Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Картирование участок связывания аптамер на АТФ Использование Microscale Термофорез

Published: January 7, 2017 doi: 10.3791/55070
Automatic Translation
1, 1
12bind GmbH

Introduction

Взаимодействие между молекулами является основой природы. Таким образом, ученые во многих областях фундаментальных и прикладных исследований пытаются понять основные принципы молекулярных взаимодействий различных видов. Microscale Термофорез (MST) позволяет ученым осуществлять быстрый, точный, экономичный, и контроль качества характеристику молекулярных взаимодействий в растворе, со свободным выбором буферов. Есть уже более 1000 публикаций с использованием MST, с 2016 года в одиночку, описывая различные виды анализов, в том числе библиотеки скринингов, связывание валидаций событий, анализы конкуренции, а также эксперименты с несколькими партнерами связывания 1-8. В общем, МСТ позволяет исследовать классических параметров связывания, такие как аффинность связывания (стр.м.в мМ), стехиометрии и термодинамики, любого вида молекулярного взаимодействия. Большим преимуществом MST является возможность изучения связывания событий независимо от размера партнеров взаимодействия. Даже чалlenging взаимодействия между малыми аптамеров нуклеиновых кислот (15-30 нт) и задачи, такие как небольшие молекулы, лекарственные средства, антибиотики или метаболиты могут быть определены количественно.

Текущее состояние-оф-современные технологии для характеристики аптамеров-мишени взаимодействия либо лабораторного интенсивной и очень сложной или не в состоянии количественно аптамеров-малая молекула взаимодействиях 9,10. Поверхностного плазмонного резонанса (SPR) основе анализов 11,12 и действительно этикетки свободные калориметрических подходы, такие как изотермической калориметрии (титрования ITC), 13-15 изократическим элюирования 16, равновесному инфильтрации 17,18, рядный зондирования 19, гелеобразные анализах сдвига, stopped- потока флуоресценции спектроскопии 20,21, анизотропии флуоресценции (FA) 22,23, одной молекулы флуоресценции изображений 24,25 и Био-слой интерферометрии (BLI) 26 также являются либо неточными или несовместим с аптамеров-небольшой молекулы взаимодействия. Другое principaл вопросы этих методов низкая чувствительность, высокое потребление пробы, иммобилизация, ограничение массовых перевозок на поверхностях, и / или ограничения буфера. Лишь немногие из этих технологий обеспечивают интегрированные средства управления для агрегации и адсорбции эффектов.

MST представляет собой мощный инструмент для ученых , чтобы преодолеть это ограничение для изучения взаимодействия между аптамеров и малыми молекулами 27-29, а также другие цели , такие как белки 30-33. Технология опирается на движение молекул через температурных градиентов. Это направленное движение, называемое "термофорезу," зависит от размера, заряда и гидратной оболочки молекулы 34,35. Связывание лиганда с молекулой будет непосредственно изменять, по меньшей мере один из этих параметров, в результате чего в измененном термофоретического мобильности. Лиганды с малыми размерами не могут иметь значительное влияние с точки зрения изменения размера от несвязанного в связанном состоянии, но они могут иметь Др amatic воздействие на оболочку гидратации и / или заряда. Изменения в термофоретического движение молекул после взаимодействия с партнером по связыванию позволяет количественно оценить основные параметров связывания 2,7,34,36,37.

Как показано на рисунке 1А, устройство МСТ состоит из инфракрасного лазера фокусировалось на образец в стеклянных капиллярах с использованием тех же оптических систем для флуоресцентной детекции. Термофоретическая движение белков с помощью собственной флуоресценции триптофанов 6 или флуоресцентно меченого партнерского взаимодействия 3,8 можно отслеживать в то время как лазер создает температурный градиент (& Delta ; t 2-6 ° С). Полученная разность температур в пространстве, & Delta ; t, приводит к истощению или накопление молекул в области повышенной температуры, которая может быть определена количественно с помощью Соре коэффици- циент (С Т):

г "/>

С горячей представляет собой концентрацию в нагретой области, и с холодом концентрация в начальной холодной области.

Как показано на фигуре 1В, типичный результаты эксперимента MST в профиле движения MST (время трассировки), состоящий из различных этапов, которые могут быть разделены с помощью их соответствующих временных рамок. Первоначальная измеряют флуоресценцию в первые 5 секунд в отсутствие градиента температуры, чтобы определить точную начальную флуоресценцию и для проверки наличия фотообесцвечиванию или photoenhancement. Скачок температуры (T-Jump) представляет собой фазу, в которой изменения флуоресценции до термофоретического движения. Это начальное снижение флуоресценции зависит от тепловых зависящих от изменений фл uorophore квантового выхода. Фаза термофорезу следует, в которых флуоресценция уменьшается (или увеличивается) в связи с термофоретического движения молекул вплоть до стационарного распределения достигается.Обратное TJump и сопутствующее назад диффузия фл uorescent молекул можно наблюдать , как показано на рисунке 1В после того, как лазер выключен. Для того, чтобы получить доступ к основным параметрам связывания, различные молярные отношения партнеров взаимодействия анализируются и сравниваются. Как правило, 16 различных соотношений изучаются в одном эксперименте MST, в то время как оптический видимый молекулы поддерживается постоянным и поставляется с увеличением количества немеченого лиганда. Взаимодействие между этими двумя связывающими партнерами вызывает изменения в ТФ, и , таким образом , в нормированной флуоресценции, F норма, которая рассчитывается следующим образом :

Уравнение

F горячей и холодной F представляют собой усредненные интенсивности uorescence Fl на де определены моменты времени следов MST. Аффинности связывания (K D или 50 значений EC) можно рассчитать по CURVе фитинга (рис 1C).

