We present a protocol to isolate the auditory bulla, capsule, and ossicles from postnatal mice for whole mount and histological analysis.
I de fleste pattedyr, auditive ossicles i mellemøret, herunder malleus, incus og stapes, er de mindste knogler. Hos mus, en knoglestrukturen kaldet auditive bulla huser ossicles, mens det auditive kapsel omslutter det indre øre, nemlig cochlea og halvrunde kanaler. Murine ossicles er afgørende for at høre, og dermed af stor interesse for forskere inden for området otolaryngology, men deres stofskifte, udvikling og evolution er yderst relevante for andre områder. Altered knoglemetabolisme kan påvirke hørelse funktion i voksne mus, og forskellige gen-mangel mus viser ændringer i morfogenese af auditive ossicles i livmoderen. Selvom murine auditive ossicles er lille, deres manipulation er mulig, hvis man forstår deres anatomiske orientering og 3D struktur. Her beskriver vi, hvordan at dissekere den auditive bulla og kapsel postnatal mus og derefter isolere individuelle ossicles ved at fjerne en del af bulla. Vi diskuterer også, hvordan man emseng bulla og kapslen i forskellige orienteringer til generering paraffin eller frosne snit egnede til fremstilling af langsgående, vandrette eller frontale sektioner af malleus. Endelig optælle vi anatomiske forskelle mellem mus og mennesker auditive ossicles. Disse metoder ville være nyttig til at analysere patologiske, udviklingsmæssige og evolutionære aspekter af auditive ossicles og mellemøret hos mus.
De tre auditive ossicles i mellemøret, nemlig malleus, ambolt og stapes, danner en mammal-specifik auditiv kæde, der sender lyd fra trommehinden til det indre øre, eller cochlea 1,2. Hørefunktion kan vurderes i mus ved at måle Auditory Brainstem Response (ABR) grænseværdier 3-6, og vibration af malleus bag trommehinden kan overvåges ved hjælp Laser Doppler Vibrometry (LDV) 7. Ved at kombinere ABR, LDV, og Distortion otoakustiske Emission (DPOAE) målinger, kan ledende høretab skelnes fra sensorineuralt nedskrivninger 8.
Der er behov for Dyremodeller for øre betingelser, idet det er vigtigt at høre og øre sundhed til trivsel af patienter i alle aldre. For eksempel otitis media er en meget almindelig øreinfektion set i humane spædbørn og børn, og alvorlige, akut otitis media og dens komplikationer kan opstå, hvis betintion ikke behandles med passende antibiotika 9. Musemodeller for otitis media kunne være nyttige til forståelse af patogenesen og til udvikling af behandlinger 10,11.
Murine ossicles, som (med undtagelse af den goniale del af malleus) er dannet af endochondral ossifikation 12,13, er særdeles relevante for studiet af knoglemetabolisme og morfogenese. Først deres lille størrelse giver mulighed for høj opløsning analyse af knogler med en intakt periost ved hjælp af X-ray eller fluorescensmikroskopi 14. For det andet, afvigende knoglemetabolisme, såsom overdreven eller mangelfuld knogleresorption eller forringet interaktioner blandt knogleceller 15, kan analyseres som en potentiel bidragyder til høretab 3,4,7. Tredje, unormal ossicle morfogenese er rapporteret i adskillige gen-deficiente mus, såsom dyr, der mangler Hoxa2 16-19, Msx1 20-22, Prrx1 23, Goosecoid(GSC) 24,25, Bapx1 13, Tshz1 26, Dusp6 (Mkp3) 27, Noggin (Nog) 28, FGFR1 29, thyroideahormonreceptorer (thrA, Thrb) 5, Bcl2 30 og andre 1,31, eller hos mus overekspression Hoxa2 32. Endelig trods deres lille størrelse, strukturer forbundet med ossicles såsom muskler 33 og led 34,35 er tilgængelige.
