We present a protocol to isolate the auditory bulla, capsule, and ossicles from postnatal mice for whole mount and histological analysis.
Nella maggior parte dei mammiferi, ossicini dell'orecchio medio, tra cui il martello, l'incudine e la staffa, sono le ossa più piccole. Nei topi, una struttura ossea chiamata bulla uditivo ospita gli ossicini, mentre la capsula uditivo racchiude l'orecchio interno, vale a dire la coclea e canali semicircolari. ossicini murini sono essenziali per l'ascolto e quindi di grande interesse per i ricercatori nel campo della otorinolaringoiatria, ma il loro metabolismo, lo sviluppo e l'evoluzione sono molto importanti per altri campi. Metabolismo osseo Altered può influenzare la funzione dell'udito nei topi adulti, e vari topi gene-carenti mostrano cambiamenti nella morfogenesi di ossicini uditivi in utero. Anche se murini ossicini sono piccoli, la loro manipolazione è fattibile se si comprende il loro orientamento anatomico e struttura 3D. Qui, descriviamo come sezionare la bulla uditivo e capsule di topi postnatale e quindi isolare i singoli ossicini rimuovendo parte della bolla. Discuteremo anche come emletto la bulla e la capsula in diversi orientamenti per generare paraffina o sezioni congelate adatto per la preparazione di sezioni longitudinali, orizzontali, o frontali sul martello. Infine, annoveriamo differenze anatomiche tra mouse e ossicini umani. Questi metodi sarebbero utile per analizzare gli aspetti patologici, di sviluppo e di evoluzione di ossicini e dell'orecchio medio nei topi.
I tre ossicini dell'orecchio medio, vale a dire i martello, incudine e staffa, formano una catena uditivo-specific mammiferi che trasmette il suono dalla membrana timpanica all'orecchio interno, o coclea 1,2. La funzione uditiva può essere valutata in topi misurando Auditory Brainstem Response (ABR) soglie 3-6, e le vibrazioni del martello dietro la membrana timpanica può essere monitorato tramite Laser Doppler Vibrometry (LDV) 7. Grazie alla combinazione di ABR, LDV, e misure di distorsione del prodotto Otoacoustic Emission (DPOAE), ipoacusia trasmissiva può essere discriminato da compromissione neurosensoriale 8.
Modelli animali di condizioni per le orecchie sono necessari, data l'importanza di ascoltare e di salute orecchio per il benessere dei pazienti di tutte le età. Ad esempio, l'otite media è una infezione dell'orecchio molto comune visto nei neonati e nei bambini umani, e gravi, otite media acuta e le sue complicazioni può verificarsi se il Condizione non è trattato con antimicrobici appropriati 9. Modelli murini di otite media potrebbero rivelarsi utili per la comprensione della patogenesi e nello sviluppo di trattamenti 10,11.
Ossicini murini, che (ad eccezione della parte goniale del martello) sono formate da encondrale 12,13, sono molto importanti per lo studio del metabolismo osseo e la morfogenesi. Innanzitutto, le loro piccole dimensioni permette l'analisi ad alta risoluzione di ossa con periostio intatti utilizzando raggi X o la microscopia a fluorescenza 14. In secondo luogo, il metabolismo osseo aberranti, come eccessiva o carente riassorbimento osseo, o interazioni con problemi tra le cellule ossee 15, può essere analizzato come un potenziale contributo alla perdita dell'udito 3,4,7. In terzo luogo, anormale morfogenesi ossicino è riportato in diversi topi gene-deficienti, come gli animali privi Hoxa2 16-19, 20-22 Msx1, Prrx1 23, Goosecoid(GSC) 24,25, Bapx1 13, Tshz1 26, Dusp6 (Mkp3) 27, Noggin (Nog) 28, FGFR1 29, recettore degli ormoni tiroidei (THRA, Thrb) 5, Bcl2 30 e altri 1,31, o nei topi che iperesprimono Hoxa2 32. Infine, nonostante le loro piccole dimensioni, le strutture associate a ossicini come i muscoli e le articolazioni 33 34,35 sono accessibili.