В целом, MST является мощным инструментом для изучения молекулярных взаимодействий любого рода. Эта рукопись предлагает протокол характеризовать сложные взаимодействия между молекулой небольшой аденозинтрифосфата (АТФ, 0,5 кДа) и 25-нт короткий оцДНК аптамеров DH25.42 (7,9 кДа). В течение рукописи, сайт связывания аптамеров на молекулы АТФ отображается вплоть до аденин группы АТФ.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Подготовка аптамеров рабочей запаса

  1. Следуйте инструкциям производителя и растворить олигонуклеотида (5-Cy5-ЦГКК GGGGAGTATTGCGGAGGAAGG-3, последовательность из ссылки 18) в воде, достигая конечной концентрации 100 мкМ.
  2. Подготовка аптамера рабочего раствора путем разбавления олигонуклеотидного запаса до 200 нм с буфером для связывания (20 мМ Трис, рН 7,6; 300 мМ NaCl, 5 мМ MgCl 2, 0,01% Tween 20).
  3. Выдержите смесь в течение 2 мин при 90 ° С, дайте образец сразу остыть на льду, а также использовать образец при комнатной температуре.

2. Подготовка лигандной серии разведений

  1. Для каждого лиганда (аденозинтрифосфата (АТФ), аденозин дифосфат (АДФ), аденозинмонофосфата (АМФ), аденин, гуанозинтрифосфат (GTP), цитидинтрифосфат (CTP), дезоксиаденозин трифосфата (дАТФ), и S-Аденозил метионин (SAM) ; 10 мМ каждый запас), готовят 16-ступенчатый последовательный dilutiна в 200 мкл микро реакционных труб.
    Примечание: Центрифугирование запасов лиганда в течение 5 мин при 14000 х г, может помочь удалить агрегаты. Низкий уровень громкости, низкие трубки реакции связывания рекомендуется, чтобы избежать адсорбции молекул на стенках труб.
  2. Начать с максимальной концентрацией по меньшей мере в 50 раз выше, чем расчетная сродства и снижают концентрацию лиганда на 50% в каждой стадии разбавления.
    Примечание: Концентрация искатель инструмент реализован в программном обеспечении управления имитирует связывание данных и помогает при поиске нужного диапазона концентраций для серии разбавления.
  3. Fill 20 мкл лигандного запаса (10 мМ) в пробирку 1. Добавьте 10 мкл буфера для связывания аптамеров в микротрубок реакции от 2 до 16.
  4. Передача 10 мкл трубы 1 к трубе 2 и правильно перемешать с помощью пипетки вверх и вниз несколько раз. Перенесите 10 мкл на следующую пробирку и повторить это разведение для остальных трубок.
  5. Откажитесь от 10 мкл избытка из последней трубки. Избегайте любого бuffer разведение эффекты. Буфер в трубе 1 и в трубах 2-16 должны быть идентичными.

3. Получение конечных реакционной смеси

  1. Подготовка индивидуальных реакций связывания с объемом 20 мкл (10 мкл рабочего раствора аптамеров + 10 мкл соответствующего лиганда разбавлении), чтобы свести к минимуму ошибки пипетирования. Объем всего 4 мкл является достаточной для фи LL капилляра.
  2. Добавьте 10 мкл рабочего раствора 200 нМ аптамеров к 10 мкл каждого лиганда разведения и должным образом перемешать с помощью пипетки вверх и вниз несколько раз.
  3. Инкубируйте образцы в течение 5 мин при комнатной температуре и наполняются во образцов в стандартные капилляры путем погружения капилляров в образец. Более длительное время инкубации может быть необходимо для некоторых взаимодействий; Тем не менее, 5 мин достаточно для большинства. Прикоснитесь капилляры только по бокам, а не на средней части, где будет принято оптическое измерение.
  4. Поместите капилляры на ее капиллярная лоток и запустить устройство MST.

4. Запуск устройства MST

ПРИМЕЧАНИЕ: Устройство содержит два предварительно установленные программные пакеты, на "контроль" программное обеспечение для установки технических условий эксперимента и анализа '' " 'программного обеспечения для интерпретации полученных данных.

  1. Перед установкой капиллярного лоток в устройство MST, запустите программу управления и регулировать общую желаемую температуру, выбрав '' включить ручное управление температуры "в '' контроля температуры" в раскрывающемся меню. Доведите температуру до 25 ° С таким образом.
    Примечание: Инструменты MST может быть с регулируемой температурой от 22 до 45 ° C.
  2. Подождите, пока температура достигнет ожидаемого уровня, а затем поместить капиллярную лоток в устройство MST.
  3. Установите светодиодный канал в '' красной "для Cy5 красителей и регулировать питание светодиодов, чтобы получить фл uorescencе сигнала от 300 до 1000 единиц флуоресценции в устройстве MST со стандартным датчиком. 25% Сила СИД используется в данном исследовании.
    Примечание: от 6000 до 18 000 единицы флуоресценции рекомендуются для MST с датчиком высокой чувствительности.

