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Biochemistry

Kartierung der Bindungsstelle eines Aptamer auf ATP Mit Micro Thermophorese

Published: January 7, 2017 doi: 10.3791/55070
Automatic Translation
1, 1
12bind GmbH

Introduction

Wechselwirkung zwischen Molekülen ist die Basis der Natur. Daher Wissenschaftler in vielen Bereichen der Grundlagen- und angewandten Forschung versuchen die grundlegenden Prinzipien der molekularen Wechselwirkungen verschiedener Arten zu verstehen. Micro Thermophorese (MST) können Wissenschaftler die schnelle, präzise und kosteneffiziente und qualitätskontrollierte Charakterisierung von molekularen Wechselwirkungen in Lösung durchzuführen, mit einer freien Wahl von Puffern. Es gibt bereits mehr als 1.000 Publikationen MST mit, ab 2016 allein, beschreibt verschiedene Arten von Analysen, einschließlich Bibliothek Vorführungen, Ereignis Validierungen Bindung, kompetitive Assays, und Experimente mit mehreren Bindungspartnern 1-8. Im Allgemeinen erlaubt MST die Untersuchung der klassischen Bindungsparameter wie Bindungsaffinität (pM bis Mm), Stöchiometrie und Thermodynamik, der jede Art von molekularen Wechselwirkungen. Ein großer Vorteil der MST ist die Fähigkeit, Bindungsereignisse unabhängig von der Größe der Interaktionspartner zu studieren. Auch Heraus-fordernd Wechselwirkungen zwischen kleinen Nukleinsäure-Aptamere (15-30 nt) und Ziele wie kleine Moleküle, Medikamente, Antibiotika oder Metaboliten quantifiziert werden können.

Aktuelle state-of-the-art Technologien Aptamer-Target - Wechselwirkungen sind entweder im Labor intensiv und sehr komplex zu charakterisieren oder scheitern Aptamer-kleines Molekül 9,10 Wechselwirkungen zu quantifizieren. Oberflächenplasmonresonanz (SPR) -basierte Assays 11,12 und wirklich markierungsfreie kalorimetrischen Ansätze wie Isothermen Titrations - Kalorimetrie (ITC) 13-15, isokratische Elution 16, Gleichgewicht Infiltrations 17,18, in-line Sondieren 19, Gel- Shift - Assays, Stopped fl ow Fluoreszenz- Spektroskopie 20,21, Fluoreszenzanisotropiemessungen (FA) 22,23, Einzelmolekül - Fluoreszenz - Bildgebung 24,25 und Bio-Schicht - Interferometrie (BLI) 26 sind ebenfalls entweder ungenau oder nicht kompatibel mit Aptamer-kleines Molekül Wechselwirkungen. Andere principal Probleme dieser Verfahren sind eine geringe Empfindlichkeit, hohe Probenverbrauch, Immobilisation, Massentransportbeschränkungen auf Oberflächen und / oder Puffer Einschränkungen. Nur wenige dieser Technologien bieten integrierte Kontrollen für die Aggregation und Adsorption Effekte.

MST stellt ein leistungsfähiges Werkzeug für Wissenschaftler , diese Einschränkung zu überwinden , um die Wechselwirkungen zwischen Aptamere und kleine Moleküle , 27-29, sowie andere Ziele, wie Proteine 30-33 zu studieren. Die Technologie beruht auf der Bewegung von Molekülen durch Temperaturgradienten. Diese gerichtete Bewegung, die so genannte "Thermophorese," hängt von der Größe, der Ladung und Hydrathülle des Moleküls 34,35. Die Bindung eines Liganden an das Molekül direkt an mindestens einen dieser Parameter zu verändern, in einer veränderten thermophoretische Mobilität führt. Liganden mit kleinen Größen haben nicht erhebliche Auswirkungen in Bezug auf die Größenänderung von der ungebundenen zum gebundenen Zustand, aber sie können dr haben amatic Auswirkungen auf die Hydrathülle und / oder Ladung. Die Veränderungen in der thermophoretische Bewegung der Moleküle nach der Wechselwirkung mit dem Bindungspartner ermöglicht die Quantifizierung der Grundbindungsparameter 2,7,34,36,37.

Wie in 1A dargestellt ist , besteht der MST Vorrichtung eines Infrarotlasers auf die Probe innerhalb der Glaskapillaren fokussiert die gleiche Optik wie für die Fluoreszenzdetektion. Die thermophoretischer Bewegung von Proteinen über die Eigenfluoreszenz von Tryptophane 6 oder eines fluoreszierend 3,8 Interaktionspartner markiert überwacht werden kann , während der Laser einen Temperaturgradienten (AT von 2-6 ° C) herstellt. Die sich ergebende Temperaturdifferenz im Raum, & Delta; T, führt zur Verarmung oder Anreicherung von Molekülen im Bereich der erhöhten Temperatur, die durch die Soret quantifiziert werden kann Koeffizienten (S T):

g "/>

c hot stellt die Konzentration in dem erwärmten Bereich, und c kalt ist die Konzentration in dem anfänglichen Kaltbereich.

