We present a protocol to isolate the auditory bulla, capsule, and ossicles from postnatal mice for whole mount and histological analysis.
ほとんどの哺乳動物では、槌骨、きぬた骨とアブミ骨などの中耳内耳小骨は、最小の骨があります。マウスでは、骨構造は、聴覚カプセルは内耳、すなわち蝸牛および半規管を囲むのに対し、聴覚水疱は、小骨を収容呼ばれます。マウス耳小骨は、耳鼻咽喉科の分野の研究者に聞くので、大きな関心のために不可欠であるが、その代謝、開発、および進化が他の分野に非常に関連しています。変更された骨代謝は、成体マウスで聴覚機能に影響を与えることができ、様々な遺伝子欠損マウスは子宮内耳小骨の形態形成の変化を示しています。マウスの耳小骨は、小型であるが、一つはその解剖学的向きおよび3D構造を理解している場合、それらの操作が可能です。ここでは、出生後のマウスの聴覚水疱やカプセルを分析した後、水疱の一部を除去して、個々の小骨を分離する方法について説明します。また、議論する方法を全角に槌骨の、縦、横、または前頭セクションの調製に適したパラフィンまたは凍結切片を生成するために、異なる向きのベッド水疱やカプセル。最後に、我々はマウスとヒトの耳小骨の間の解剖学的な違いを列挙します。これらの方法は、耳小骨とマウスにおける中耳の、病理学的な発達と進化の側面を分析する上で有用であろう。
中耳、すなわち槌骨、きぬた骨、およびアブミ骨の3耳小骨は、内耳、または蝸牛1,2に鼓膜からの音を伝達する哺乳類特有の聴覚チェーンを形成します。聴覚機能は、聴覚脳幹反応(ABR)3-6と、レーザドップラ振動計(LDV)7を用いてモニターすることができる鼓膜の背後槌骨の振動が閾値を測定することにより、マウスにおいて評価することができます。 ABR、LDV、及び歪み製品耳音響放射(DPOAE)の測定値を組み合わせることによって、導電性難聴は、感覚障害8から判別することができます。
耳の条件の動物モデルは、すべての年齢層の患者の幸福に聞くと耳の健康の重要性を与え、必要とされています。例えば、中耳炎は、人間の幼児や子供に見られる非常に一般的な耳の感染症であり、コンディ場合重度の、急性中耳炎とその合併症が発生する可能性がありますションは、適切な抗菌剤9で処理されていません。中耳炎のマウスモデルは、病因を理解するとトリートメント10,11の開発に有用であることを証明できました。
軟骨内骨化12,13によって形成されている(槌骨のgoniale一部を除く)は、マウス耳小骨は、骨代謝および形態形成の研究に非常に関連しています。まず、それらの小さなサイズは、X線または蛍光顕微鏡14を用いて、無傷の骨膜と骨の高分解能の分析を可能にします。第二に、このような骨細胞15の間で過不足骨吸収、または減損相互作用などの異常な骨代謝は、損失3,4,7を聞いへの潜在的な貢献者として分析することができます。第三に、異常な小骨の形態形成は、Hoxa2 16-19、MSX1 20-22、Prrx1 23、 グースコイドを欠く動物などのいくつかの遺伝子欠損マウスで報告されています(GSC)24,25、Bapx1 13、Tshz1 26、DUSP6(Mkp3)27、 ノギン ( ノーグ )28、FGFR1 29、甲状腺ホルモン受容体(THRA、THRB)5、Bcl2の 30と他1,31、または過剰発現マウスでHoxa2 32。最後に、その小さなサイズにもかかわらず、このような筋肉33や関節34,35など耳小骨に関連付けられている構造がアクセス可能です。
マウスの小骨は、人間の耳小骨よりも小さいですが、マウス中耳は、そのヒト対応のミニチュア版ではないことは注目に値します。ヒトでは、胚のあぶみ骨動脈が妊娠中に消えたのに対し、例えば、マウスでは、アブミ骨のリングを通過あぶみ骨動脈は、人生36を通じて持続します。また、マウスの槌骨の形態は、目と異なります電子人骨( 図6を参照)。ヒトでは、側頭骨に骨梁で構成乳様突起空気電池は小骨ではなく、水疱37を収容するのに対し、マウスでは、聴覚(鼓膜)水疱は、空気で満たされた中耳腔を囲みます。両種では、聴覚カプセル(耳のカプセル、骨迷路)は、蝸牛および内耳の三半規管を囲みます。中耳の比較と進化生物学は広範囲に38-40を検討されています。
最初の下に設けられたプロトコルはそれぞれ、中耳と内耳の主に構成され、聴覚水疱やカプセルを分析する方法について説明します。このプロトコルはまた、聴覚ブラから槌骨、きぬた骨とアブミ骨を分離する方法を示しています。最後に、耳小骨の組織切片の準備のために埋め込むための聴覚水疱やカプセルを配向する方法を示しています。
ここでは、出生後のマウスにおける聴覚水疱やカプセルを分離するのに有用な方法を提示します。 P12の前に、組織が脆弱であり、単離の間に損傷を受けることができます。 P12の後、聴覚水疱およびカプセルは簡単に周囲の組織から単離することができます。切片の前に頭から水疱を解剖することは、いくつかの利点があります。まず、出生後のキャビテーションと聴覚胞の成長が最も活発以降P6から発生し、P14 50によって完了しています。鼓膜と蝸牛の壁との間の間葉組織は、キャビテーション過程を通じて空気によって置き換えられます。中耳腔で得られた空気は、固定、脱灰と埋め込み時の組織と液体の間の接触を妨げることができます。むしろ非絶縁ブラでそうしようとするよりも、前端(styliformプロセス)を切断することにより、単離された聴覚水疱から空気を除去することが容易です。第二に、槌骨(および鼓膜)の向きは垂直ではありません頭インチこれは、与えられた向きに孤立した聴覚水疱やカプセルを埋め込むことにより望ま面での槌骨部分に容易です。
分離された後は、聴覚水疱およびカプセル剤は、多数の分析のために有用です。例えば、高分解能X線マイクロCTは、槌骨14内の骨形成の毛細血管などの骨微細構造の形態を明らかにすることができます。 stereofluorescence解剖顕微鏡は、中・内耳33中の蛍光タンパク質を発現するレポーターマウスを評価する際に構造を可視化するための強力なツールです。加えて、in vivoまたはex vivo蛍光標識法と全載免疫蛍光検出における種々に実施することができます。光シート蛍光顕微鏡は、3次元解析51のために有用です。ここで説明されていないが、多様な解剖学的構造は、末梢神経、血管などの聴覚水疱やカプセルに関連付けられている、と中耳内の鼓膜は、このプロトコルを使用して評価することができます。
パラフィン切片を埋め込むため、鉱化作用の解析を許可していない前に、骨組織の脱灰を必要とすることに注意してください。対照的に、凍結切片を調製するために使用されるカワモト膜方法43は、脱灰せずに行われ、アリザリン染色としてインビボ骨標識法や特殊染色に用いた石灰化の研究に適していることができます。クライオセクショニング条件は、マウスの年齢に基づい応じて最適化する必要があります。例えば、クライオスタットチャンバ内の少ない涼しい温度はセクションへのダメージを最小限に抑えるために古いマウスの試験片をお勧めします。