5. Капиллярная сканирования

  1. Выполняют капиллярную сканирование, чтобы проверить различные аспекты качества образца путем выбора позиции капиллярную на программное обеспечение "управления" и нажав на кнопку "старт крышки сканирование" Перед началом измерения MST.
  2. Проверьте капиллярную сканирование флуоресценции повышения / закалкой и торчащие эффектов (U-образные или уплощенные пики) в программном обеспечении.
    Примечание: Более подробная информация о выявлении и обработке флуоресценции и торчащие эффектов можно найти в обсуждении.

6. Измерение MST

ПРИМЕЧАНИЕ: Перед началом измерения MST, убедитесь, чтобы исключить прилипание эффекты, повышение / тушение эффектов, илиОшибки пипетирующие, и убедитесь, что капиллярная сканирования указывает на то, что сигнал флуоресценции является достаточным. Для получения более подробной информации, смотрите обсуждение.

  1. Назначают концентрации лиганда, из серии разведений в соответствующее положение капилляра в программном обеспечении '' управления "Рассмотрим стадию разбавления смешивания аптамера и лиганда. (1: 1).
  2. Введите самую высокую концентрацию лиганда (5 мм) для капиллярного # 1, выберите правильный тип для разведения (здесь, 1: 1), нажмите на максимальной концентрации, а также использовать функцию перетаскивания для автоматического назначения оставшиеся концентрации в капиллярах # 2- 16. Самая низкая концентрация составляет 152,6 нМ.
  3. Введите концентрацию фл uorescent аптамеров (здесь, 100 нМ) в соответствующем разделе программного обеспечения управления.
  4. Используйте настройки по умолчанию, которые обнаруживают флуоресценции в течение 5 сек, запись MST в течение 30 сек, и регистрации флуоресценции в течение еще 5 секунд после инактивации лазера т O монитор поворотную диффузию молекул.
  5. Регулировка мощности лазера до 20% в соответствующем разделе программы управления.
    Примечание: Для того, чтобы получить наилучшее соотношение сигнал-шум и избежать неспецифических эффектов, лазер мощностью 20-40% рекомендуется. В отдельных случаях, более высокая мощность лазера может потребоваться, чтобы получить хорошее разделение несвязанных и связанных молекул.
  6. Сохранить эксперимент после выбора папки назначения и начать измерение MST, нажав на кнопку '' измерения Start MST ".
    Примечание: Файл .ntp будет создан в папке назначения. С помощью этой установки, одно измерение длится 10-15 мин.
  7. Повторите экспериментальную процедуру , по крайней мере в два раза для более точного определения величины ЕС50.
    Примечание: Для того, чтобы проверить техническую воспроизводимости, одни и те же капилляры могут быть отсканированы несколько раз (технических повторов).

7. MST Анализ данных

нт "> Примечание: Программное обеспечение для анализа позволяет анализировать данные о мошка во время измерения Программное обеспечение для анализа временных участков следов и изменений в нормированной флуоресценции (F норма) MST в зависимости от концентрации лиганда 37..

  1. Запустите программное обеспечение для анализа MST (MO.Affinity Analysis) и загрузите файл .ntp из папки назначения. Выберите "MST" в качестве типа анализа в меню выбора данных.
    Примечание: В случае лиганд-зависимых эффектов флуоресценции, начальная флуоресценция может быть выбран для анализа.
  2. Добавьте соответствующую техническую или биологическую прогон (ов) к новому анализу путем перетаскивания и падение или нажав на кнопку "+" ниже соответствующего экспериментального пробега.
  3. Нажмите кнопку информация ниже соответствующего экспериментального прогона для получения информации о свойствах эксперимента, MST следов, капиллярный сканирования, форма капилляра, начальной флуоресценции и скорости отбеливания.
    Примечание: Эти исходные данные могут альтак быть осмотрены на последующих этапах анализа.
  4. Осмотреть следы MST для агрегации и осаждения эффектов, видимые как шишки и шипы.
    Примечание: Для получения дополнительной информации о выявлении и обработке агрегирования эффектов, читать обсуждение.
  5. Визуально проверьте капиллярную сканирование и форма наложения капилляров для адсорбции эффектов, видимый, как сплющенные или U-образных пиков. Осмотреть капиллярную сканирования и начальный флуоресценции для эффектов флуоресценции. Осмотреть скорость отбеливания для фотообесцвечиванию эффектов.
  6. Переключение в режим доза-реакция и изменения настроек анализа в режим "Эксперт", нажав на соответствующую кнопку. Выберите "T-Jump" в качестве стратегии оценки MST.
  7. Выберите модель "Hill" на кривой подгонки. Связующие параметры будут автоматически рассчитываться. Нормализовать данные, выбрав соответствующий тип нормализации в меню "Сравнить результаты". Экспортироватьданные либо как .xls или .pdf.
    Примечание: В таблице ниже привязки графика приведены расчетные параметры связывания.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