Wie in 1B gezeigt , um eine typische MST Versuchsergebnisse in einer MST Bewegungsprofil (Zeitverlauf), die aus verschiedenen Phasen, die durch ihre jeweiligen Zeitrahmen getrennt werden können. Die anfängliche Fluoreszenz wird in den ersten 5 s in Abwesenheit des Temperaturgradienten gemessen, um die genaue Start Fluoreszenz zu definieren und für Photobleaching oder photoenhancement zu überprüfen. Der Temperatursprung (T-Jump) repräsentiert die Phase, in der die Fluoreszenzänderungen vor thermophoretischer Bewegung. Diese anfängliche Abnahme der Fluoreszenz hängt von wärmeabhängige Veränderungen von fl uorophore Quantenausbeute. Die Thermophorese Phase folgt, in der die Fluoreszenz abnimmt (oder zunimmt) aufgrund der thermophoretische Bewegung der Moleküle, bis die Stationärzustandsverteilung erreicht wird.Die umgekehrte TJump und die gleichzeitige Rückdiffusion der fluoreszierenden Moleküle können wie in 1B angegeben beobachtet werden , nachdem der Laser ausgeschaltet ist. Um grundlegende Bindungsparameter, verschiedene Molverhältnisse der Interaktionspartner für den Zugriff werden analysiert und verglichen. Typischerweise werden 16 unterschiedliche Verhältnisse in einem MST Experiment untersucht, wohingegen der optische sichtbaren Molekül konstant gehalten wird und mit zunehmender Menge des unmarkierten Liganden zugeführt wird. Die Wechselwirkung zwischen den beiden Bindungspartner induziert Veränderungen in der Thermophorese, und somit in der normalisierten Fluoreszenz, F Norm, die wie folgt berechnet wird:

Gleichung

F heiß und F kalt stellen Intensitäten fluoreszenz bei de fi nierten Zeitpunkte der MST Spuren gemittelt. Bindungsaffinitäten (K d oder EC 50 -Werte) können durch curv berechnet werdene Fitting (1C).

Insgesamt ist MST ein leistungsfähiges Werkzeug molekularen Wechselwirkungen jeglicher Art zu studieren. Dieses Manuskript bietet ein Protokoll das herausfordernde Interaktion zwischen dem kleinen Molekül Adenosintriphosphat (ATP; 0,5 kDa) zu charakterisieren und die 25-nt kurze ssDNA Aptamer DH25.42 (7,9 kDa). Im Laufe des Manuskripts wird die Bindungsstelle des Aptamers an das ATP-Molekül an die Adenin-Gruppe des ATP kartiert unten.

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Protocol

1. Vorbereitung der Aptamer-Funktion Stock

  1. Folgen Sie den Anweisungen des Herstellers und lösen das Oligonukleotid (5-Cy5-CCTG GGGGAGTATTGCGGAGGAAGG-3, Sequenz aus Referenz 18) in Wasser, einer 100-uM Endkonzentration zu erreichen.
  2. Bereiten Sie die Aptamer - Arbeitslösung durch Verdünnen des Oligonukleotid - Lager auf 200 nM mit Bindungspuffer (20 mM Tris, pH 7,6; 300 mM NaCl, 5 mM MgCl 2; 0,01% Tween 20).
  3. Inkubieren Sie die Mischung für 2 min bei 90 ° C, lassen Sie sofort die Probe auf Eis abkühlen, und die Probe bei Raumtemperatur verwenden.

2. Herstellung der Ligand Verdünnungsreihe

  1. Für jeden Liganden (Adenosin-Triphosphat (ATP), Adenosindiphosphat (ADP), Adenosinmonophosphat (AMP), Adenin, Guanosin-Triphosphat (GTP), Cytosin-triphosphat (CTP), Desoxyadenosintriphosphat (dATP) und S-Adenosylmethionin (SAM) ; jeweils) 10 mM Lager, bereiten Sie einen 16-stufigen seriellen dilutiauf in 200 & mgr; l Mikroreaktionsröhrchen.
    HINWEIS: Die Zentrifugation von Ligand Bestände für 5 min bei 14000 xg helfen können Aggregate zu entfernen. Geringes Volumen, geringe Bindungsreaktionsrohre werden empfohlen Adsorption von Molekülen an den Rohrwänden zu vermeiden.
  2. Beginnen mit einer maximalen Konzentration von mindestens 50 mal höher ist als die geschätzte Affinität und Verringerung um 50% in jedem Verdünnungsschritt die Ligandenkonzentration.
    HINWEIS: Die Konzentration finder Werkzeug in die Steuerungssoftware implementiert simuliert Bindungsdaten und hilft bei der richtigen Konzentrationsbereich für die Verdünnungsreihe finden.
  3. Füllen Sie 20 ul des Liganden Lager (10 mM) in Rohr 1. Fügen Sie 10 ul Aptamer-Bindungspuffer in Mikroreaktionsrohre 2 bis 16.
  4. Transfer 10 ul Rohr 1 bis Rohr 2 und ordnungsgemäß durch Auf- und Abpipettieren mehrmals mischen. Übertragen Sie 10 & mgr; l in die nächste Röhre und wiederholen Sie diese Verdünnung für die verbleibenden Rohre.
  5. Entsorgen Sie die 10 ul Überschuss aus dem letzten Rohr. Vermeiden Sie bUffer Verwässerungseffekte. Der Puffer in Rohr 1 und in Röhrchen 2-16 müssen identisch sein.