マウスでは、槌骨の顕著な半球状の突起の正しい用語は「輪骨端」です。それにもかかわらず、用語「突起ブレビス」は広く、より番目のための輪骨端を示すために使用されています特にマウスの発達生物学者の間で二十年、16,20,22-25。 「突起ブレビス」もともと輪骨端とは異なる横プロセス(突起が外側の)、と呼ばれます。ヒトでは、わずかに円錐状突起に似た横方向のプロセスは、( 図6B、内側のビューでは見られない)胸骨柄から延びる、鼓膜への取り付けの一般的なラインを形成しています。マウスでは、横方向のプロセスは、突起物48の反対側の端部で胸骨柄の投影です。鼓膜の扁平部flaccidaは槌骨の横方向のプロセスを上回っています。輪骨端は、人間の槌骨に明らかではありません。
The authors have nothing to disclose.
The authors thank Masaki Yoda and Elise Lamar for critical reading of the manuscript, Kazumasa Takenouchi for help with histology, Mari Fujiwara for help with microscopy and Makoto Morikawa for help in photographing human and mouse auditory ossicles.
Tools/Equipment | |||
Paper towel | DAIO PAPER CORPORATION | 703347 | can be purchased from other vendors |
Glass Jar | Various | can be purchased from other vendors | |
14cm surgical scissors | Fine Science Tools (F.S.T.) | 91400-14 | can be purchased from other vendors |
Extra fine scissors-straight | Fine Science Tools (F.S.T.) | 14084-08 | can be purchased from other vendors |
Fine Forceps Angled 45° | Fine Science Tools (F.S.T.) | 11063-07 | can be purchased from other vendors |
Dissecting microscope | Nikon | SMZ800N | for routine dissection |
Dissecting microscope | Nikon | SMZ18 | for movies |
Injection needle 27G | TERUMO | NN-2719S | |
Syringe (1ml) | TERUMO | SS-01T | |
Marking Pin | Various | ||
Tube rotator RT-50 | TAITEC | 0000165-000 | can be purchased from other vendors |
Cryostat | Leica | CM3050S | http://www.leicabiosystems.com/histology-equipment/cryostats/details/product/leica-cm3050-s/ |
TC-65 Tungsten blade | Leica | 14021626379 | for Kawamoto's firm method |
Stainless containers | Leica | for Kawamoto's firm method | |
Cryofilm type IIC | Leica | for Kawamoto's firm method | |
Silane coated slide (New Silane II) | Muto Pure Chemicals | 511617 | can be purchased from other vendors |
Cover glass | Matsunami | can be purchased from other vendors | |
Tissue processor | Sakura Finetek | VIP-5 | can be purchased from other vendors |
Tissue Embedding Console System | Sakura Finetek | Tissue-Tek TEC 5 | can be purchased from other vendors |
Sliding microtome for paraffin | Yamato Kohki Industrial | REM-710 | can be purchased from other vendors |
Path Blade+pro for hard tissue | Matsunami | PB3503C | for paraffin section |
Micro-CT | RIGAKU | R_mCT2 | http://www.rigaku.com/en |
Fluorescence microscope | KEYENCE | BZ-9000 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Reagents | |||
Isoflurane | Maruishi pharmaceutical Co. Ltd | ||
NaCl | wako | 191-01665 | for PBS |
KCl | wako | 285-14 | for PBS |
Na2HPO4 12H2O | wako | 196-02835 | for PBS |
KH2PO4 | wako | 287-21 | for PBS |
Paraformaldehyde(EM Grade) | TAAB | P001 | |
EDTA-2Na | wako | 15111-45 | |
Trizma base | Sigma | T1503-1KG | |
Super Cryoembedding Medium | Leica | for Kawamoto's firm method | |
Dry Ice | Various | for Kawamoto's firm method | |
Hexane | wako | 080-03423 | for Kawamoto's firm method |
Super Cryomouting Medium type R2 | Leica | for Kawamoto's firm method | |
Paraffin | Sakura Finetek | 781001A0107 | |
Histo-Clear | NDS | HS-200 | |
Calcein | DOJINDO | 340-00433 | |
Hematoxylin | wako | 131-09665 | |
Eosin | wako | 051-06515 |