקדמי, Processus gracilis); MPB (brevis processus); גוף incus (קורפוס incudis); ICB (ברווה Crus, יחידות להחלפה עצמית קצרה, תהליך קצר); כיל (longum Crus, יחידות להחלפה עצמית ארוכות, תהליך ארוך); IPL (lenticularis Processus, תהליך עדשה, Sylvian apophysis); ראש מִשׁוֶרֶת (בנות stapedis); כוכבית לבנה (תהליך של שרירי מִשׁוֶרֶת); SCA (anterius Crus, יחידות להחלפה עצמית קדמיות); SCP (CRU posterius, יחידות להחלפה עצמית אחורית); הבסיס (stapedis בסיס, אדן); SOF (foramen אטם, foramen הירכיים). (ב) ossicles השמיעה הימני של הנקבה האנושית בן 76 שנים (באדיבות המחלקה לאנטומיה, אוניברסיטת Keio לרפואה). Ossicles של העכבר P31 (בפינה הימנית התחתונה) הם צילמו באותו ההגדלה לזה המשמש ossicles האדם. הכמתמ"כחצי ed לציין את הזווית בין ציר אנטומיים ואת manubrium (קווים מקווקווים). סרגל קנה מידה, 2 מ"מ. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Discussion
כאן, אנו מציגים שיטה שימושית לבודד את הבולה ואת הקפסולה שמיעה בעכברים לאחר לידה. לפני P12, רקמות שבירות ויכולות להינזק במהלך בידוד. לאחר P12, הבולה ואת הקפסולה השמיעה ניתן לבודד בקלות הרקמות הסובבות. ביתור בולה מהראש לפני החתך יש מספר יתרונות. ראשית, cavitation לאחר הלידה והצמיחה של בולה השמיעה להתרחש באופן פעיל ביותר מ P6 ואילך הושלמו על ידי P14 50. רקמת mesenchymal בין עור התוף וקיר שבלול מוחלף אוויר בתהליך cavitation. האוויר כתוצאה בחלל האוזן התיכונה יכול לעכב קשר בין רקמות ונוזלים במהלך קיבעון, decalcification והטבעה. זה קל יותר להסיר אוויר מן בולה השמיעה מבודד על ידי ניתוק (תהליך דְמוּי חֶרֶט) הקצה הקדמי במקום לנסות לעשות זאת הבולה unisolated. שנית, הכיוון של "פטיש (ועם עור התוף) הוא לא אנכיבראש. לכן קל לבתר את "פטיש במטוסים הרצוי על ידי טבעת הבולה ואת הקפסולה שמיעה המבודדות אורינטציה נתונה.
לאחר מבודד, בולה שמיעתית קפסולות שימושיות עבור ניתוחים רבים. לדוגמה, X-ray ברזולוציה גבוהה מיקרו-CT יכול לחשוף מורפולוגיה מיקרו העצם כגון נימים osteogenic ב "פטיש 14. מיקרוסקופ לנתח stereofluorescence הוא כלי רב עוצמה כדי להמחיש מבנים בהערכת עכברים הכתב להביע חלבוני ניאון באוזן התיכונה או הפנימית 33. בנוסף, שונה in vivo או vivo לשעבר שיטות תיוג קרינה וזיהוי immunofluorescence הר שלם יכול להתבצע. מיקרוסקופ פלואורסצנטי גיליון אור הוא גם שימושי עבור ניתוח תלת ממדי 51. למרות שלא תואר כאן, מבנים אנטומיים מגוונים קשורים הבולה ואת הקפסולה השמיעה כגון עצבים היקפיים, כלי דם, ואתעור התוף באוזן התיכונה גם ניתן להעריך באמצעות פרוטוקול זה.
שים לב חתך פרפין דורש decalcification של רקמות עצם לפני ההטבעה ולכן אינו מאפשר ניתוח של מינרליזציה. לעומת זאת, שיטת סרט קאוואמוטו 43 המשמשת להכנת חלקים קפואים יכולה להתבצע ללא decalcification והוא מתאים מחקרים מינרליזציה באמצעות טכניקות עצם תיוג vivo או צביעה מיוחדת כגון מכתים Alizarin. תנאי קריו חתך צריכים להיות מותאמים בהתאם על בסיס גיל עכבר. לדוגמה, טמפרטורה קרירה פחות בתוך החדר cryostat מומלצת דגימות עכבר מבוגר כדי למזער את הנזק סעיפים.
