We present a protocol to isolate the auditory bulla, capsule, and ossicles from postnatal mice for whole mount and histological analysis.
У большинства млекопитающих, слуховые косточки в среднем ухе, в том числе молоточка, наковальни и стремени, являются самыми маленькими кости. У мышей, костная структура, называемая слуховая булла дома Косточки, в то время как слуховой капсулы окружает внутреннее ухо, а именно улитку и полукружные каналы. Мышиные косточками имеют важное значение для слуха и, таким образом, представляет большой интерес для исследователей в области отоларингологии, но их метаболизм, развитие и эволюция являются весьма актуальными и в других областях. Измененный костный метаболизм может повлиять на функцию слуха у взрослых мышей, а также различных генов-дефицитных мышей показывают изменения в морфогенезе слуховых косточек в утробе матери. Хотя мышиные слуховые косточки крошечные, их манипуляции осуществимо, если человек понимает их анатомической ориентации и 3D-структуру. Здесь мы опишем, как рассекают слуховую буллу и капсулу послеродовых мышей, а затем изолировать отдельные косточки путем удаления части буллы. Мы также обсудим, как EMкровать булла и капсулы в различных направлениях для создания парафином или замороженные срезы, пригодные для получения продольных, горизонтальных или фронтальных разделов молоточка. Наконец, мы перечисляем анатомических различий между мышью и слуховыми косточками человека. Эти методы были бы полезны при анализе патологических, развития и эволюционные аспекты слуховых косточек и среднего уха у мышей.
Три слуховые косточки среднего уха, а именно молоточек, наковальня и стремя, образуют млекопитающим специфические слуховую цепь , которая осуществляет передачу звука от барабанной перепонки во внутреннее ухо, или улиткой 1,2. Слух функция может быть оценена на мышах путем измерения слуховую стволомозговые Response (ABR) порогов 3-6, и вибрация молоточка позади барабанной перепонки можно контролировать с помощью лазерной доплеровской виброметрии (LDV) 7. Объединив ABR, LDV и измерения продукта искажения отоакустической эмиссии (DPOAE), проводящая потеря слуха может быть различен с нейросенсорной обесценения 8.
Модели на животных условий уха необходимы, учитывая важность слуха и здоровья уха к благополучию пациентов всех возрастов. Например, средний отит является чрезвычайно распространенной инфекцией уха видел в человеческих младенцев и детей, и тяжелые, острый средний отит и его осложнения могут возникнуть, если кондиционция не лечится с помощью соответствующих антимикробных 9. Мышиные модели отита могут оказаться полезными в понимании патогенеза и в разработке методов лечения 10,11.
Мышиные косточками, которые (для goniale части молоточка исключением) образованы эндохондральной окостенения 12,13, имеют непосредственное отношение к изучению костного метаболизма и морфогенеза. Во- первых, их небольшой размер позволяет производить анализ с высоким разрешением костей с интактным надкостницы с использованием рентгеновской флуоресцентной микроскопии или 14. Во- вторых, аберрантное костного метаболизма, таких как избыток или недостаток костной резорбции или обесцененных взаимодействий между клетками костной ткани 15, могут быть проанализированы в качестве потенциального вкладчика к потере слуха 3,4,7. В- третьих, ненормальное косточка морфогенез сообщается в нескольких генов мышей с дефицитом, таких как животных , не имеющих Hoxa2 16-19 MSX1 20-22, Prrx1 23, Goosecoid(РКГ) 24,25, Bapx1 13, Tshz1 26, Dusp6 (Mkp3) 27, Noggin (Ног) 28, Fgfr1 29, гормонов щитовидной железы рецепторов (тра, Thrb) 5, BCL2 30 и другие 1,31, или у мышей с гиперэкспрессией Hoxa2 32. И, наконец, несмотря на их небольшие размеры, структуры , связанные с косточками , таких как мышцы и суставы 33 34,35 доступны.
