We present a protocol to isolate the auditory bulla, capsule, and ossicles from postnatal mice for whole mount and histological analysis.
I de fleste pattedyr, auditive ossicles i mellomøret, inkludert hammeren, ambolten og stigbøylen, er de minste bein. Hos mus, en benete struktur kalt auditive Bulla huser ossicles, mens auditive kapsel omslutter det indre øret, nemlig cochlea og halvsirkelformet kanalene. Murine ossicles er avgjørende for hørsel og dermed av stor interesse for forskere innen otolaryngology, men deres metabolisme, utvikling og evolusjon er svært relevant for andre felt. Endret beinmetabolisme kan påvirke hørselen funksjon hos voksne mus, og ulike gen-mangelfull mus viser endringer i morphogenesis av auditive ossicles i utero. Selv murine auditive ossicles er liten, er deres manipulasjon mulig hvis man forstår deres anatomiske orientering og 3D-struktur. Her beskriver vi hvordan å dissekere det auditive Bulla og kapsel av postnatal mus og deretter isolere enkelt ossicles ved å fjerne en del av bulla. Vi diskuterer også hvordan man emsengen bulla og kapselen i forskjellige retninger for å generere parafin eller frosne seksjoner egnet for fremstilling av langsgående, horisontale eller frontale deler av hammeren. Til slutt, nummerere vi anatomiske forskjeller mellom mus og menneskelige auditive ossicles. Disse metodene vil være nyttig i å analysere patologiske, utviklings- og evolusjonære aspekter av auditive ossicles og mellomøret hos mus.
De tre auditive ossicles i mellomøret, nemlig hammeren, ambolten og stigbøylen, danner en pattedyr-spesifikk hørbar kjede som overfører lyden fra trommehinnen til det indre øret, eller cochlea 1,2. Hørselsfunksjonen kan evalueres i mus ved å måle Auditory hjernestammen Response (ABR) terskler 3-6, og vibrasjon av hammeren bak trommehinnen kan overvåkes ved hjelp av laser Doppler Vibrometry (LDV) 7. Ved å kombinere ABR, LDV, og forvrengning Product otoakustisk emisjon (DPOAE) målinger, kan mekanisk hørselstap bli diskriminert fra nevrofall 8.
Dyremodeller av øret forholdene er nødvendig, gitt viktigheten av å høre og øre helse til trivsel for pasienter i alle aldre. For eksempel er mellomørebetennelse en svært vanlig ørebetennelse sett i menneskelige spedbarn og barn, og alvorlige, akutte mellomørebetennelse og dens komplikasjoner kan oppstå hvis Condisjonen ikke behandles med passende antimikrobielle midler 9. Musemodeller av mellomørebetennelse kan være nyttig for å forstå patogenesen og i å utvikle behandlinger 10,11.
Murine ossicles, som (med unntak av goniale del av hammeren) er dannet av endochondral ossifikasjon 12,13, er svært relevant for studiet av beinmetabolisme og morphogenesis. For det første tillater deres lille størrelse med høy oppløsning analyse av ben med en intakt periosteum ved hjelp av røntgenstråle-fluorescens mikroskopi eller 14. For det andre, avvikende bein metabolisme, slik som overdreven eller mangelfull benresorpsjon, eller svekkede samspill mellom beinceller 15, kan analyseres som en potensiell bidragsyter til hørselstap 3,4,7. Tredje, unormal ossicle morphogenesis er rapportert i flere gen-mangelfull mus, for eksempel dyr mangler Hoxa2 16-19, Msx1 20-22, Prrx1 23, Goosecoid(GSC) 24,25, Bapx1 13, Tshz1 26, Dusp6 (Mkp3) 27, Noggin (Nog) 28, Fgfr1 29, thyroid hormonreseptorer (Thra, Thrb) 5, BCL2 30 og andres 1,31, eller hos mus overekspresjon Hoxa2 32. Til slutt, til tross for sin lille størrelse, strukturer assosiert med ossicles som muskler 33 og ledd 34,35 er tilgjengelige.