בשנת עכבר, המונח הנכון עבור הבליטה חצי כדורי הבולטים של "פטיש הוא "apophysis והמעוגל". עם זאת, המונח "brevis processus" כבר בשימוש נרחב כדי לציין את apophysis והמעוגל עבור ה יותרלעשרים שנים, במיוחד בקרב ביולוגי התפתחותיים עכבר 16,20,22-25. "Processus brevis" במקור התייחס לתהליך לרוחב (processus lateralis), שונה מן apophysis והמעוגל. אצל בני אדם, מהלך רוחבי דומת הקרנת חרוטים קלה מהווה את הקו הכללי של התקשרות אל עור התוף, המשתרע manubrium (לא לראות באיור 6B, נוף המדיאלי). בעכברים, בתהליך לרוחב הוא גם השלכה של manubrium בקצה השני אל umbo 48. שהחלקי flaccida של עור התוף הוא מעל המהלך הרוחבי של "פטיש. apophysis והמעוגל אינו ניכר "פטיש האדם.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tools/Equipment | |||
| Paper towel | Daio Paper Corporation | 703347 | can be purchased from other vendors |
| Glass Jar | Various | can be purchased from other vendors | |
| 14 cm surgical scissors | Fine Science Tools (F.S.T.) | 91400-14 | can be purchased from other vendors |
| Extra fine scissors-straight | Fine Science Tools (F.S.T.) | 14084-08 | can be purchased from other vendors |
| Fine Forceps Angled 45° | Fine Science Tools (F.S.T.) | 11063-07 | can be purchased from other vendors |
| Dissecting microscope | Nikon | SMZ800N | for routine dissection |
| Dissecting microscope | Nikon | SMZ18 | for movies |
| Injection needle 27 G | TERUMO | NN-2719S | |
| Syringe (1 mL) | TERUMO | SS-01T | |
| Marking Pin | Various | ||
| Tube rotator RT-50 | TAITEC | 0000165-000 | can be purchased from other vendors |
| Cryostat | Leica | CM3050S | http://www.leicabiosystems.com/histology-equipment/cryostats/details/product/leica-cm3050-s/ |
| TC-65 Tungsten blade | Leica | 14021626379 | for Kawamoto's firm method |
| Stainless containers | Leica | for Kawamoto's firm method | |
| Cryofilm type IIC | Leica | for Kawamoto's firm method | |
| Silane coated slide (New Silane II) | Muto Pure Chemicals | 511617 | can be purchased from other vendors |
| Cover glass | Matsunami | can be purchased from other vendors | |
| Tissue processor | Sakura Finetek | VIP-5 | can be purchased from other vendors |
| Tissue Embedding Console System | Sakura Finetek | Tissue-Tek TEC 5 | can be purchased from other vendors |
| Sliding microtome for paraffin | Yamato Kohki Industrial | REM-710 | can be purchased from other vendors |
| Path Blade+pro for hard tissue | Matsunami | PB3503C | for paraffin section |
| Micro-CT | RIGAKU | R_mCT2 | http://www.rigaku.com/en |
| Fluorescence microscope | KEYENCE | BZ-9000 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Isoflurane | Maruishi pharmaceutical Co. Ltd | ||
| NaCl | wako | 191-01665 | for PBS |
| KCl | wako | 285-14 | for PBS |
| Na2HPO4 12H2O | wako | 196-02835 | for PBS |
| KH2PO4 | wako | 287-21 | for PBS |
| Paraformaldehyde (PFA, EM Grade) | TAAB | P001 | |
| EDTA-2Na | wako | 15111-45 | |
| Trizma base | Sigma | T1503-1KG | |
| Super Cryoembedding Medium | Leica | for Kawamoto's firm method | |
| Dry Ice | Various | for Kawamoto's firm method | |
| Hexane | wako | 080-03423 | for Kawamoto's firm method |
| Super Cryomouting Medium type R2 | Leica | for Kawamoto's firm method | |
| Paraffin | Sakura Finetek | 781001A0107 | |
| Histo-Clear | NDS | HS-200 | |
| Calcein | DOJINDO | 340-00433 | |
| Hematoxylin | wako | 131-09665 | |
| Eosin | wako | 051-06515 |
References
- Mallo, M. Formation of the middle ear: recent progress on the developmental and molecular mechanisms. Dev Biol. 231, 410-419 (2001).
- Manley, G. A. An evolutionary perspective on middle ears. Hear Res. 263, 3-8 (2010).
- Kanzaki, S., Ito, M., Takada, Y., Ogawa, K., Matsuo, K. Resorption of auditory ossicles and hearing loss in mice lacking osteoprotegerin. Bone. 39, 414-419 (2006).