Mus øreknoglerne er mindre end humane ossicles, men det er bemærkelsesværdigt, at mus mellemøret er ikke en miniatureudgave af dets menneskelige modstykke. For eksempel i mus, den stapedial arterie, der passerer gennem ringen af stapes, fortsætter gennem hele livet 36, hvorimod i mennesker, forsvinder det embryoniske stapedial arterie under svangerskabet. Desuden morfologien af musen malleus afviger fra the human knogle (se figur 6). Hos mus, det auditive (tympaniske) bulla omslutter luftfyldt mellemørets hulrum, hvorimod hos mennesker, mastoid luftceller sammensat af trabekulær knogle i tindingebenet huser øreknoglerne snarere end en bulla 37. I begge arter, den auditive kapsel (otiske kapsel, benet labyrint) omslutter cochlea og halvrunde kanalerne i det indre øre. Sammenlignende og evolutionær biologi mellemøret er blevet grundigt revideret 38-40.
Protokollen tilvejebragt nedenfor første beskriver, hvordan at dissekere den auditive bulla og kapsel, som består primært af mellemøret og det indre øre. Denne protokol viser også, hvordan man kan isolere malleus, ambolt og stapes fra det auditive bulla. Endelig det viser, hvordan at orientere auditive bulla og kapsel til indlejring i forberedelse til væv sektionering af auditive ossicles.
Her præsenteres en fremgangsmåde nyttigt at isolere den auditive bulla og kapsel i postnatale mus. Forud for P12, væv er skrøbelige og kan blive beskadiget under isolation. Efter P12, kan den auditive bulla og kapsel let isoleres fra omgivende væv. Dissekere bulla fra hovedet før sektionering har flere fordele. Først postnatal kavitation og vækst af den auditive bulla forekomme mest aktivt fra P6 fremefter og er fuldstændig ved P14 50. Den mesenkymale væv mellem trommehinden og cochlear væg erstattes af luft gennem kavitation proces. Den resulterende luft i mellemørets hulrum kan hindre kontakt mellem væv og væsker under fiksering, afkalkning og forankring. Det er lettere at fjerne luft fra den isolerede auditive bulla ved at afskære den forreste ende (styliform processen) snarere end at forsøge at gøre det i den uisolerede bulla. Sekund, orientering af malleus (og trommehinden) er ikke lodreti hovedet. Det er derfor lettere at afsnittet malleus i ønskede planer ved at indlejre den isolerede auditive bulla og kapsel i en given orientering.
Når isoleret, auditiv bulla og kapsler er nyttige for mange analyser. For eksempel kan høj opløsning X-ray micro-CT afslører knogle mikrostruktur morfologi såsom osteogene kapillærer i malleus 14. Den stereofluorescence dissektionsmikroskop er et kraftfuldt værktøj til at visualisere strukturer i evalueringen reporter mus, der udtrykker fluorescerende proteiner i midten eller indre øre 33. Desuden kunne forskellige in vivo eller ex vivo fluorescensmetoder mærkning og hele mount immunfluorescenspåvisningen skal gennemføres. Lys ark fluorescensmikroskopi er også nyttigt for tredimensional analyse 51. Selvom det ikke er beskrevet her, diverse anatomiske strukturer forbundet med den auditive bulla og kapsel såsom perifere nerver, blodkar, ogtrommehinden i mellemøret kan også evalueres ved hjælp af denne protokol.
Bemærk, at paraffin sektionering kræver afkalkning af knoglevæv før indlejring og derfor ikke tillader analyse af mineralisering. Derimod kan den Kawamoto film metode 43 anvendes til fremstilling af frosne sektioner udføres uden afkalkning og er velegnet til mineralisering undersøgelser under anvendelse in vivo teknikker knogle-mærkning eller specielle farvning såsom Alizarin farvning. Cryo-sektionsopdelingen betingelser bør optimeres ifølge baseret på mus alder. For eksempel anbefales en mindre køligt temperaturen inde i kryostatkammeret for ældre mus prøver at minimere skader på sektioner.