Muse ossicles er mindre enn menneskelige ossicles, men det er verdt å merke seg at musen mellomøret er ikke en miniatyr versjon av sin menneskelige motstykke. For eksempel, i mus, den stapedial arterien, som passerer gjennom ringen av stigbøylen, vedvarer gjennom hele livet 36, mens det hos mennesker, forsvinner den embryoniske stapedial arterien under drektighetsperioden. I tillegg, morfologi av mus hammeren adskiller seg fra the human bone (se figur 6). I mus, omslutter det auditive (trommehinnen) bulla det luftfylte hulrom i mellomøret, mens det hos mennesker, mastoid luftceller sammensatt av trabekulært ben i tinningbenet huser ossicles snarere enn en bulla 37. I begge arter, det auditive kapsel (otic kapsel, benete labyrinten) omslutter sneglehuset og halvsirkelformet kanalene i det indre øret. Sammen og evolusjonsbiologi i mellomøret har blitt grundig anmeldt 38-40.
Protokollen nedenfor beskriver først hvordan å dissekere ut hørsels bulla og kapsel, som består hovedsakelig av mellomøret og det indre øre. Denne protokollen viser også hvordan å isolere hammeren, ambolten og stigbøylen fra det auditive bulla. Til slutt viser det hvordan å orientere auditive Bulla og kapsel for innebygging i forberedelse til vev seksjonering av auditive ossicles.
Her presenterer vi en metode nyttig å isolere det auditive Bulla og kapsel i postnatal mus. Før P12, vev er skjør og kan bli skadet under isolasjon. Etter P12, kan det auditive Bulla og kapsel lett bli isolert fra omkringliggende vev. Dissekere bulla fra hodet før seksjonering har flere fordeler. Først postnatal kavitasjon og vekst av auditiv bulla skje mest aktivt fra P6 og utover, og er ferdig med P14 50. Den mesenchymale vev mellom trommehinnen og cochlea vegg er erstattet av luft gjennom kavitasjon prosessen. Den resulterende luften i mellomøret hulrom kan hindre kontakt mellom vev og væsker under fiksering, avkalking og innstøping. Det er lettere å fjerne luft fra den isolerte auditive bulla ved å kutte av fremre enden (styliform prosess) heller enn å prøve å gjøre det i unisolated bulla. For det andre er ikke vertikal orientering av hammeren (og trommehinnen)i hodet. Det er derfor lettere å seksjonen hammeren i ønskede plan ved å bygge den isolerte auditive Bulla og kapsel i en gitt retning.
Når isolert, hørbar bulla og kapsler er anvendbare for en rekke analyser. For eksempel, kan høy oppløsning røntgen mikro-CT åpenbare ben mikro morfologi såsom osteogene blodkar i hammeren 14. Den stereofluorescence dissekere mikroskop er et kraftig verktøy for å visualisere strukturer i å vurdere reporter mus som uttrykker fluorescerende proteiner i midten eller indre øret 33. I tillegg kan en rekke in vivo eller ex vivo fluorescens merkingsmetoder og hel montere immunfluorescens deteksjon foretas. Lett ark fluorescensmikroskopi er også nyttig for tre-dimensjonal analyse 51. Selv om det ikke er beskrevet her, ulike anatomiske strukturer assosiert med det auditive Bulla og kapsel som perifere nerver, blodårer, ogtrommehinnen i mellomøret kan også bli evaluert ved anvendelse av denne protokollen.
Merk at parafin seksjonering krever avkalking av bein vev før innebygging og derfor ikke tillater analyse av mineralisering. I motsetning til dette kan det Kawamoto filmmetode 43 som brukes for å fremstille frosne snitt utføres uten avkalking og er egnet for mineraliseringsstudier ved bruk av in vivo ben-merkingsteknikker eller spesielle flekker som Alizarin farging. Cryo-snittforhold skal være optimalisert ifølge basert på mus alder. For eksempel er en mindre kjølig temperatur inne i kryostaten kammeret anbefalt for eldre mus prøver å minimere skade på delene.