- Kanzaki, S., Takada, Y., Ogawa, K., Matsuo, K. Bisphosphonate therapy ameliorates hearing loss in mice lacking osteoprotegerin. J Bone Miner Res. 24, 43-49 (2009).
- Cordas, E. A., et al. Thyroid hormone receptors control developmental maturation of the middle ear and the size of the ossicular bones. Endocrinology. 153, 1548-1560 (2012).
- Dong, W., Varavva, P., Olson, E. S. Sound transmission along the ossicular chain in common wild-type laboratory mice. Hear Res. 301, 27-34 (2013).
- Kanzaki, S., et al. Impaired vibration of auditory ossicles in osteopetrotic mice. Am J Pathol. 178, 1270-1278 (2011).
- Qin, Z., Wood, M., Rosowski, J. J. Measurement of conductive hearing loss in mice. Hear Res. , (2009).
- Klein, J. O. Is acute otitis media a treatable disease? N Engl J Med. 364, 168-169 (2011).
- Rosch, J. W., et al. A live-attenuated pneumococcal vaccine elicits CD4+ T-cell dependent class switching and provides serotype independent protection against acute otitis media. EMBO Mol Med. 6, 141-154 (2014).
- Li, X., et al. Otitis media in sperm-associated antigen 6 (Spag6)-deficient mice. PLoS One. 9, e112879 (2014).
- Rodríguez Vázquez, J. F., Mérida Velasco, J. R., Jiménez Collado, J. A study of the os goniale in man. Acta Anat (Basel). 142, 188-192 (1991).
- Tucker, A. S., Watson, R. P., Lettice, L. A., Yamada, G., Hill, R. E. Bapx1 regulates patterning in the middle ear: altered regulatory role in the transition from the proximal jaw during vertebrate evolution. Development. 131, 1235-1245 (2004).
- Matsuo, K., et al. Osteogenic capillaries orchestrate growth plate-independent ossification of the malleus. Development. 142, 3912-3920 (2015).
- Matsuo, K. Cross-talk among bone cells. Curr Opin Nephrol Hypertens. 18, 292-297 (2009).
- Rijli, F. M., et al. A homeotic transformation is generated in the rostral branchial region of the head by disruption of Hoxa-2, which acts as a selector gene. Cell. 75, 1333-1349 (1993).
- Mallo, M., Gridley, T. Development of the mammalian ear: coordinate regulation of formation of the tympanic ring and the external acoustic meatus. Development. 122, 173-179 (1996).
- O'Gorman, S. Second branchial arch lineages of the middle ear of wild-type and Hoxa2 mutant mice. Dev Dyn. 234, 124-131 (2005).
- Santagati, F., Minoux, M., Ren, S. Y., Rijli, F. M. Temporal requirement of Hoxa2 in cranial neural crest skeletal morphogenesis. Development. 132, 4927-4936 (2005).
- Satokata, I., Maas, R. Msx1 deficient mice exhibit cleft palate and abnormalities of craniofacial and tooth development. Nat Genet. 6, 348-356 (1994).
- Zhang, Z., et al. Malleal processus brevis is dispensable for normal hearing in mice. Dev Dyn. 227, 69-77 (2003).
- Houzelstein, D., Cohen, A., Buckingham, M. E., Robert, B. Insertional mutation of the mouse Msx1 homeobox gene by an nlacZ reporter gene. Mech Dev. 65, 123-133 (1997).
- Martin, J. F., Bradley, A., Olson, E. N. The paired-like homeo box gene MHox is required for early events of skeletogenesis in multiple lineages. Genes Dev. 9, 1237-1249 (1995).
- Yamada, G., et al. Targeted mutation of the murine goosecoid gene results in craniofacial defects and neonatal death. Development. 121, 3005-3012 (1995).
- Rivera-Pérez, J. A., Mallo, M., Gendron-Maguire, M., Gridley, T., Behringer, R. R. Goosecoid is not an essential component of the mouse gastrula organizer but is required for craniofacial and rib development. Development. 121, 3005-3012 (1995).
- Coré, N., et al. Tshz1 is required for axial skeleton, soft palate and middle ear development in mice. Dev Biol. 308, 407-420 (2007).
- Li, C., Scott, D. A., Hatch, E., Tian, X., Mansour, S. L. Dusp6 (Mkp3) is a negative feedback regulator of FGF-stimulated ERK signaling during mouse development. Development. 134, 167-176 (2007).