ossicini del mouse sono più piccoli ossicini umani, ma è da notare che l'orecchio centrale del mouse non è una versione in miniatura della sua controparte umana. Ad esempio, nei topi, l'arteria stapediale, che passa attraverso l'anello della staffa, persiste per tutta la vita 36, che negli esseri umani, l'arteria stapediale embrionale scompare durante la gestazione. Inoltre, la morfologia del martello del mouse differisce da quello di the ossa umane (vedi figura 6). Nei topi, l'uditivo (timpanica) bulla racchiude la cavità dell'orecchio medio piena d'aria, mentre negli esseri umani, le cellule mastoidee composto da osso trabecolare nell'osso temporale ospita gli ossicini, piuttosto che una bulla 37. In entrambe le specie, la capsula uditivo (capsula otica, labirinto osseo) racchiude la coclea e canali semicircolari dell'orecchio interno. Biologia comparativa ed evolutiva dell'orecchio medio è stato ampiamente rivisto 38-40.
Il protocollo di seguito prima spiega come sezionare la bulla uditivo e la capsula, che consistono principalmente l'orecchio medio e orecchio interno, rispettivamente. Questo protocollo dimostra anche come isolare il martello, incudine e staffa dal bulla uditivo. Infine, si mostra come orientare la bulla uditivo e capsule per l'incorporamento, in preparazione per il sezionamento del tessuto di ossicini uditivi.
Qui, vi presentiamo un metodo utile per isolare la bulla uditivo e la capsula nei topi postnatale. Prima di P12, i tessuti sono fragili e possono essere danneggiati durante l'isolamento. Dopo P12, la bulla uditivo e capsule possono essere facilmente isolati dai tessuti circostanti. Sezionare la bulla dalla testa prima di sezionamento ha diversi vantaggi. In primo luogo, la cavitazione e la crescita della bolla uditiva postnatale si verificano più attivamente dal P6 in poi e sono completi da P14 50. Il tessuto mesenchimale tra la membrana timpanica e la parete cocleare viene sostituita da aria attraverso il processo di cavitazione. L'aria risultante nella cavità dell'orecchio medio può impedire il contatto tra i tessuti e liquidi durante la fissazione, decalcificazione e incorporamento. E 'più facile per eliminare l'aria dal bulla uditivo isolato tagliando la fine (processo styliform) anterior piuttosto che cercare di farlo nel bulla non isolato. In secondo luogo, l'orientamento del martello (e la membrana timpanica) non è verticalenella testa. È quindi più facile da parte del martello in piani desiderati incorporando isolate bulla uditivo e capsule in un determinato orientamento.
Una volta isolato, bulla uditivo e le capsule sono utili per numerose analisi. Ad esempio, alta risoluzione a raggi X micro-CT può rivelare osso microstruttura morfologia come capillari osteogeniche del martello 14. Il stereofluorescence dissezione microscopio è un potente strumento per visualizzare le strutture nella valutazione topi indicatori che esprimono proteine fluorescenti nell'orecchio medio o interno 33. Inoltre, vari in vivo o ex vivo fluorescenza metodi di etichettatura e di tutta la rilevazione immunofluorescenza monte possono essere intraprese. Luce microscopia a fluorescenza con è utile anche per l'analisi tridimensionale 51. Anche se qui non descritto, diverse strutture anatomiche associate con la bolla uditivo e capsule come nervi periferici, vasi sanguigni, ela membrana timpanica nell'orecchio medio può anche essere valutata utilizzando questo protocollo.
Si noti che la paraffina sezionamento richiede la decalcificazione di tessuti ossei prima di incorporare e quindi non consentire l'analisi di mineralizzazione. Al contrario, il metodo pellicola Kawamoto 43 utilizzato per preparare sezioni congelate può essere eseguita senza la decalcificazione ed è adatto per studi di mineralizzazione utilizzando tecniche in osso-etichettatura vivo o schegge speciali come alizarina colorazione. condizioni di Cryo-sezionamento devono essere ottimizzati in funzione in base all'età del mouse. Ad esempio, una temperatura meno fredda all'interno della camera criostato è raccomandato per esemplari più vecchi mouse per minimizzare i danni alle sezioni.