3. Herstellung der endgültigen Reaktions Mix

  1. Bereiten Sie die einzelnen Bindungsreaktionen mit einem Volumen von 20 & mgr; l (10 & mgr; l Arbeitslösung Aptamer + 10 & mgr; l des jeweiligen Liganden Verdünnung) Pipettierfehler zu minimieren. Ein Volumen von nur 4 ul reicht aus ll die Kapillare zu fi nden.
  2. In 10 ul der 200 nM Aptamer-Arbeitslösung zu 10 & mgr; l jedes Liganden Verdünnung und mischen richtig durch Auf- und Abpipettieren mehrmals.
  3. Inkubiere die Proben für 5 min bei Raumtemperatur und fi ll die Proben in Standard-Kapillaren durch die Kapillaren in die Probe eingetaucht wird. Längere Inkubationszeiten können für einige Wechselwirkungen erforderlich sein; jedoch 5 min ist ausreichend für die meisten. Berühren die Kapillaren nur an den Seiten, nicht auf dem mittleren Teil, wo die optische Messung genommen wird.
  4. Legen Sie die Kapillaren auf the Kapillar-Fach und die MST-Gerät starten.

4. Starten des MST-Gerät

HINWEIS: Das Gerät verfügt über zwei vorinstallierte Software-Pakete, die '' control "Software für den technischen Aufbau der experimentellen Bedingungen und der '' Analyse" Software für die Interpretation der erzeugten Daten.

  1. Vor der Platzierung der Kapillare Fach in die MST-Gerät, starten Sie die Steuerungssoftware und stellen Sie die gesamte gewünschte Temperatur von 'Auswahl von' ermöglichen Steuerung manueller Temperatur "in der '' Temperaturregelung" Drop-Down-Menü. Einstellen der Temperatur auf 25 ° C in dieser Weise.
    HINWEIS: Die MST Instrumente können von 22 bis 45 ° C temperiert werden.
  2. Warten, bis die Temperatur das erwartete Niveau zu erreichen, und legen Sie dann die Kapillare Fach in die MST-Gerät.
  3. Stellen Sie den LED-Kanal '' rot "für Cy5 Farbstoffen und stellen Sie die LED-Leistung ein fl uorescenc zu gewinnene Signal von 300 bis 1000 Fluoreszenzeinheiten an der MST-Gerät mit einem Standard-Sensor. 25% LED-Leistung wird in dieser Studie verwendet.
    HINWEIS: 6.000 bis 18.000 Fluoreszenzeinheiten für die MST mit einem hochempfindlichen Sensor empfohlen.

5. Kapillar-Scan

  1. Führen Sie eine Kapillare Scan verschiedene Qualitätsaspekte der Probe zu überprüfen, indem die Kapillare Position auf der "Control" Software ein und klicken auf "Start Kappe scan" bevor die MST-Messung starten.
  2. Überprüfen Sie die Kapillar-Scan für Fluoreszenzverstärkung / Lösch- und Klebeeffekte (U-förmige oder abgeflachte Spitzen) in der Software.
    HINWEIS: Weitere Informationen über die Erkennung und Behandlung von Fluoreszenz und Klebeeffekte können in der Diskussion zu finden.

6. MST Mess

HINWEIS: Vor der Messung MST beginnen, stellen Sie sicher, dass Effekte, Verbesserung / Löscheffekte auszuschließen kleben, oderPipettierfehler, und sicherzustellen, dass die Kapillare Scan zeigt, dass die Fluoreszenz- Signal reicht aus. Weitere Details, die Diskussion.

  1. Ordnen die Ligandenkonzentrationen aus der Verdünnungsreihe auf die jeweilige Kapillare Position in der '' control "Software Betrachten der Verdünnungsschritt das Aptamer und dem Liganden zu mischen. (1: 1).
  2. Geben Sie die höchste Konzentration an Ligand (5 mM) für kapillare # 1, wählen Sie die richtige Verdünnung (hier 1: 1), klicken Sie auf die maximale Konzentration, und verwenden Sie die Drag-Funktion, um automatisch die verbleibenden Konzentrationen in Kapillaren zuweisen # 2- 16. Die niedrigste Konzentration ist 152,6 nM.
  3. Geben Sie die Konzentration des Fluoreszenz- Aptamer (hier 100 nM) in dem jeweiligen Abschnitt der Steuerungssoftware.
  4. Verwenden Sie die Standardeinstellungen, die die fluoreszenz für 5 Sekunden erkennen, notieren Sie die MST für 30 Sekunden, und notieren Sie die Fluoreszenz für weitere 5 Sekunden nach der Inaktivierung des Lasers t o die Rückdiffusion von Molekülen zu überwachen.
  5. Stellen Sie die Laserleistung auf 20% in dem jeweiligen Abschnitt der Steuersoftware.
    ANMERKUNG: Um das beste Signal-zu-Rausch-Verhältnis zu erhalten und zu unspezifischen Effekte zu vermeiden, wird eine Laserleistung von 20-40% empfohlen. In bestimmten Fällen kann eine höhere Laserleistung eine gute Trennung von ungebundenen und gebundenen Moleküle zu erhalten erforderlich.
  6. Speichern Sie das Experiment nach den Zielordner auswählen und auf die MST Messung starten durch Drücken der '' Start MST Messung "-Taste.
    HINWEIS: Die .ntp Datei im Zielordner erzeugt wird. Mit diesem Setup dauert eine Messung 10-15 min.
  7. Wiederholen Sie die experimentellen Verfahren mindestens zweimal für eine genauere Bestimmung des Wertes 50 EC.
    HINWEIS: Um die technische Reproduzierbarkeit zu testen, können die gleichen Kapillaren mehrmals gescannt werden (technische Wiederholungen).

