We present a protocol to isolate the auditory bulla, capsule, and ossicles from postnatal mice for whole mount and histological analysis.
Dans la plupart des mammifères, osselets de l'oreille moyenne, y compris le marteau, l'enclume et l'étrier, sont les plus petits os. Chez la souris, une structure osseuse appelée la bulle auditive loge les osselets, tandis que la capsule entoure auditif de l'oreille interne, à savoir la cochlée et les canaux semi-circulaires. osselets murins sont essentiels pour l'audition et donc d'un grand intérêt pour les chercheurs dans le domaine de otorhinolaryngologie, mais leur métabolisme, le développement et l'évolution sont très pertinentes pour d'autres domaines. Métabolisme osseux Altered peut affecter la fonction auditive chez les souris adultes, et diverses souris génétiquement déficientes en montrer les changements dans la morphogenèse des osselets in utero. Bien que osselets murins sont minuscules, leur manipulation est possible si l'on comprend leur orientation anatomique et structure 3D. Ici, nous décrivons comment disséquer la bulle auditive et de la capsule de souris postnatales et ensuite isoler osselets individuels en enlevant une partie de la bulle. Nous discutons également comment emlit la bulle et de la capsule dans des orientations différentes pour générer de la paraffine ou des coupes congelées convenant à la préparation de coupes longitudinales, horizontales ou frontales du marteau. Enfin, nous énumérons les différences anatomiques entre les souris et osselets humains. Ces méthodes seraient utiles dans l'analyse des aspects pathologiques, de développement et de l'évolution des osselets et l'oreille moyenne chez les souris.
Les trois osselets de l'oreille moyenne, à savoir le marteau, l' enclume et l' étrier, forment une chaîne de mammifère auditif spécifique qui transmet le son à partir de la membrane du tympan de l'oreille interne ou cochlée 1,2. Fonction auditive peut être évaluée chez des souris en mesurant la réponse auditive du tronc cérébral (ABR) seuils 3-6, et les vibrations du marteau derrière la membrane tympanique peut être contrôlée en utilisant Laser Doppler Vibrométrie (LDV) 7. En combinant ABR, LDV et Distortion produit Otoacoustic Emission (ÉOAPD) mesures, la perte d'audition conductrice peut être discriminé de déficience neurosensorielle 8.
Les modèles animaux de conditions d'oreille sont nécessaires, étant donné l'importance de l'audition et de la santé de l'oreille pour le bien-être des patients de tous âges. Par exemple, l'otite moyenne est une infection de l'oreille très fréquemment observés chez les nourrissons et les enfants humains, et de graves, l'otite moyenne aiguë et ses complications peuvent se produire si les condition ne sont pas traités avec des antimicrobiens appropriés 9. Des modèles de souris de l' otite moyenne pourraient se révéler utiles dans la compréhension de la pathogenèse et le développement de traitements 10,11.
Osselets murins, qui (sauf pour la partie goniale du marteau) sont formés par ossification endochondrale 12,13, sont très pertinents pour l'étude du métabolisme osseux et de la morphogenèse. Tout d' abord, leur petite taille permet une analyse à haute résolution des os avec un périoste intact en utilisant des rayons X ou microscopie à fluorescence 14. Deuxièmement, le métabolisme osseux anormal, comme la résorption osseuse excessive ou déficiente, ou des interactions avec facultés affaiblies chez les cellules osseuses 15, peut être analysé comme un facteur potentiel de perte auditive 3,4,7. Troisièmement, la morphogenèse osselet anormale est signalée dans plusieurs souris génétiquement déficientes, comme les animaux dépourvus Hoxa2 16-19, Msx1 20-22, Prrx1 23, Goosecoid(Gsc) 24,25, Bapx1 13, Tshz1 26, Dusp6 (MKP3) 27, Noggin (Nog) 28, FGFR1 29, hormone thyroïdienne récepteurs (Thra, Thrb) 5, Bcl2 30 et autres 1,31, ou chez les souris surexprimant Hoxa2 32. Enfin, malgré leur petite taille, les structures associées à des osselets tels que les muscles et les articulations 33 34,35 sont accessibles.