Косточки Mouse меньше человеческих косточками, но следует отметить, что мышь среднего уха не является уменьшенной версией своего человеческого аналога. Например, у мышей, то стремянный артерия, которая проходит через кольцо стремени, сохраняется на протяжении всей жизни 36, в то время как у человека, эмбриональная стремянный артерии исчезает во время беременности. Кроме того, морфология молоточка мыши отличается от гое кости человека (рисунок 6). У мышей, слуховая (барабанная) булла окружает заполненные воздухом полости среднего уха, в то время как у людей, мастоидные клетки воздуха , состоящие из губчатой кости в височной кости находится Косточки , а не гутрашса 37. У обоих видов, слуховая капсула (ушные капсулы, костный лабиринт) замыкает улитку и полукружные каналы внутреннего уха. Сравнительная и эволюционная биология среднего уха широко рассмотрено 38-40.
Протокол Ниже приводится первый описывает, как рассекать из слуховую буллу и капсулы, которые состоят в основном из среднего уха и внутреннего уха, соответственно. Этот протокол также демонстрирует, как изолировать молоточек, наковальня и стремя из слуховом буллы. И, наконец, он показывает, как ориентировать слуховую буллу и капсулы для встраивания в рамках подготовки к ткани секционирования слуховых косточек.
Здесь мы представляем метод полезной для выделения слуховую буллу и капсулы в послеродовых мышей. До P12, ткани хрупки и могут быть повреждены во время изоляции. После того, как P12, слуховая булла и капсула может быть легко выделен из окружающих тканей. Препарирование буллу от головы до того секционирования имеет ряд преимуществ. Во- первых, послеродовые кавитация и рост слуховой буллы происходят наиболее активно из P6 года и являются полными , P14 50. Мезенхимальной ткани между барабанной перепонкой и кохлеарного стенки заменяется воздухом через кавитационного процесса. Полученный в результате воздух в полости среднего уха может препятствовать контакту между тканями и жидкостями при фиксации, декальцинации и встраивание. Легче удалить воздух из изолированной слуховой буллы, отрезав переднего конца (процесс в форме столбика), а не пытаться сделать это в Неизолированный буллы. Во-вторых, ориентация молоточка (и барабанной перепонки) не вертикальнав голове. Поэтому проще раздел молоточек в требуемых плоскостях путем встраивания выделенной слуховую буллу и капсулы в данной ориентации.
После выделения, слуховое Булла и капсулы могут быть использованы для многочисленных анализов. Например, высокое разрешение рентгеновских лучей микро-КТ может выявить костную микроструктура морфологии , такие как остеогенных капилляров в молоточка 14. Stereofluorescence рассечения микроскоп представляет собой мощный инструмент для визуализации структур в оценке репортер мышей , экспрессирующие флуоресцентные белки в середине или внутреннее ухо 33. Кроме того, различные в естественных условиях или бывших естественных условиях флуоресцентных методов маркировки и обнаружения всего иммунофлюоресценции монтирования может быть проведена. Свет листа флуоресцентной микроскопии также полезен для трехмерного анализа 51. Хотя это и не описано здесь, различные анатомические структуры, связанные с слуховым гутрашса и капсулы, такие как периферических нервов, кровеносных сосудов, ибарабанная перепонка в среднем ухе также может быть оценена с помощью этого протокола.
Обратите внимание, что парафин секционирования требует декальцинации костной тканей, прежде чем встраивание и, следовательно, не допускает анализ минерализации. В противоположность этому , метод пленки Кавамото 43 используется для подготовки замороженных срезов могут быть выполнены без декальцинации и подходит для исследований с использованием минерализация в естественных условиях методов костной маркировки или специального окрашивания , такие как ализарин окрашивания. условия крио-секционирования должны быть оптимизированы в зависимости в зависимости от возраста мыши. Например, менее круто температура внутри криостата камеры рекомендуется для более старых образцов мыши, чтобы свести к минимуму повреждение секций.