7. MST Datenanalyse

nt "> Hinweis: Die Analyse - Software die Analyse von Daten über die fl y während der Messung ermöglicht die Analyse - Software , die MST Zeit Spuren und Veränderungen in der normierten Fluoreszenz- (F Norm) gegen die Ligandenkonzentration 37 aufgetragen ist ..

  1. Starten Sie die MST-Analyse-Software (MO.Affinity Analysis) und laden Sie die .ntp Datei aus dem Zielordner. Wählen Sie "MST" als Analysetyp in der Datenauswahlmenü.
    HINWEIS: Bei Liganden-abhängige Fluoreszenzeffekte kann die anfängliche Fluoreszenz zur Analyse ausgewählt werden.
  2. Fügen Sie die entsprechenden technischen oder biologischen Lauf (s) einer neuen Analyse per Drag-and-Drop oder über die Schaltfläche "+" unterhalb der jeweiligen Versuchslauf drücken.
  3. Drücken Sie die Informationstaste unterhalb der jeweiligen Versuchslauf zu erhalten Informationen über die Eigenschaften des Experiments MST Spuren, Kapillar-Scan, Kapillar-Form, anfängliche Fluoreszenz und Bleichrate.
    Hinweis: Diese Rohdaten können also in späteren Schritten der Analyse überprüft werden.
  4. die MST Spuren für die Aggregation und Fällung Effekte sichtbar, wie Beulen und Spikes einer Sichtprüfung.
    HINWEIS: Weitere Informationen über die Erkennung und Behandlung von Aggregationseffekten, lesen Sie die Diskussion.
  5. die kapillare Scan und die kapillare Form Overlay für Adsorptionseffekten, sichtbar als abgeflacht oder U-förmigen Spitzen Sichtprüfung. Eine Sichtprüfung des Kapillar-Scan und die anfängliche Fluoreszenz für Fluoreszenzeffekte. Sichtprüfung für Photobleaching Auswirkungen der Bleichrate.
  6. Wechseln Sie auf die Dosis-Wirkungs-Modus und ändern Sie die Analyse-Einstellung auf "Experten" -Modus indem Sie die entsprechende Taste drücken. Wählen Sie "T-Jump", wie die MST Bewertungsstrategie.
  7. Wählen Sie den "Hügel" Modell für die Kurve Armatur. Die Bindungsparameter werden automatisch berechnet. Normalisieren der Daten durch die jeweilige Art der Normalisierung in der "vergleichen Sie die Ergebnisse" Menü wählen. exportieren Sie dieDaten entweder als .xls oder .pdf.
    HINWEIS: Die unten stehende Tabelle der Bindungs ​​Diagramm fasst die berechneten Bindungsparameter.

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Representative Results

In dieser Studie wurde MST die Bindungsstelle des DNA - Aptamer DH25.42 18 an ATP zu charakterisieren aufgetragen. Im Gegensatz zu anderen Studien , die die Wechselwirkung von ATP oder ATP-nachahmt kleine Moleküle mit Proteinen zufällig markiert mit einem oder mehreren Fluorophoren 38-40 charakterisierenden umfasst diese Studie eine markierte Version des 7,9 kDa ssDNA Aptamer mit einem Cy5 - Molekül am 5'Ende . Verschiedenen ATP-Derivate und verwandte Moleküle, die alle aus ATP in verschiedenen Positionen unterscheiden, wurden verwendet, um die Bindungsstelle auf dem ATP-Molekül zu kartieren. Verdünnungsreihe (in 16 Schritten, die Liganden-Konzentration von jeweils 50% Verringerung) wurden über die verschiedenen Liganden hergestellt und mit einer konstanten Menge an Cy5-markiertes Aptamer. Die Proben wurden LED und 20% der Laserleistung bei 25% in Standard Kapillaren analysiert. Bewegungsprofile (MST Zeitspuren) wurden aufgezeichnet und Fluoreszenzeinheiten, aus dem T-Jump Phase abgeleitet wurden gegenüber dem Ligand concentr aufgetragenation (vergleiche Abbildung 1C). Die Kurvenanpassung wurde durchgeführt , der Hill - Gleichung anwenden, was zu einer EC 50 Werte. In 5 unabhängigen biologischen Wiederholungen (4 verschiedene Operatoren, 2 verschiedene Aptamer Aktien, 2 verschiedene ATP - Aktien), zeigt die ATP-Aptamer - Interaktion eine negative Binde Amplitude von 6 bis 13 Einheiten und eine durchschnittliche 50 EC - Wert von 52,3 ± 5,0 uM (2A ). Fehlerbalken in den Bindungsdiagramme und "±" dargestellt in den Affinitätsdaten stellen die Standardabweichung von 5 biologische repeats (5 unabhängige Messungen in einer anderen Kapillare). Zuvor berichtet Affinitäten für die Wechselwirkung des DH25.42 Aptamer mit [2,8,5'- 3 H] -Adenosin und ATP - Agarose waren vergleichbar. Die Wechselwirkung von radiomarkiertem Adenosin mit dem Aptamer wurde durch einen Zentrifugalfilter Assay quantifiziert, und eine Affinität (K d) von 6 ± 3 & mgr; M bestimmt. Isocratic Elutionsexperimente mit ATP immobilized um in einer Affinität (K d) führte Agarose von 13 uM 18,41.