osselets souris sont plus petits que osselets humains, mais il est intéressant de noter que l'oreille moyenne de la souris ne sont pas une version miniature de son homologue humain. Par exemple, chez la souris, l'artère stapédienne, qui passe à travers l'anneau de l'étrier, persiste tout au long de la vie 36, alors que chez l' homme, l'artère stapédienne embryonnaire disparaît pendant la gestation. En outre, la morphologie du marteau de souris diffère de celle du ièmee os humain (voir Figure 6). Chez les souris, la bulle auditive (tympanique) entoure la cavité de l' oreille moyenne remplie d' air, alors que chez les humains, les cellules mastoïdiennes composées d'os trabéculaire dans l'os temporal abrite les osselets plutôt que d' une bulle 37. Chez les deux espèces, la capsule auditive (capsule otique, labyrinthe osseux) entoure la cochlée et des canaux semi-circulaires de l'oreille interne. Biologie comparative et évolutive de l'oreille moyenne a été largement revu 38-40.
Le protocole ci-dessous la première décrit comment disséquer la bulle et de la capsule auditive, qui se composent principalement de l'oreille moyenne et l'oreille interne, respectivement. Ce protocole montre également comment isoler le marteau, l'enclume et l'étrier de la bulle auditive. Enfin, il montre comment orienter la bulle auditive et de la capsule pour l'incorporation dans la préparation pour la coupe des tissus du osselets.
Ici, nous présentons une méthode utile pour isoler la bulle auditive et de la capsule chez les souris postnatales. Avant P12, les tissus sont fragiles et peuvent être endommagés lors de l'isolement. Après P12, la bulle auditive et de la capsule peuvent être facilement isolés des tissus environnants. Dissection de la bulle de la tête avant de sectionner présente plusieurs avantages. Tout d' abord, la cavitation postnatale et la croissance de la bulle auditive se produisent le plus activement de P6 partir et sont terminés par P14 50. Le tissu mésenchymateux entre la membrane tympanique et la paroi cochléaire est remplacé par l'air à travers le processus de cavitation. L'air résultant dans la cavité de l'oreille moyenne peut empêcher le contact entre les tissus et liquides pendant la fixation, la décalcification et l'intégration. Il est plus facile d'éliminer l'air de la bulle auditive isolée en coupant la fin (processus de styliforme) anterior plutôt que d'essayer de le faire dans le bulla non isolé. Deuxièmement, l'orientation du marteau (et la membrane tympanique) est pas verticaldans la tête. Il est donc plus facile à la section malleus dans des plans souhaités en intégrant la bulle auditive isolé et capsule dans une orientation donnée.
Une fois isolé, bulla et capsules auditives sont utiles pour de nombreuses analyses. Par exemple, une haute résolution X-ray micro-CT peut révéler osseuse microstructure morphologie tels que les capillaires ostéogéniques dans le malleus 14. Le stereofluorescence disséquant microscope est un outil puissant pour visualiser les structures dans l' évaluation des souris rapporteurs exprimant des protéines fluorescentes dans l'oreille moyenne ou interne 33. En outre, divers in vivo ou ex vivo par fluorescence méthodes de marquage et de détection de toute immunofluorescence montage pourrait être entreprise. Microscopie optique feuille de fluorescence est également utile pour l' analyse en trois dimensions 51. Bien que non décrit ici, diverses structures anatomiques associées à la bulle auditive et de la capsule tels que les nerfs périphériques, les vaisseaux sanguins, etla membrane tympanique dans l'oreille moyenne peut également être évaluée en utilisant ce protocole.
Notez que la paraffine tronçonnage nécessite décalcification des tissus osseux avant enrobage et donc ne permet pas l'analyse de la minéralisation. En revanche, la méthode du film Kawamoto 43 utilisé pour préparer des coupes congelées peut être effectuée sans décalcification et est adapté pour les études de minéralisation en utilisant des techniques in vivo os étiquetage ou coloration spéciale tels que Alizarine coloration. conditions Cryo-sectionnement doivent être optimisés selon fondée sur l'âge de la souris. Par exemple, une température inférieure fraîche à l'intérieur de la chambre de cryostat est recommandée pour les spécimens âgés de souris pour minimiser les dommages aux sections.