В данном исследовании МСТ был применен для характеристики участок связывания аптамеров DH25.42 ДНК 18 на АТФ. В отличие от других исследований , характеризующих взаимодействие АТФ или АТФ-имитируя малых молекул с белками случайным образом помеченного одной или более флуорофоров 38-40, это исследование включает меченый вариант аптамеров 7,9 кД оцДНК с одной молекулой Cy5 на конце 5' , Различные производные АТФ и родственные молекулы, все отличающиеся от АТФ в различных положениях, были использованы для отображения сайта связывания на молекуле АТФ. серии разведений (в 16 шагов, снижение концентрации лиганда на 50% каждый) различных лигандов были подготовлены и смешивают с постоянным количеством Cy5-меченым аптамеров. Образцы анализировали в стандартных капиллярах при 25% LED и 20% мощности лазерного излучения. Профили движения (время следы MST) были записаны и единицы флуоресценции, полученные из фазы Т-Джамп, были построены против лиганда Концвания (сравните рис 1C). Кривая фитинг была выполнена с применением уравнения Хилла, что приводит к значениям EC 50. В 5 независимых биологических повторами (4 -х различных операторов, 2 -х различных запасов аптамеров, 2 различных запасов АТФ), АТФ-аптамеров взаимодействие показывает отрицательную связывающую амплитуду от 6 до 13 единиц , а среднее значение EC 50 52,3 ± 5,0 мкМ (фиг.2А ). Столбики ошибок в привязке графиков и "±" представлены в данных сродства представляют собой стандартное отклонение 5 биологических повторов (5 независимых измерений в другой капилляр). Ранее сообщалось о сродства для взаимодействия аптамеров DH25.42 с [2,8,5'- 3 H] -adenosine и ATP агарозы были сопоставимы. Взаимодействие радиоактивно меченого аденозина с аптамеров определяли количественно с помощью центробежного фильтра анализа и определяли сродство (K D) от 6 ± 3 мкМ. Изократические эксперименты элюции с ATP Immobilдартизованных к агарозном привело к сродством (K D) от 13 мкМ 18,41.

Для лучшего сравнения бок о бок, то данные могут быть нормализованы к фракции закомплексованных молекул (доля связанной, FB), используя следующее уравнение:
Уравнение
где значение (с) представляет собой значение МСТ измеренная для концентрации с, свободный является значение МСТ для несвязанного состояния (низкая концентрация), и вошедшего в комплекс, значение МСТ для полностью связанного состояния (Фигура 2В). Такая нормализация идеально подходит для сравнения результатов различных лигандов на одном графике, как показано на рисунке 2C. Обнаруженные аф фи ществ АДФ (63,6 ± 5,9 мкМ в биологических дублей), AMP (91,6 ± 9,1 мкМ в биологических дублей) и SAM (44,4 ± 3,2 мкм в биологических дублей), которые отличаются от АТФ в нюmber фосфатных групп, не означает , что эта позиция не имеет или только незначительное в фл uence на связывающую поведение аптамеров (рис 2C и D). ОН-группа в C2 углерода рибозы АТФ также могут быть исключены из будучи основным местом связывания, дАТФ также связан аптамера со слегка сниженной аф бесконечности (64,4 ± 6,1 мкМ в биологических дублей). Изменение пуринов группы АТФ к пиримидинового группе CTP привело к необязательными аптамера, демонстрируя важность этой группы для взаимодействия. Аптамеры связан с аденина с аффинностью 141,7 ± 9,4 мкм (в биологических дубликатах), показывая, что сайт связывания должен быть в этой части молекулы АТФ. Молекулы пуриновых ГТФ и АТФ отличаются в зеленой затененной области , представленной на рисунке 2D, который представляет собой основной сайт связывания аптамеров на АТФ. В другом исследовании использовали неколичественную эксперименты элюции с различными производными АТФ кэлюирования радиоактивно меченного аптамер из АТФ агарозы, которая показала сравнимые результаты этого исследования MST 18.

фигура 2
Рисунок 1: Microscale Термофорез. (А) Техническая настройка технологии MST показан. Оптика сосредоточиться на центре стеклянных капилляров, тем самым обнаруживая сигнал флуоресценции оптически видимой молекулы. ИК-лазер используется для установления температурного градиента в смотровое окно оптической системы. Изменения флуоресценции могут быть использованы для мониторинга термофоретическая движение молекул в растворе (B) MST времени остаточному движения профилем молекул в градиенте температур. Первоначальная измеряют флуоресценцию в течение 5 секунд, а лазер выключен. Включение лазера генерирует градиент температуры. После немедленного Т-Джамп рHase, в котором фл uorescent краситель снижает его выход сигнала при тепловой индукции, термофоретическая движение происходит и наблюдается в течение 30 сек. После того, как лазер выключается, молекулы диффундируют обратно. (C) Результаты типичного эксперимента MST: (слева) 16 капилляры , содержащие ту же концентрацию флуоресцентной молекулы и увеличением концентрации немеченого лиганда; временные следы MST записываются и нормированы на их начальной флуоресценции. (Справа) Нормализованная флуоресценции; разница между F холодной и горячей F наносится на график концентрации лиганда. Кривая припадок это дает данных обязательных параметров, таких как связующей аф бесконечности. Повторная печать с разрешения Elsevier, методы 28; Номер лицензии 3890230800113. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