Zum besseren Seite-an-Seite-Vergleich, können die Daten auf den Anteil an komplexiertem Moleküle normalisiert werden (Fraktion gebunden, FB) mittels der folgenden Gleichung:
Gleichung
wo Wert (c) der MST - Wert für die Konzentration c gemessen wird, ist frei der MST Wert für den ungebundenen Zustand (niedrigste Konzentration) und komplexiert ist der MST - Wert für den vollständig gebundenen Zustand (2B). Diese Normierung ist ideal , um die Ergebnisse der verschiedenen Liganden in einem Diagramm vergleichen zu können , wie in 2C gezeigt. Die detektierten Affinitäten von ADP (63,6 ± 5,9 uM in biologischen Dubletten), AMP (91,6 ± 9,1 uM in biologischen Dubletten) und SAM (44,4 ± 3,2 uM in biologischen Dubletten), die von ATP in den nu abweichenmber von Phosphatgruppen, bedeuten , dass diese Position auf das Bindungsverhalten des Aptamer (2C und D) keine oder nur geringe Einfluss hat. Die OH-Gruppe an der C2-Kohlenstoffatom der Ribose von ATP auch davon, dass die Hauptbindungsstelle ausgeschlossen werden konnte, da dATP auch durch das Aptamer mit einer leicht reduzierten Affinität (64,4 ± 6,1 uM in biologischen Dubletten) gebunden war. Ändern der Purin-Gruppe von ATP an die Pyrimidin-Gruppe CTP resultierte in unverbindlicher des Aptamer, die Bedeutung dieser Gruppe für die Interaktion zu demonstrieren. Das Aptamer gebunden Adenin mit einer Affinität von 141,7 ± 9,4 uM (in biologischen Dubletten), was zeigt, dass die Bindungsstelle in diesem Teil der ATP-Molekül sein muß. Die Purin - Moleküle GTP und ATP unterscheiden sich in der grünen schattierten Bereich dargestellt in 2D, die das Hauptbindungsstelle des Aptamers an ATP steht. Eine andere Studie verwendete nicht-quantitative Elution Experimente mit verschiedenen ATP-DerivateEluieren einer radioaktiv markierten Aptamer von ATP - Agarose, die 18 vergleichbare Ergebnisse zu dieser MST - Studie zeigte.