- Hwang, C. H., Wu, D. K. Noggin heterozygous mice: an animal model for congenital conductive hearing loss in humans. Hum Mol Genet. 17, 844-853 (2008).
- Calvert, J. A., et al. A missense mutation in Fgfr1 causes ear and skull defects in hush puppy mice. Mamm Genome. 22, 290-305 (2011).
- Carpinelli, M. R., et al. Anti-apoptotic gene Bcl2 is required for stapes development and hearing. Cell death dis. 3, e362 (2012).
- Chapman, S. C. Can you hear me now? Understanding vertebrate middle ear development. Front Biosci (Landmark Ed). 16, 1675-1692 (2011).
- Kitazawa, T., et al. Distinct effects of Hoxa2 overexpression in cranial neural crest populations reveal that the mammalian hyomandibular-ceratohyal boundary maps within the styloid process. Dev Biol. 402, 162-174 (2015).
- Wang, L., et al. Scleraxis is required for differentiation of the stapedius and tensor tympani tendons of the middle ear. J Assoc Res Otolaryngol. 12, 407-421 (2011).
- Amin, S., Tucker, A. S. Joint formation in the middle ear: lessons from the mouse and guinea pig. Dev Dyn. 235, 1326-1333 (2006).
- Amin, S., Matalova, E., Simpson, C., Yoshida, H., Tucker, A. S. Incudomalleal joint formation: the roles of apoptosis, migration and downregulation. BMC Dev Biol. 7, 134 (2007).
- Hiruma, T., Nakajima, Y., Nakamura, H. Development of pharyngeal arch arteries in early mouse embryo. Journal of anatomy. 201, 15-29 (2002).
- Treuting, P. M., Dintzis, S. M. Ch. 22, Special senses: ear. Comparative Anatomy and Histology: A Mouse and Human Atlas. Treuting, P. M., Dintzis, S. M. 22, Academic Press. 419-432 (2012).
- Mallo, M., Schrewe, H., Martin, J. F., Olson, E. N., Ohnemus, S. Assembling a functional tympanic membrane: signals from the external acoustic meatus coordinate development of the malleal manubrium. Development. 127, 4127-4136 (2000).
- Anthwal, N., Joshi, L., Tucker, A. S. Evolution of the mammalian middle ear and jaw: adaptations and novel structures. Journal of anatomy. 222, 147-160 (2013).
- Takechi, M., Kuratani, S. History of studies on mammalian middle ear evolution: a comparative morphological and developmental biology perspective. J Exp Zool B Mol Dev Evol. 314, 417-433 (2010).
- Henson, O. W. Jr Ch. 3, Comparative Anatomy of the Middle Ear. Handbook of Sensory Physiology. Keidel, W. D., Neff, W. D. Vol. 1, Auditory System. Anatomy, Physiology (Ear), Springer. Berlin Heidelberg. 39-110 (1974).
- Handbook of Histology Methods for Bone and Cartilage. , Humana Press. (2003).
- Kawamoto, T. Use of a new adhesive film for the preparation of multi-purpose fresh-frozen sections from hard tissues, whole-animals, insects and plants. Arch Histol Cytol. 66, 123-143 (2003).
- Kampen, P. N. V. Gegenbaurs Morphologiesches Jahrbuch. 34, W. Engelmann. 321-722 (1905).
- Lee, J. H., Park, K., Kang, T. C., Choung, Y. H. Three-dimensional anatomy of the temporal bone in normal mice. Anat Histol Embryol. 38, 311-315 (2009).
- Fleischer, G. Evolutionary principles of the mammalian middle ear. Adv Anat Embryol Cell Biol. 55, 3-70 (1978).
- Lavender, D., Taraskin, S. N., Mason, M. J. Mass distribution and rotational inertia of "microtype" and "freely mobile" middle ear ossicles in rodents. Hear Res. 282, 97-107 (2011).
- Mason, M. J. Of mice, moles and guinea pigs: functional morphology of the middle ear in living mammals. Hear Res. 301, 4-18 (2013).
- Willi, U. B., Ferrazzini, M. A., Huber, A. M. The incudo-malleolar joint and sound transmission losses. Hear Res. 174, 32-44 (2002).
- Richter, C. A., et al. Defects in middle ear cavitation cause conductive hearing loss in the Tcof1 mutant mouse. Hum Mol Genet. 19, 1551-1560 (2010).
- Buytaert, J. A., Johnson, S. B., Dierick, M., Salih, W. H., Santi, P. A. MicroCT versus sTSLIM 3D imaging of the mouse cochlea. J Histochem Cytochem. 61, 382-395 (2013).