фигура 2
Рисунок 2: анализ данных MST. (A) Базовая линия корректируется нормированный флуоресценции ; F нормы (‰), полученного из сигнала MST TJump, представлен в зависимости от концентрации АТФ (в мкМ). Уравнение Хилла (EC 50) была применена для построения кривой. Столбики ошибок обозначают стандартное отклонение от пяти биологических повторами. (Б) Фракция переплете участок данных , показанных в А. Соответствующие наборы данных были нормированы на фракции , связанной, и среднее значение этих нормализованного данные представлены в связывании графике. Столбики ошибок указывают стандартное отклонение 5 биологических повторов. (C) Фракцию переплете график показывает количественное сравнение (Hill посадка) различных лигандов к аптамеров. Столбики ошибок обозначают стандартное Deviaние двух биологических повторов. (D) Связующие аф фи ществ (EC 50) различных лигандов к аптамеров. Зеленая заштрихованная область показывает участок связывания аптамеров на аденин группы АТФ. Эта цифра изменяется от Elsevier, методы 28; Номер лицензии 3890230800113. наборы данных предыдущего исследования являются переосмыслены и расширены в рамках данного исследования. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 3
Рисунок 3: Анализ оптимизации для экспериментов MST. (А) адсорбции белка и приклеить эффекты могут быть обнаружены в капиллярном сканирования. Нерегулярное пик формы, такие как сплющенные или U-образных пиков, указывают на прилипание материала образца на поверхности стекла. Сподвешивания капиллярного типа (стандарт, премиум, или гидрофобный) может предотвратить молекулу адсорбции, в результате чего в обычной форме пика. (Б) время следы MST также служат в качестве контроля качества, так как агрегаты могут быть обнаружены там , как удары и шипы. Экспериментальные условия могут быть оптимизированы путем улучшения растворимости молекул (например, включая моющие средства , такие как Pluronic F-127 или различной величины рН или концентрации соли). Центрифугирование может помочь удалить крупные агрегаты. Для обеспечения оптимального качества данных, временные следы MST должны походить на приведенный пример. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Контроль качества:

Неспецифические прилипание / адсорбции материала образца на поверхности, а также агрегации эффектов, оказывают серьезное влияние на качество данных сродством. Тем не менее, лишь немногие внедренный технологии обеспечивают точные и быстрые варианты контроля и устранения этих последствий. MST предлагает интегрированные контроля качества, которые обнаруживают и помогают преодолеть эти проблемы, позволяя для оптимизации ступенчатого технической установки. Важная информация о прикрепление и флуоресцентных эффекты могут быть извлечены из капиллярной сканирования и капиллярной формы (этапы 5.2 и 7.5), в то время как агрегация / осадками эффекты (этап 7.7) можно наблюдать в профилях движения. Эти элементы управления позволяют для постоянного улучшения качества данных и представляют собой важные шаги в протоколе.

Обнаружение адсорбционных эффектов и устранения неисправностей:

Капиллярная сканирование основном осуществляется как иниTiAl шаг для определения положения капилляров на держателе лотка путем сканирования флуоресценции над ним. Каждый пик представляет собой один капилляр, что указывает на начальную точку для измерения MST. Визуальный осмотр формы пика позволяет определить адсорбции молекул на поверхности стекла, что является одним из важнейших контроля качества, которые должны быть выполнены перед началом эксперимента MST. Наложение капиллярная форма позволяет легко определять сплюснутые, ухабистым пик формы, или даже пиков , которые напоминают U- образную форму, что указывает на адсорбционную / прилипание молекул к внутренней стеклянной поверхности капилляра (рис 3А, верхняя панель). Иными словами покрыты капиллярные типов (стандарт, премиум и гидрофобный) помогают обеспечить растворимость и минимальной адсорбции молекул к капиллярам. Капилляры должны быть проверены на предмет их пригодности до связывания экспериментов. Детергенты, такие как Tween (0,005-0,1%) или Pluronic F127 (0,01-0,1%), мАу также предотвращают неспецифические эффекты адсорбции. Оптимизация на данном этапе эксперимента имеет важное значение для высокого качества данных (сравните рисунок 3A, нижняя панель).

Обнаружение эффектов флуоресценции и устранения неисправностей:

Вариации высоты пика сканированных капилляров предлагают еще один слой информации о выборочных характеристик. Случайные различия в капиллярной флуоресценции может, с одной стороны, быть из-за ошибки или пипеткой, с другой стороны, происходят из крупных агрегатов образца в области сканирования, который может увеличить флуоресценции резко. Высокая точность пипетирования является обязательным, чтобы избежать размывания эффектов. Смешивание все решения с помощью пипетки вверх и вниз дополнительно повышает точность. Кроме того, важно поддерживать буфер последовательно в каждом капилляре. Стратегии для обработки агрегации эффекты представлены в следующем параграфе.

Системные изменения флуоресценции с increaпоем лиганда концентрации часто указывают на зависимый лиганд эффекты тушение / улучшения. "SD-Тест" осуществляется для того, чтобы различать обязательные индуцированных изменений флуоресценции неспецифической потере флуоресценции; этот тест контролирует интенсивность флуоресценции в денатурирующих условиях. В случае лиганд-зависимых эффектов флуоресценции, интенсивности флуоресценции при условии денатурации должны быть одинаковыми, независимо от концентрации титранта. Если разница в интенсивности флуоресценции по-прежнему присутствует в этих условиях, материал либо проиграны из-за неспецифической адсорбции на стенках трубки или из-за агрегации и последующего центрифугирования.

Для выполнения теста SD, 10 мкл первой и 10 мкл последней стадии разбавления лиганда каждый осторожно переносят в свежую пробирку, содержащую 10 мкл 2x SD Mix (4% SDS и 40 мМ DTT). Образцы смешивают и молекулы денатурировали в течение 5 мин при 95 ° С. Afteг заполнение образцов в капилляры, интенсивности флуоресценции измерены. Если лиганд-зависимый эффект флуоресценции детектируется, данные могут быть проанализированы непосредственно с помощью информации связывания денным из изменений интенсивности флуоресценции.