Figur 2
Abbildung 1: Micro Thermophorese. (A) Die technische Einrichtung der MST - Technologie gezeigt. Die Optik Fokus auf der Mitte der Glaskapillare, wodurch das Fluoreszenzsignal des optisch sichtbaren Molekül detektierenden. Ein IR-Laser verwendet wird, um einen Temperaturgradienten in dem Beobachtungsfenster des optischen Systems zu etablieren. Veränderungen der Fluoreszenz kann verwendet werden , um die thermophoretischer Bewegung der Moleküle in Lösung (B) MST Zeit - Trace-Bewegung pro fi le von Molekülen in einem Temperaturgradienten zu überwachen. Die anfängliche Fluoreszenz wird für 5 Sekunden gemessen, während der Laser ausgeschaltet ist. Einschalten des Lasers erzeugt einen Temperaturgradienten. Nach dem sofortigen T-Jump phase, in dem die Fluoreszenzfarbstoff seine Signalausbeute bei der Wärmeinduktion abnimmt, nimmt die thermophoretischer Bewegung und wird für 30 Sekunden beobachtet. Nachdem der Laser ausgeschaltet wird, diffundieren die Moleküle zurück. (C) Die Ergebnisse eines typischen Experimentes MST: (links) 16 Kapillaren die gleiche Konzentration an fluoreszierenden Molekül und eine zunehmende Konzentration des unmarkierten Liganden enthält; die Zeitspuren MST auf ihre Anfangsfluoreszenz erfasst und normalisiert. (Rechts) Die normalisierte fluoreszenz; die Differenz zwischen F und F kalt hot wird gegen die Konzentration des Liganden aufgetragen. Eine Kurvenanpassung dieser Daten Ausbeuten Bindungsparameter, wie beispielsweise die Bindungsaffinität. Re-Print mit Genehmigung von Elsevier, Methoden 28; Lizenznummer 3890230800113. Bitte klicken Sie hier eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 2
Abbildung 2: MST Datenanalyse. (A) Die Basislinie normalisierte fluoreszenz AF - Norm (‰) korrigiert, abgeleitet von der MST TJump Signal, wird gegen die ATP - Konzentration aufgetragen (in uM). Die Hill - Gleichung (EC 50) wurde für die Kurvenanpassung angewandt. Die Fehlerbalken stellen die Standardabweichung von fünf biologischen repeats. (B) Fraction gebundenen Plot der in A. gezeigten Daten den jeweiligen Datensätzen auf den Anteil normiert wurden gebunden, und der Durchschnitt dieser normalisierten Daten wird in der Bindungs Graph dargestellt. Die Fehlerbalken zeigen die Standardabweichung von 5 biologischen Wiederholungen. (C) Der Anteil gebundenen Graph zeigt einen quantitativen Vergleich (Hill fit) der verschiedenen Liganden an das Aptamer. Die Fehlerbalken stellen die Standard deviation von zwei biologischen Wiederholungen. (D) Bindung Affinitäten (EC 50) unterschiedlicher Liganden an das Aptamer. Der grüne schattierte Bereich zeigt die Bindungsstelle des Aptamer auf der Adenin-Gruppe von ATP. Diese Zahl wird von Elsevier modifiziert, Methoden 28; Lizenz-Nummer 3890230800113. Die Datensätze aus der früheren Studie werden im Rahmen dieser Studie erneut analysiert und erweitert. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 3
Abbildung 3: Assay - Optimierung für MST Experimente. (A) Protein - Adsorption und Klebeeffekte können in der Kapillare Scan erfasst werden. Unregelmäßige Peakformen, wie beispielsweise abgeflachten oder U-förmigen Spitzen zeigen das Anhaften des Probenmaterials an die Glasoberfläche. Cdie kapillare Art hängen (Standard, Premium oder hydrophob) kann Molekül Adsorption zu verhindern, in einer regelmäßigen Peakform zur Folge hat. (B) Die MST Zeitspuren dienen auch als Qualitätskontrolle, kann , da Aggregate dort als Beulen und Spikes erkannt werden. Die experimentellen Bedingungen kann durch die Verbesserung der Löslichkeit der Moleküle (zB einschließlich Detergentien wie Pluronic F-127 oder variierenden pH - Werten oder Salzkonzentrationen) optimiert werden. Die Zentrifugation kann helfen, größere Aggregate zu entfernen. Um eine optimale Datenqualität zu gewährleisten, sollten die MST Zeit Spuren gegebenen Beispiel ähneln. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Discussion

Qualitätskontrollen:

Unspezifische Klebe- / Adsorption von Probenmaterial an Oberflächen sowie Aggregationseffekte, haben einen dramatischen Einfluss auf die Qualität der Affinitätsdaten. Doch nur wenige state-of-the-art Technologien bieten genaue und schnelle Möglichkeiten zu überwachen und diese Effekte zu vermeiden. MST bietet integrierte Qualitätskontrollen, die erkennen und helfen, diese Probleme zu überwinden, so dass für die schrittweise Optimierung der technischen Einrichtung. Wichtige Informationen zu kleben und Fluoreszenzeffekte aus der Kapillare Scan und Kapillare Form extrahiert werden (Schritte 5.2 und 7.5), während die Aggregation / Ausfällung Effekte (Schritt 7.7) in den Bewegungsprofile überwacht werden. Diese Steuerelemente ermöglichen es für die ständige Verbesserung der Datenqualität und stellen wichtige Schritte im Protokoll.

Der Nachweis von Adsorptionseffekten und Fehlerbehebung:

Die Kapillare Scan wird in erster Linie als ini geführtTiAl Schritt durch Abtasten der Fluoreszenz über die sie die Position der Kapillaren auf dem Schalenhalter zu bestimmen. Jede Spitze stellt eine Kapillare, den Ausgangspunkt für die Messung MST anzeigt. Sichtkontrolle der Peakform ermöglicht die Bestimmung der Adsorption von Molekülen an die Glasoberfläche, die eine wesentliche Qualitätskontrolle ist, die vor dem Start des MST Versuch durchgeführt werden sollte. Die kapillare Form Overlay ermöglicht die einfache Erfassung von abgeflachten, holprigen Peakformen, oder auch von Spitzen , die eine U-Form ähneln, was auf die Adsorption / Anhaften von Molekülen an der inneren Glasoberfläche der Kapillare (3A, oberes Feld). Anders Kapillar-Typen (Standard, Premium und hydrophob) Hilfe beschichtet, um die Löslichkeit und minimale Adsorption der Moleküle an die Kapillaren zu gewährleisten. Die Kapillaren sind auf ihre Eignung vor den Bindungsversuchen getestet werden. Detergenzien wie Tween (0,005-0,1%) oder Pluronic F127 (0,01-0,1%) may verhindern auch unspezifische Adsorption Effekte. Optimierung in dieser Phase des Experiments ist es von wesentlicher Bedeutung für eine hohe Datenqualität (vergleiche 3A, unteres Bild).

Der Nachweis von Fluoreszenzeffekte und Fehlerbehebung:

Variationen in der Peakhöhe der abgetasteten Kapillaren bieten eine weitere Schicht von Informationen über Probeneigenschaften. Zufällige Unterschiede in kapillaren Fluoreszenz kann, einerseits werden aufgrund Pipettierfehler oder, andererseits stammen aus großen Proben Aggregate in dem Abtastbereich, der die Fluoreszenz drastisch erhöhen kann. Hohe Pipettiergenauigkeit ist zwingend Verwässerungseffekte zu vermeiden. Mischen Sie alle Lösungen durch Pipettieren und erhöht die Genauigkeit nach unten weiter. Darüber hinaus ist es wichtig, den Puffer konsistent in jeder Kapillare zu halten. Strategien Aggregationseffekte zu behandeln sind, in einem späteren Absatz dargestellt.

Systemische Veränderungen der Fluoreszenz mit zunehsingen oft Ligand-Konzentration zeigen Ligand abhängige Abschreckung / Verstärkungseffekte. Der "SD-Test" wird durchgeführt, um Bindungs ​​induzierte Fluoreszenzänderungen von unspezifischen Fluoreszenzverlust zu unterscheiden; Dieser Test überwacht Fluoreszenzintensitäten unter denaturierenden Bedingungen. Im Falle von Liganden-abhängige Fluoreszenzeffekte sollten die Fluoreszenzintensitäten unter denaturierenden Zustand identisch, unabhängig von der Konzentration der Titrierlösung. Wenn die Differenz in der Fluoreszenzintensitäten noch vorhanden ist unter diesen Bedingungen, wurde Material entweder durch unspezifische Adsorption an Rohrwände verloren gehen oder aufgrund von Aggregation und anschließende Zentrifugation.

Um die SD-Test wurden 10 ul des ersten und 10 ul der Liganden letzten Verdünnungsstufe sind jeweils sorgfältig in ein frisches Röhrchen, das 10 ul einer 2x SD Mix (4% SDS und 40 mM DTT) übertragen auszuführen. Die Proben werden gemischt und die Moleküle werden für 5 min bei 95 ° C denaturiert. after die Proben in Kapillaren Befüllen werden die Fluoreszenzintensitäten gemessen. Wenn ein Liganden-abhängige Fluoreszenzeffekt festgestellt wird, können die Daten direkt von den Fluoreszenzintensitätsänderungen abgeleitet durch die Bindungsinformationen analysiert werden.

Der Nachweis von Aggregationseffekten und Fehlerbehebung:

Holprig, unebenen MST Zeitspuren zeigen Aggregation und / oder Fällung Effekte (3B, oberes Bild). Nicht aggregierte Probenmaterial zeigt eine saubere und glatte thermophoretischer Bewegungsprofil (3B, unteres Bild). Die Zentrifugation des Probenmaterials vor der Verwendung (5-10 min bei 14000 xg), die Zugabe von Detergentien (0,005-0,1% Tween-20, 0,01 bis 0,1% Pluronic F-127, oder ähnliches), die Verwendung von BSA ( > 0,5 mg / ml), oder die Änderung der Pufferbedingungen (pH-Wert und Ionenstärke) werden empfohlen, um die Aggregationseffekte zu minimieren und die Datenqualität zu optimieren. Um qualitativ hochwertige Daten zu erhalten, ist esist unerlässlich, um die Aggregationseffekte zu minimieren.

Datenanalyse und Kurvenanpassung:

Ein thermophoretischer Bewegungsprofil ist in verschiedene Phasen unterteilt, die entweder separat kontrolliert werden können oder gleichzeitig. Die T-Jump beschreibt die plötzliche Veränderung der Fluoreszenzausbeute bei Temperaturänderung, eine intrinsische Eigenschaft von Fluorophore darstellen. Die direkte Bindung in der näheren Umgebung des Fluorophors oder Konformationsänderungen bei der Bindung stark beeinflussen die T-Jump. Die langsamere Thermophorese bezieht sich auf die Bewegung der Moleküle in dem Temperaturbereich, Informationen über die Gesamtstruktur des gebildeten Komplexes an. Der Standardtyp der Datenanalyse verwendet die "Thermophorese + T-Jump" Einstellung, beide Phänomene Ausnutzen der Bindungsparameter zu bestimmen. Falls die beiden Phasen entgegengesetzte Richtungen haben, wird empfohlen, die Phasen getrennt zu analysieren. Bitte beachten Sie, dass Zeit-Effekte und verschiedene Arten von Molekules könnte in der Affinität der Thermophorese und T-Wechseln zu Differenzen führen. Eine andere Art von Analyse-Option ist die manuelle Einstellung, die die Untersuchung von spezifischen Regionen des Bewegungsprofils ermöglicht. Störungen aufgrund von Aggregation oder Konvektion kann auf diese Weise ausgeschlossen werden. Um die Datenqualität zu verbessern, können Cursor vor der Aggregation Signale eingestellt werden. Untersuchung der frühen Thermophorese erzeugt gewöhnlich Daten mit weniger Rauschen, da Konvektion ein zeitabhängiger Prozeß ist. Diese frühe manuelle Einstellung ist für Experimente mit hoher Laserleistung (80%) sehr zu empfehlen. Bei der Datenanalyse Einstellung der Wahl, zwei Passmodelle in der Analyse-Software integriert angewendet werden, um die Bindungskurve zu passen. Die Anpassungsfunktion für K d von der Massenwirkungsgesetz ist geeignet für 1: 1 - Bindungsarten oder für mehrere Bindungsstellen die gleiche Affinität besitzen. Die Konzentration unabhängige Dissoziationskonstante K d beschreibt das Gleichgewicht zwischen der bound und ungebundenen Zustand; Somit wird die Affinität einer Bindungsstelle an einen Liganden gemessen. Die konzentrationsabhängige 50 -Wert EC von der Hill - Gleichung abgeleitet stellt die wirksame Dosis eines Liganden bei der die Hälfte der markierten Moleküle in dem gebundenen Zustand sind. Die Hill fit sollte verbindlich Modelle mehrwertige angewendet werden, vor allem, wenn sie kooperativ sind.