У мышей, правильный термин для известного полусферической протрузии молоточка "округло отросток". Тем не менее, термин "отросток Brevis" широко используется для обозначения округло апофиза для более-йАн два десятилетия, особенно среди мышей онтогенетики 16,20,22-25. "Processus Brevis" изначально относился к боковому процесса (отростки латеральной), которая отличается от округлой апофиза. У людей, боковой процесс , похожий на небольшую коническую проекцию образует общую линию прикрепления к барабанной перепонке, простирающейся от рукоятки (не показано на рисунке 6B, медиальная вид). У мышей, боковой процесс также проекция рукоятки на противоположном конце к макушкой 48. Рагз flaccida барабанной перепонки находится выше бокового процесса молоточка. Округло отросток не проявляется в человеческом молоточка.
The authors have nothing to disclose.
The authors thank Masaki Yoda and Elise Lamar for critical reading of the manuscript, Kazumasa Takenouchi for help with histology, Mari Fujiwara for help with microscopy and Makoto Morikawa for help in photographing human and mouse auditory ossicles.
Tools/Equipment | |||
Paper towel | DAIO PAPER CORPORATION | 703347 | can be purchased from other vendors |
Glass Jar | Various | can be purchased from other vendors | |
14cm surgical scissors | Fine Science Tools (F.S.T.) | 91400-14 | can be purchased from other vendors |
Extra fine scissors-straight | Fine Science Tools (F.S.T.) | 14084-08 | can be purchased from other vendors |
Fine Forceps Angled 45° | Fine Science Tools (F.S.T.) | 11063-07 | can be purchased from other vendors |
Dissecting microscope | Nikon | SMZ800N | for routine dissection |
Dissecting microscope | Nikon | SMZ18 | for movies |
Injection needle 27G | TERUMO | NN-2719S | |
Syringe (1ml) | TERUMO | SS-01T | |
Marking Pin | Various | ||
Tube rotator RT-50 | TAITEC | 0000165-000 | can be purchased from other vendors |
Cryostat | Leica | CM3050S | http://www.leicabiosystems.com/histology-equipment/cryostats/details/product/leica-cm3050-s/ |
TC-65 Tungsten blade | Leica | 14021626379 | for Kawamoto's firm method |
Stainless containers | Leica | for Kawamoto's firm method | |
Cryofilm type IIC | Leica | for Kawamoto's firm method | |
Silane coated slide (New Silane II) | Muto Pure Chemicals | 511617 | can be purchased from other vendors |
Cover glass | Matsunami | can be purchased from other vendors | |
Tissue processor | Sakura Finetek | VIP-5 | can be purchased from other vendors |
Tissue Embedding Console System | Sakura Finetek | Tissue-Tek TEC 5 | can be purchased from other vendors |
Sliding microtome for paraffin | Yamato Kohki Industrial | REM-710 | can be purchased from other vendors |
Path Blade+pro for hard tissue | Matsunami | PB3503C | for paraffin section |
Micro-CT | RIGAKU | R_mCT2 | http://www.rigaku.com/en |
Fluorescence microscope | KEYENCE | BZ-9000 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Reagents | |||
Isoflurane | Maruishi pharmaceutical Co. Ltd | ||
NaCl | wako | 191-01665 | for PBS |
KCl | wako | 285-14 | for PBS |
Na2HPO4 12H2O | wako | 196-02835 | for PBS |
KH2PO4 | wako | 287-21 | for PBS |
Paraformaldehyde(EM Grade) | TAAB | P001 | |
EDTA-2Na | wako | 15111-45 | |
Trizma base | Sigma | T1503-1KG | |
Super Cryoembedding Medium | Leica | for Kawamoto's firm method | |
Dry Ice | Various | for Kawamoto's firm method | |
Hexane | wako | 080-03423 | for Kawamoto's firm method |
Super Cryomouting Medium type R2 | Leica | for Kawamoto's firm method | |
Paraffin | Sakura Finetek | 781001A0107 | |
Histo-Clear | NDS | HS-200 | |
Calcein | DOJINDO | 340-00433 | |
Hematoxylin | wako | 131-09665 | |
Eosin | wako | 051-06515 |