Обнаружение агрегации эффектов и устранения неисправностей:

Ухабистые, неровные время следы MST указывают на агрегацию и / или осаждение эффектов (рис 3B, верхняя панель). Необобщенную образец материала отображает чистую и гладкую термофоретическая профиль движения (Рисунок 3B, нижняя панель). Центрифугирование материала образца перед использованием (5-10 мин при 14 000 мкг), добавление моющих средств (0,005-0,1% твин-20, 0,01-0,1% Pluronic F-127, или аналогичный), использование бычьего сывороточного альбумина ( > 0,5 мг / мл), или изменение условий буфера (рН и ионной силы) рекомендуется, чтобы минимизировать эффекты агрегации и оптимизации качества данных. Для получения высококачественных данных, этоимеет важное значение для минимизации последствий агрегации.

Анализ данных и построения кривой:

Термофоретическая профиль движение разделяется на различные фазы, которые могут быть проверены по отдельности или одновременно. T-Jump описывает внезапное изменение выхода флуоресценции при изменении температуры, что представляет собой внутреннюю характеристику флуорофоров. Прямое связывание в ближайшем окружении флуорофора или конформационных изменений после связывания высоко влияют на Т-Jump. Чем медленнее термофорезу относится к движению молекул в области температур, содержащих информацию о общей структуре образовавшегося комплекса. Тип анализа данных по умолчанию используется параметр "Термофорез + T-Jump", используя оба явления для определения параметров связывания. В этом случае обе фазы имеют противоположные направления, рекомендуется проанализировать фаз отдельно. Обратите внимание, что временные эффекты и различные виды Molecмологий может привести к различиям в сродства термофореза и T-Jump. Другой тип варианта анализа является ручной настройки, который позволяет производить исследование конкретных областей профиля движения. Помехи из-за агрегации или конвекции может быть исключена таким образом. В целях улучшения качества данных, курсоры могут быть установлены до агрегации сигналов. Рассматривая раннее термофореза обычно производит данные с меньшим уровнем шума, так как конвекция процесс зависит от времени. Эта ранняя ручная установка настоятельно рекомендуется для экспериментов с высоким уровнем мощности лазерного излучения (80%). При выборе места для анализа данных, два Оценивание моделей, встроенные в программное обеспечение для анализа могут быть применены, чтобы соответствовать кривую связывания. Подгонка функция для K D от закона действия масс подходит для 1: 1 режимов переплета или для нескольких сайтов связывания , обладающих такой же аффинностью. Концентрация-независимая константа диссоциации K d описывает равновесие между Боуй и несвязанного состояния; Таким образом, сродство сайта связывания с лигандом измеряется. Зависит от концентрации EC 50 значение , полученное из уравнения Хилла представляет собой эффективную дозу лиганда , при которой половина меченых молекул находятся в связанном состоянии. Подгонка Хилл должен быть применен к Многолистные связывания модели, особенно если они кооператива.

Встроенные средства управления качеством представляют собой одно большое преимущество MST над технологиями, такими как ППР или ITC. Эти элементы управления позволяют быстро и легко оптимизации технической установки для обеспечения оптимального качества данных. В дополнение ко времени эффективных измерений (K D в течение 15 мин) и установки иммобилизации свободных, MST предлагает свободный выбор буферов, что позволяет оценку молекулярных взаимодействий, даже в лизатов и сывороток 5,42,43. В связи с тем, что молекулярная термофорезу зависит от размера, заряда и гидратной оболочки молекул, не существует каких-либо ограниченийв размере измеренных партнеров взаимодействия при измерениях MST. Динамический диапазон аф бесконечности, от пМ до мМ, вместе с низким потреблением образца, дополняет сильные стороны технологии MST. Стоит отметить, что MST генерирует точные данные об основных параметров связывания, такие как аффинность связывания, стехиометрии и термодинамики. Тем не менее, МСТ не допускает измерение к на и K от ставок. Кроме того, необходимо учитывать, что для большинства экспериментов MST, флуоресцентное модификация должна быть добавлена ​​к одному из партнеров взаимодействия. Сформированные данные находятся в хорошем согласии с государством в самых современных технологий, таких как SPR и ITC 32,43-46. Тем не менее, эти данные являются контроль качества, эксперименты быстрее, и они потребляют меньше материала. В целом, MST представляет собой мощную технологию, ортогональный государством в самых современных технологий, с некоторыми дополнительными преимуществами.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

CE и TS являются сотрудниками 2bind GmbH, которая обеспечивает биофизических аналитические услуги. Публикация плата за это видео-статьи оплачиваются 2bind GmbH.