I mus, den korrekte betegnelsen for den prominente halvkuleformede utvekst av hammeren er "orbicular apophysis". Likevel har begrepet "processus brevis" blitt mye brukt til å indikere orbicular apophysis for mer then to tiår, særlig blant mus utviklings biologer 16,20,22-25. "Processus brevis" opprinnelig referert til den laterale fremgangsmåte (processus lateralis), som skiller seg fra den orbicular apophysis. Hos mennesker er en lateral fremgangsmåte som ligner en svakt konisk fremspring danner generelle linjen av tilknytning til trommehinnen, som strekker seg fra manubrium (ikke vist på figur 6B, mediale visning). I mus, er den laterale prosessen også en projeksjon av manubrium ved den motsatte ende til den umbo 48. Pars flaccida av trommehinnen er over side prosessen med hammeren. Orbicular apophysis er ikke tydelig i den menneskelige hammeren.
The authors have nothing to disclose.
The authors thank Masaki Yoda and Elise Lamar for critical reading of the manuscript, Kazumasa Takenouchi for help with histology, Mari Fujiwara for help with microscopy and Makoto Morikawa for help in photographing human and mouse auditory ossicles.
Tools/Equipment | |||
Paper towel | DAIO PAPER CORPORATION | 703347 | can be purchased from other vendors |
Glass Jar | Various | can be purchased from other vendors | |
14cm surgical scissors | Fine Science Tools (F.S.T.) | 91400-14 | can be purchased from other vendors |
Extra fine scissors-straight | Fine Science Tools (F.S.T.) | 14084-08 | can be purchased from other vendors |
Fine Forceps Angled 45° | Fine Science Tools (F.S.T.) | 11063-07 | can be purchased from other vendors |
Dissecting microscope | Nikon | SMZ800N | for routine dissection |
Dissecting microscope | Nikon | SMZ18 | for movies |
Injection needle 27G | TERUMO | NN-2719S | |
Syringe (1ml) | TERUMO | SS-01T | |
Marking Pin | Various | ||
Tube rotator RT-50 | TAITEC | 0000165-000 | can be purchased from other vendors |
Cryostat | Leica | CM3050S | http://www.leicabiosystems.com/histology-equipment/cryostats/details/product/leica-cm3050-s/ |
TC-65 Tungsten blade | Leica | 14021626379 | for Kawamoto's firm method |
Stainless containers | Leica | for Kawamoto's firm method | |
Cryofilm type IIC | Leica | for Kawamoto's firm method | |
Silane coated slide (New Silane II) | Muto Pure Chemicals | 511617 | can be purchased from other vendors |
Cover glass | Matsunami | can be purchased from other vendors | |
Tissue processor | Sakura Finetek | VIP-5 | can be purchased from other vendors |
Tissue Embedding Console System | Sakura Finetek | Tissue-Tek TEC 5 | can be purchased from other vendors |
Sliding microtome for paraffin | Yamato Kohki Industrial | REM-710 | can be purchased from other vendors |
Path Blade+pro for hard tissue | Matsunami | PB3503C | for paraffin section |
Micro-CT | RIGAKU | R_mCT2 | http://www.rigaku.com/en |
Fluorescence microscope | KEYENCE | BZ-9000 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Reagents | |||
Isoflurane | Maruishi pharmaceutical Co. Ltd | ||
NaCl | wako | 191-01665 | for PBS |
KCl | wako | 285-14 | for PBS |
Na2HPO4 12H2O | wako | 196-02835 | for PBS |
KH2PO4 | wako | 287-21 | for PBS |
Paraformaldehyde(EM Grade) | TAAB | P001 | |
EDTA-2Na | wako | 15111-45 | |
Trizma base | Sigma | T1503-1KG | |
Super Cryoembedding Medium | Leica | for Kawamoto's firm method | |
Dry Ice | Various | for Kawamoto's firm method | |
Hexane | wako | 080-03423 | for Kawamoto's firm method |
Super Cryomouting Medium type R2 | Leica | for Kawamoto's firm method | |
Paraffin | Sakura Finetek | 781001A0107 | |
Histo-Clear | NDS | HS-200 | |
Calcein | DOJINDO | 340-00433 | |
Hematoxylin | wako | 131-09665 | |
Eosin | wako | 051-06515 |