Chez la souris, le terme correct pour la saillie semi-sphérique importante du marteau est "apophyse orbiculaire". Néanmoins, le terme "brevis Processus" a été largement utilisé pour indiquer l'apophyse orbiculaire pour plus eune vingtaine d' années, en particulier chez les biologistes du développement de la souris 16,20,22-25. "Processus brevis" appelée à l'origine du processus latéral (Processus lateralis), qui diffère de l'apophyse orbiculaire. Chez l' homme, un processus latéral qui ressemble à une légère projection conique forme la ligne générale de l' attachement à la membrane tympanique, étendant à partir du manubrium (pas vu à la figure 6B, vue médiale). Chez les souris, le procédé latéral est également une projection du manubrium à l'extrémité opposée à l'ombilic 48. La pars flaccida de la membrane tympanique est au-dessus du processus latéral du marteau. apophyse Orbicular ne ressort pas dans le malleus humain.
The authors have nothing to disclose.
The authors thank Masaki Yoda and Elise Lamar for critical reading of the manuscript, Kazumasa Takenouchi for help with histology, Mari Fujiwara for help with microscopy and Makoto Morikawa for help in photographing human and mouse auditory ossicles.
Tools/Equipment | |||
Paper towel | DAIO PAPER CORPORATION | 703347 | can be purchased from other vendors |
Glass Jar | Various | can be purchased from other vendors | |
14cm surgical scissors | Fine Science Tools (F.S.T.) | 91400-14 | can be purchased from other vendors |
Extra fine scissors-straight | Fine Science Tools (F.S.T.) | 14084-08 | can be purchased from other vendors |
Fine Forceps Angled 45° | Fine Science Tools (F.S.T.) | 11063-07 | can be purchased from other vendors |
Dissecting microscope | Nikon | SMZ800N | for routine dissection |
Dissecting microscope | Nikon | SMZ18 | for movies |
Injection needle 27G | TERUMO | NN-2719S | |
Syringe (1ml) | TERUMO | SS-01T | |
Marking Pin | Various | ||
Tube rotator RT-50 | TAITEC | 0000165-000 | can be purchased from other vendors |
Cryostat | Leica | CM3050S | http://www.leicabiosystems.com/histology-equipment/cryostats/details/product/leica-cm3050-s/ |
TC-65 Tungsten blade | Leica | 14021626379 | for Kawamoto's firm method |
Stainless containers | Leica | for Kawamoto's firm method | |
Cryofilm type IIC | Leica | for Kawamoto's firm method | |
Silane coated slide (New Silane II) | Muto Pure Chemicals | 511617 | can be purchased from other vendors |
Cover glass | Matsunami | can be purchased from other vendors | |
Tissue processor | Sakura Finetek | VIP-5 | can be purchased from other vendors |
Tissue Embedding Console System | Sakura Finetek | Tissue-Tek TEC 5 | can be purchased from other vendors |
Sliding microtome for paraffin | Yamato Kohki Industrial | REM-710 | can be purchased from other vendors |
Path Blade+pro for hard tissue | Matsunami | PB3503C | for paraffin section |
Micro-CT | RIGAKU | R_mCT2 | http://www.rigaku.com/en |
Fluorescence microscope | KEYENCE | BZ-9000 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Reagents | |||
Isoflurane | Maruishi pharmaceutical Co. Ltd | ||
NaCl | wako | 191-01665 | for PBS |
KCl | wako | 285-14 | for PBS |
Na2HPO4 12H2O | wako | 196-02835 | for PBS |
KH2PO4 | wako | 287-21 | for PBS |
Paraformaldehyde(EM Grade) | TAAB | P001 | |
EDTA-2Na | wako | 15111-45 | |
Trizma base | Sigma | T1503-1KG | |
Super Cryoembedding Medium | Leica | for Kawamoto's firm method | |
Dry Ice | Various | for Kawamoto's firm method | |
Hexane | wako | 080-03423 | for Kawamoto's firm method |
Super Cryomouting Medium type R2 | Leica | for Kawamoto's firm method | |
Paraffin | Sakura Finetek | 781001A0107 | |
Histo-Clear | NDS | HS-200 | |
Calcein | DOJINDO | 340-00433 | |
Hematoxylin | wako | 131-09665 | |
Eosin | wako | 051-06515 |