I mus, den korrekte betegnelse for den fremtrædende halvkugleformede fremspring i malleus er "orbicular apophysis". Alligevel udtrykket "processus brevis" har været almindeligt anvendt til at angive orbicular apophysis for mere then to årtier, især blandt mus udviklingsmæssige biologer 16,20,22-25. "Processus brevis", der oprindeligt henvist til den laterale proces (processus lateralis), som afviger fra den orbicular apophysis. Hos mennesker, en lateral proces ligner en let konisk fremspring danner den generelle linje for fastgørelse til trommehinden, der strækker sig fra manubrium (ikke ses i figur 6B, mediale visning). Hos mus, den laterale fremgangsmåde er også en projektion af manubrium ved den modsatte ende til umbo 48. Pars flaccida af trommehinden er over den laterale fremgangsmåde i malleus. Orbicular apophysis fremgår ikke i den menneskelige malleus.
The authors have nothing to disclose.
The authors thank Masaki Yoda and Elise Lamar for critical reading of the manuscript, Kazumasa Takenouchi for help with histology, Mari Fujiwara for help with microscopy and Makoto Morikawa for help in photographing human and mouse auditory ossicles.
Tools/Equipment | |||
Paper towel | DAIO PAPER CORPORATION | 703347 | can be purchased from other vendors |
Glass Jar | Various | can be purchased from other vendors | |
14cm surgical scissors | Fine Science Tools (F.S.T.) | 91400-14 | can be purchased from other vendors |
Extra fine scissors-straight | Fine Science Tools (F.S.T.) | 14084-08 | can be purchased from other vendors |
Fine Forceps Angled 45° | Fine Science Tools (F.S.T.) | 11063-07 | can be purchased from other vendors |
Dissecting microscope | Nikon | SMZ800N | for routine dissection |
Dissecting microscope | Nikon | SMZ18 | for movies |
Injection needle 27G | TERUMO | NN-2719S | |
Syringe (1ml) | TERUMO | SS-01T | |
Marking Pin | Various | ||
Tube rotator RT-50 | TAITEC | 0000165-000 | can be purchased from other vendors |
Cryostat | Leica | CM3050S | http://www.leicabiosystems.com/histology-equipment/cryostats/details/product/leica-cm3050-s/ |
TC-65 Tungsten blade | Leica | 14021626379 | for Kawamoto's firm method |
Stainless containers | Leica | for Kawamoto's firm method | |
Cryofilm type IIC | Leica | for Kawamoto's firm method | |
Silane coated slide (New Silane II) | Muto Pure Chemicals | 511617 | can be purchased from other vendors |
Cover glass | Matsunami | can be purchased from other vendors | |
Tissue processor | Sakura Finetek | VIP-5 | can be purchased from other vendors |
Tissue Embedding Console System | Sakura Finetek | Tissue-Tek TEC 5 | can be purchased from other vendors |
Sliding microtome for paraffin | Yamato Kohki Industrial | REM-710 | can be purchased from other vendors |
Path Blade+pro for hard tissue | Matsunami | PB3503C | for paraffin section |
Micro-CT | RIGAKU | R_mCT2 | http://www.rigaku.com/en |
Fluorescence microscope | KEYENCE | BZ-9000 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Reagents | |||
Isoflurane | Maruishi pharmaceutical Co. Ltd | ||
NaCl | wako | 191-01665 | for PBS |
KCl | wako | 285-14 | for PBS |
Na2HPO4 12H2O | wako | 196-02835 | for PBS |
KH2PO4 | wako | 287-21 | for PBS |
Paraformaldehyde(EM Grade) | TAAB | P001 | |
EDTA-2Na | wako | 15111-45 | |
Trizma base | Sigma | T1503-1KG | |
Super Cryoembedding Medium | Leica | for Kawamoto's firm method | |
Dry Ice | Various | for Kawamoto's firm method | |
Hexane | wako | 080-03423 | for Kawamoto's firm method |
Super Cryomouting Medium type R2 | Leica | for Kawamoto's firm method | |
Paraffin | Sakura Finetek | 781001A0107 | |
Histo-Clear | NDS | HS-200 | |
Calcein | DOJINDO | 340-00433 | |
Hematoxylin | wako | 131-09665 | |
Eosin | wako | 051-06515 |