Die integrierten Qualitätskontrollen stellen einen großen Vorteil von MST über Technologien wie SPR oder ITC. Diese Steuerungen ermöglichen die schnelle und einfache Optimierung der technischen Einrichtung eine optimale Datenqualität zu gewährleisten. Neben den zeiteffiziente Messungen (K d in 15 min) und die Immobilisierung freie Einrichtung bietet MST die freie Wahl der Puffer, um die Beurteilung von molekularen Wechselwirkungen ermöglicht, auch in Lysaten und sera 5,42,43. Aufgrund der Tatsache, daß Molekular Thermophorese von der Größe abhängt, Ladung und Hydrathülle der Moleküle gibt es keine Beschränkungenin der Größe der gemessenen Interaktionspartner während MST-Messungen. Die dynamische Affinität Bereich von pM bis mM zusammen mit dem geringen Probenverbrauch, ergänzt die Stärken der MST-Technologie. Es ist erwähnenswert, dass MST präzise Daten zu den grundlegenden Bindungsparameter, wie zum Beispiel Bindungsaffinität, Stöchiometrie und Thermodynamik erzeugt. Allerdings ist MST nicht für die Messung von k auf erlauben und Preise k off. Darüber hinaus hat man zu berücksichtigen, dass für die meisten Experimente MST, eine fluoreszierende Modifikation einer der Wechselwirkungspartner hinzugefügt werden müssen. Die erzeugten Daten sind in guter Übereinstimmung mit state-of-the-art Technologien, wie SPR und ITC 32,43-46. Jedoch sind diese Daten qualitätskontrolliert sind die Experimente schneller und verbrauchen weniger Material. Insgesamt stellt MST eine leistungsstarke Technologie, die orthogonal zu State-of-the-art Technologien, mit einigen zusätzlichen Vorteilen.

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Disclosures

CE und TS sind Mitarbeiter von 2bind GmbH, die biophysikalischen analytische Dienste zur Verfügung stellt. Publikationsgebühren für dieses Video-Artikel sind für die von 2bind GmbH bezahlt.

Acknowledgments

Die Autoren haben keine Bestätigungen.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Aptamer binding buffer 20 mM Tris pH 7.6; 300 mM NaCl; 5 mM MgCl2; 0.01% Tween-20
Fluorescently labeled ATP aptamer IDT, Leuven, Belgium sequence: DH25.42 50-Cy5-CCTGGGGGAGT-
ATTGCGGAGGAAGG-3
ATP Sigma Aldrich, Germany  A2383 10 mM stock solutions stored at - 20 °C
ADP Sigma Aldrich, Germany  A2754 10 mM stock solutions stored at - 20 °C
AMP Sigma Aldrich, Germany  A2252 10 mM stock solutions stored at - 20 °C
Adenine Sigma Aldrich, Germany  A8626 10 mM stock solutions stored at - 20 °C
SAM Sigma Aldrich, Germany  A7007 10 mM stock solutions stored at - 20 °C
dATP Sigma Aldrich, Germany  11934511001 10 mM stock solutions stored at - 20 °C
CTP Sigma Aldrich, Germany  C1506 10 mM stock solutions stored at - 20 °C
GTP Sigma Aldrich, Germany  G8877 10 mM stock solutions stored at - 20 °C
Monolith NT.115  NanoTemper Technologies, Munich, Germany MO-G008 Blue/Red Channel
MST device with standard detector, Monolith NT115 pico is MST device with high sensitivity detector
Monolith NT.115 capillaries Standard NanoTemper Technologies, Munich, Germany MO-K002
Eppendorf PCR tubes Eppendorf, Germany 30124537
Monolith control software. 2.1.33, pre-installed on the device NanoTemper Technologies, Munich, Germany
MO.affinity analysis v2.1.1 NanoTemper Technologies, Munich, Germany
Kaleidagraph 4.5.2 Synergy Software

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Biochemie Heft 119 Klein-Molekül-Aptamer-Interaktion Bindungsparameter Micro Thermophorese Bindungsaffinität Stöchiometrie Thermodynamik Nukleinsäuren Bindungsstelle Mapping
Kartierung der Bindungsstelle eines Aptamer auf ATP Mit Micro Thermophorese
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Entzian, C., Schubert, T. Mapping… More

Entzian, C., Schubert, T. Mapping the Binding Site of an Aptamer on ATP Using MicroScale Thermophoresis. J. Vis. Exp. (119), e55070, doi:10.3791/55070 (2017).

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