Acknowledgments

Авторы не имеют никаких подтверждений.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Aptamer binding buffer 20 mM Tris pH 7.6; 300 mM NaCl; 5 mM MgCl2; 0.01% Tween-20
Fluorescently labeled ATP aptamer IDT, Leuven, Belgium sequence: DH25.42 50-Cy5-CCTGGGGGAGT-
ATTGCGGAGGAAGG-3
ATP Sigma Aldrich, Germany  A2383 10 mM stock solutions stored at - 20 °C
ADP Sigma Aldrich, Germany  A2754 10 mM stock solutions stored at - 20 °C
AMP Sigma Aldrich, Germany  A2252 10 mM stock solutions stored at - 20 °C
Adenine Sigma Aldrich, Germany  A8626 10 mM stock solutions stored at - 20 °C
SAM Sigma Aldrich, Germany  A7007 10 mM stock solutions stored at - 20 °C
dATP Sigma Aldrich, Germany  11934511001 10 mM stock solutions stored at - 20 °C
CTP Sigma Aldrich, Germany  C1506 10 mM stock solutions stored at - 20 °C
GTP Sigma Aldrich, Germany  G8877 10 mM stock solutions stored at - 20 °C
Monolith NT.115  NanoTemper Technologies, Munich, Germany MO-G008 Blue/Red Channel
MST device with standard detector, Monolith NT115 pico is MST device with high sensitivity detector
Monolith NT.115 capillaries Standard NanoTemper Technologies, Munich, Germany MO-K002
Eppendorf PCR tubes Eppendorf, Germany 30124537
Monolith control software. 2.1.33, pre-installed on the device NanoTemper Technologies, Munich, Germany
MO.affinity analysis v2.1.1 NanoTemper Technologies, Munich, Germany
Kaleidagraph 4.5.2 Synergy Software