Nel topo, il termine corretto per la sporgenza di primo piano semi-sferica del martello è "apofisi orbicolare". Tuttavia, il termine "processus brevis" è stato ampiamente utilizzato per indicare all'apofisi orbicolare per più thun ventennio, in particolare tra il mouse biologi dello sviluppo 16,20,22-25. "Processus brevis", originariamente riferito al processo laterale (processus lateralis), che si differenzia dal apofisi orbicolare. Negli esseri umani, un processo laterale simile a una leggera sporgenza conica costituisce la linea generale di attacco alla membrana timpanica, che si estende dal manubrio (non visibile in figura 6B, vista mediale). Nei topi, il processo laterale è anche una proiezione del manubrio all'estremità opposta al umbone 48. I pars flaccida della membrana timpanica è al di sopra del processo laterale del martello. apofisi orbicolare non è evidente nel martello umano.
The authors have nothing to disclose.
The authors thank Masaki Yoda and Elise Lamar for critical reading of the manuscript, Kazumasa Takenouchi for help with histology, Mari Fujiwara for help with microscopy and Makoto Morikawa for help in photographing human and mouse auditory ossicles.
Tools/Equipment | |||
Paper towel | DAIO PAPER CORPORATION | 703347 | can be purchased from other vendors |
Glass Jar | Various | can be purchased from other vendors | |
14cm surgical scissors | Fine Science Tools (F.S.T.) | 91400-14 | can be purchased from other vendors |
Extra fine scissors-straight | Fine Science Tools (F.S.T.) | 14084-08 | can be purchased from other vendors |
Fine Forceps Angled 45° | Fine Science Tools (F.S.T.) | 11063-07 | can be purchased from other vendors |
Dissecting microscope | Nikon | SMZ800N | for routine dissection |
Dissecting microscope | Nikon | SMZ18 | for movies |
Injection needle 27G | TERUMO | NN-2719S | |
Syringe (1ml) | TERUMO | SS-01T | |
Marking Pin | Various | ||
Tube rotator RT-50 | TAITEC | 0000165-000 | can be purchased from other vendors |
Cryostat | Leica | CM3050S | http://www.leicabiosystems.com/histology-equipment/cryostats/details/product/leica-cm3050-s/ |
TC-65 Tungsten blade | Leica | 14021626379 | for Kawamoto's firm method |
Stainless containers | Leica | for Kawamoto's firm method | |
Cryofilm type IIC | Leica | for Kawamoto's firm method | |
Silane coated slide (New Silane II) | Muto Pure Chemicals | 511617 | can be purchased from other vendors |
Cover glass | Matsunami | can be purchased from other vendors | |
Tissue processor | Sakura Finetek | VIP-5 | can be purchased from other vendors |
Tissue Embedding Console System | Sakura Finetek | Tissue-Tek TEC 5 | can be purchased from other vendors |
Sliding microtome for paraffin | Yamato Kohki Industrial | REM-710 | can be purchased from other vendors |
Path Blade+pro for hard tissue | Matsunami | PB3503C | for paraffin section |
Micro-CT | RIGAKU | R_mCT2 | http://www.rigaku.com/en |
Fluorescence microscope | KEYENCE | BZ-9000 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Reagents | |||
Isoflurane | Maruishi pharmaceutical Co. Ltd | ||
NaCl | wako | 191-01665 | for PBS |
KCl | wako | 285-14 | for PBS |
Na2HPO4 12H2O | wako | 196-02835 | for PBS |
KH2PO4 | wako | 287-21 | for PBS |
Paraformaldehyde(EM Grade) | TAAB | P001 | |
EDTA-2Na | wako | 15111-45 | |
Trizma base | Sigma | T1503-1KG | |
Super Cryoembedding Medium | Leica | for Kawamoto's firm method | |
Dry Ice | Various | for Kawamoto's firm method | |
Hexane | wako | 080-03423 | for Kawamoto's firm method |
Super Cryomouting Medium type R2 | Leica | for Kawamoto's firm method | |
Paraffin | Sakura Finetek | 781001A0107 | |
Histo-Clear | NDS | HS-200 | |
Calcein | DOJINDO | 340-00433 | |
Hematoxylin | wako | 131-09665 | |
Eosin | wako | 051-06515 |