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Linke, P., et al. An Automated Microscale Thermophoresis Screening Approach for Fragment-Based Lead Discovery. J Biomol Screen. 21 (4), 414-421 (2015).
  2. Jerabek-Willemsen, M., et al. MicroScale Thermophoresis: Interaction analysis and beyond. Journal of Molecular Structure. 1077, 101-113 (2014).
  3. Zillner, K., et al. Microscale thermophoresis as a sensitive method to quantify protein: nucleic acid interactions in solution. Methods Mol Biol. 815, 241-252 (2012).
  4. Zhang, W., Duhr, S., Baaske, P., Laue, E. Microscale thermophoresis for the assessment of nuclear protein-binding affinities. Methods Mol Biol. 1094, 269-276 (2014).
  5. Wienken, C. J., Baaske, P., Rothbauer, U., Braun, D., Duhr, S. Protein-binding assays in biological liquids using microscale thermophoresis. Nat Commun. 1, 100 (2010).
  6. Seidel, S. A., et al. Label-free microscale thermophoresis discriminates sites and affinity of protein-ligand binding. Angew Chem Int Ed Engl. 51 (42), 10656-10659 (2012).
  7. Seidel, S. A., et al. Microscale thermophoresis quantifies biomolecular interactions under previously challenging conditions. Methods. 59 (3), 301-315 (2013).
  8. Schubert, T., et al. Df31 protein and snoRNAs maintain accessible higher-order structures of chromatin. Mol Cell. 48 (3), 434-444 (2012).
  9. McKeague, M., Derosa, M. C. Challenges and opportunities for small molecule aptamer development. J Nucleic Acids. 2012, 748913 (2012).
  10. Ruscito, A., DeRosa, M. C. Small-Molecule Binding Aptamers: Selection Strategies, Characterization, and Applications. Front Chem. 4, 14 (2016).
  11. Chang, A. L., McKeague, M., Liang, J. C., Smolke, C. D. Kinetic and equilibrium binding characterization of aptamers to small molecules using a label-free, sensitive, and scalable platform. Anal Chem. 86 (7), 3273-3278 (2014).
  12. Chang, A. L., McKeague, M., Smolke, C. D. Facile characterization of aptamer kinetic and equilibrium binding properties using surface plasmon resonance. Methods Enzymol. 549, 451-466 (2014).
  13. Jing, M., Bowser, M. T. Methods for measuring aptamer-protein equilibria: a review. Anal Chim Acta. 686 (1-2), 9-18 (2011).
  14. Sokoloski, J. E., Dombrowski, S. E., Bevilacqua, P. C. Thermodynamics of ligand binding to a heterogeneous RNA population in the malachite green aptamer. Biochemistry. 51 (1), 565-572 (2012).
  15. Burnouf, D., et al. kinITC: a new method for obtaining joint thermodynamic and kinetic data by isothermal titration calorimetry. J Am Chem Soc. 134 (1), 559-565 (2012).
  16. Mannironi, C., Scerch, C., Fruscoloni, P., Tocchini-Valentini, G. P. Molecular recognition of amino acids by RNA aptamers: the evolution into an L-tyrosine binder of a dopamine-binding RNA motif. RNA. 6 (4), 520-527 (2000).
  17. Jenison, R. D., Gill, S. C., Pardi, A., Polisky, B. High-resolution molecular discrimination by RNA. Science. 263 (5152), 1425-1429 (1994).
  18. Huizenga, D. E., Szostak, J. W. A DNA aptamer that binds adenosine and ATP. Biochemistry. 34 (2), 656-665 (1995).
  19. Lee, E. R., Baker, J. L., Weinberg, Z., Sudarsan, N., Breaker, R. R. An allosteric self-splicing ribozyme triggered by a bacterial second messenger. Science. 329 (5993), 845-848 (2010).
  20. Wickiser, J. K., Cheah, M. T., Breaker, R. R., Crothers, D. M. The kinetics of ligand binding by an adenine-sensing riboswitch. Biochemistry. 44 (40), 13404-13414 (2005).
  21. Jucker, F. M., Phillips, R. M., McCallum, S. A., Pardi, A. Role of a heterogeneous free state in the formation of a specific RNA-theophylline complex. Biochemistry. 42 (9), 2560-2567 (2003).
  22. Zhao, Q., Lv, Q., Wang, H. Aptamer fluorescence anisotropy sensors for adenosine triphosphate by comprehensive screening tetramethylrhodamine labeled nucleotides. Biosens Bioelectron. 70, 188-193 (2015).
  23. Zhang, D., et al. A sensitive fluorescence anisotropy method for detection of lead (II) ion by a G-quadruplex-inducible DNA aptamer. Anal Chim Acta. 812, 161-167 (2014).
  24. Elenko, M. P., Szostak, J. W., van Oijen, A. M. Single-molecule imaging of an in vitro-evolved RNA aptamer reveals homogeneous ligand binding kinetics. J Am Chem Soc. 131 (29), 9866-9867 (2009).
  25. Elenko, M. P., Szostak, J. W., van Oijen, A. M. Single-molecule binding experiments on long time scales. Rev Sci Instrum. 81 (8), 083705 (2010).
  26. Zichel, R., Chearwae, W., Pandey, G. S., Golding, B., Sauna, Z. E. Aptamers as a sensitive tool to detect subtle modifications in therapeutic proteins. PLoS One. 7 (2), 31948 (2012).
  27. Baaske, P., Wienken, C. J., Reineck, P., Duhr, S., Braun, D. Optical thermophoresis for quantifying the buffer dependence of aptamer binding. Angew Chem Int Ed Engl. 49 (12), 2238-2241 (2010).
  28. Entzian, C., Schubert, T. Studying small molecule-aptamer interactions using MicroScale Thermophoresis (MST). Methods. 97, 27-34 (2016).
  29. Valenzano, S., et al. Screening and Identification of DNA Aptamers to Tyramine Using in Vitro Selection and High-Throughput Sequencing. ACS Comb Sci. 18 (6), 302-313 (2016).
  30. Jauset Rubio, M., et al. beta-Conglutin dual aptamers binding distinct aptatopes. Anal Bioanal Chem. 408 (3), 875-884 (2016).
  31. Breitsprecher, D., et al. Aptamer Binding Studies Using MicroScale Thermophoresis. Methods Mol Biol. 1380, 99-111 (2016).
  32. Stoltenburg, R., Schubert, T., Strehlitz, B. In vitro Selection and Interaction Studies of a DNA Aptamer Targeting Protein A. PLoS One. 10 (7), 0134403 (2015).
  33. Kinghorn, A. B., et al. Aptamer Affinity Maturation by Resampling and Microarray Selection. Anal Chem. 88 (14), 6981-6985 (2016).
  34. Duhr, S., Braun, D. Why molecules move along a temperature gradient. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (52), 19678-19682 (2006).
  35. Braun, D., Libchaber, A. Trapping of DNA by thermophoretic depletion and convection. Phys Rev Lett. 89 (18), 188103 (2002).
  36. Duhr, S., Arduini, S., Braun, D. Thermophoresis of DNA determined by microfluidic fluorescence. Eur Phys J E Soft Matter. 15 (3), 277-286 (2004).
  37. Jerabek-Willemsen, M., Wienken, C. J., Braun, D., Baaske, P., Duhr, S. Molecular interaction studies using microscale thermophoresis. Assay Drug Dev Technol. 9 (4), 342-353 (2011).
  38. He, K., Dragnea, V., Bauer, C. E. Adenylate Charge Regulates Sensor Kinase CheS3 To Control Cyst Formation in Rhodospirillum centenum. MBio. 6 (3), 00546 (2015).
  39. Brvar, M., et al. Structure-based discovery of substituted 4,5'-bithiazoles as novel DNA gyrase inhibitors. J Med Chem. 55 (14), 6413-6426 (2012).
  40. Pogorelcnik, B., et al. 4,6-Substituted-1,3,5-triazin-2(1H)-ones as monocyclic catalytic inhibitors of human DNA topoisomerase IIalpha targeting the ATP binding site. Bioorg Med Chem. 23 (15), 4218-4229 (2015).
  41. Jhaveri, S., Rajendran, M., Ellington, A. D. In vitro selection of signaling aptamers. Nat Biotechnol. 18 (12), 1293-1297 (2000).
  42. Khavrutskii, L., et al. Protein purification-free method of binding affinity determination by microscale thermophoresis. J Vis Exp. (78), (2013).
  43. Ramakrishnan, M., et al. Probing cocaine-antibody interactions in buffer and human serum. PLoS One. 7 (7), 40518 (2012).
  44. Chen, M., et al. Antiviral activity and interaction mechanisms study of novel glucopyranoside derivatives. Bioorg Med Chem Lett. 25 (18), 3840-3844 (2015).
  45. Wan, C., et al. Insights into the molecular recognition of the granuphilin C2A domain with PI(4,5)P2. Chem Phys Lipids. 186 (4,5), 61-67 (2015).
  46. Harazi, A., et al. The Interaction of UDP-N-Acetylglucosamine 2-Epimerase/N-Acetylmannosamine Kinase (GNE) and Alpha-Actinin 2 Is Altered in GNE Myopathy M743T Mutant. Mol Neurobiol. , (2016).

Tags

Биохимия выпуск 119 малое взаимодействие молекулы-аптамеры связывающие параметры Microscale Термофорез аффинность связывания стехиометрии термодинамика нуклеиновых кислот сайт связывания отображение
Картирование участок связывания аптамер на АТФ Использование Microscale Термофорез
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Entzian, C., Schubert, T. Mapping… More

Entzian, C., Schubert, T. Mapping the Binding Site of an Aptamer on ATP Using MicroScale Thermophoresis. J. Vis. Exp. (119), e55070, doi:10.3791/55070 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter