Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Mikro Termoforesis kullanarak ATP bir aptamer Bağlama Sitesi Haritalama

Published: January 7, 2017 doi: 10.3791/55070
Automatic Translation
1, 1
12bind GmbH

Introduction

moleküller arasındaki etkileşim doğasının temelidir. Bu nedenle, temel ve uygulamalı araştırma birçok alanda bilim farklı moleküler etkileşimlerin temel ilkelerini anlamaya çalışın. Mikro Termoforesis (MST) tamponların bir özgür seçim ile, çözelti içinde moleküler etkileşimlerin hızlı, hassas, düşük maliyetli ve kalite kontrollü karakterizasyonu gerçekleştirmek için bilim adamları sağlar. Birden fazla bağlanma ortakları 1-8 ile olay doğrulamaları, rekabet deneyleri ve deneyleri bağlayıcı, kütüphane taramaları da dahil olmak üzere analizler farklı türde anlatan, yalnız 2016 den, MST kullanarak 1000'den fazla yayın zaten vardır. Genel olarak, MST, moleküler etkileşimin herhangi bir bağlanma afinitesi (mM'ye pM), stokiyometri ve termodinamik, klasik bağlanma parametreleri, çalışmasına izin verir. MST büyük bir avantajı etkileşimi mümkün boyutundan bağımsız bağlayıcı olayları incelemek için yeteneğidir. hatta çal'ıBu küçük moleküller, ilaçlar, antibiyotikler, veya metabolitler olarak zorlu bir yöntem, küçük nükleik asit aptamerler arasındaki etkileşimler (nt 15-30) ve hedefler belirlenebilir.

Güncel state-of-the-art teknolojileri aptamer hedef etkileşimleri laboratuvar yoğun ve son derece karmaşık ya vardır karakterize ya da aptamer-küçük molekül 9,10 etkileşimleri ölçmek için başarısız. Plasmon Rezonans (SPR) deneyleri 11,12 ve İzotermal Titrasyon Kalorimetre (ITC) 13-15, izokratik elüsyon 16, denge fi ltration 17,18 olarak gerçekten etiket içermeyen Kalorimetre yaklaşımları, tabanlı Surface, in-line 19 Jel- sondalama deneyleri vardiya, Durduğunuz akış fl uorescence spektroskopisi 20,21, floresan anizotropi (FA) 22,23, tek-molekül fl uorescence görüntüleme 24,25 ve Bio-katmanlı enterforemetre (BLI) 26 de aptamer-küçük molekül ile kesin olmayan veya uyumsuz ya vardır etkileşimleri. diğer principaBu yöntemlerin l sorunları düşük duyarlılık, yüksek numune tüketimi, hareketsizlik, yüzeylerde toplu taşıma sınırlamalar ve / veya tampon kısıtlamaları vardır. Bu teknolojilerin sadece birkaç toplama ve adsorpsiyon efektleri için entegre kontroller sağlar.

MST bilim adamları bu tür proteinlerin 30-33 olarak aptamers ve küçük moleküllerin 27-29 arasındaki etkileşimleri, yanı sıra diğer hedefleri incelemek için bu sınırlamayı aşmak için için güçlü bir araç temsil eder. Teknoloji sıcaklık değişimleri ile moleküllerin hareketine dayanır. Olarak adlandırılan bu yönlendirilmiş hareket, "Termoforosis," molekülün 34,35 büyüklüğüne, ücret ve hidrasyon kabuğu bağlıdır. moleküle bir ligand bağlanmasının doğrudan değiştirildi thermophoretic hareket ile sonuçlanan, aşağıdaki parametrelerden en azından birinin değiştirecektir. Küçük boyutları ile ligandlar bağlı duruma bağlanmamış gelen boyut değişim açısından önemli bir etkiye sahip olmayabilir, ama onlar dr olabilir hidrasyon kabuğu ve / veya şarj amatic etkiler. Bağlama ortağı ile etkileşim sonrası moleküllerin thermophoretic hareketinde değişiklik temel bağlanma parametreleri 2,7,34,36,37 ölçülmesini sağlar.

Şekil 1A 'de gösterildiği gibi, MST cihazı flüoresan tespiti için aynı optik kullanılarak cam kılcal olan numune üzerine odaklanmış bir kızıl ötesi lazer oluşur. Lazer sıcaklık gradyanı (2-6 ° C DT) kurarken tryptophans 6 ya da flüoresan bir etkileşim, ortak olarak 3,8 arasında içsel fl uorescence ile proteinlerin thermophoretic hareketi izlenebilir. Boşluk, DT, içinde sıcaklık farkı Soret ile belirlenebilir yüksek bir sıcaklıkta alanında azalması veya molekül birikmesine yol açar, Katsayı (St):

g "/>

C sıcak ısıtılmış bölgede konsantrasyonunu temsil eder, ve C, soğuk ilk olarak soğuk bölge konsantrasyonudur.

Şekil 1B, ilgili zaman dilimlerinde ayrılabilir farklı aşamalarında oluşan MST hareket profilinin (zaman iz), tipik bir MST deney sonuçları gösterildiği gibi. başlangıç ​​floresans kesin bir başlangıç ​​floresans tanımlamak ve ışıkla ağartma ya photoenhancement kontrol etmek için sıcaklık gradyanı yokluğunda yer alan birinci 5 saniye cinsinden ölçülür. Sıcaklık Jump (T-Jump) hangi floresan değişiklikleri thermophoretic hareketinden önce safhasını oluşturuyor. floresanstaki bu ilk azalma kuantum verimi uorophore fl ısıya bağlı değişikliklere bağlıdır. Termoforosis aşaması nedeniyle sabit durum dağılım kadar molekül thermophoretic hareketine flüoresans azalır (veya artar) ulaşıldığında edildiği izler.Lazer kapatıldıktan sonra Şekil 1B gösterildiği gibi ters TJump ve BM uorescent moleküllerin beraberinde geri difüzyon gözlenebilir. Temel bağlanma parametreleri erişmek için, etkileşim ortakları farklı molar oranları incelenmiş ve karşılaştırılmıştır. Optik görebilir molekülü sabit tutulur ve etiketlenmemiş ligandın artan bir miktarı ile temin edilir ise tipik olarak, 16 farklı oranlar bir MST deneyde incelenmiştir. İki bağlanma ortakları arasındaki etkileşim Termoforosis değişiklikleri uyarır ve bu nedenle normalize fl uorescence olarak aşağıdaki şekilde hesaplanır F norm:

denklem

F sıcak ve F soğuk MST izleri de fi ned zaman noktalarında fl uorescence yoğunlukları ortalama temsil eder. Bağlanma ilgileri (Kd ve EC50 değerleri) Curv hesaplanabilire uydurma (Şekil 1C).

Genel olarak, MST her türlü moleküler etkileşimleri çalışmak için güçlü bir araçtır. ve 25-nt kısa ssDNA aptamer DH25.42 (7.9 kDa); Bu yazının küçük molekül adenozin trifosfat (0.5 kDa ATP) arasındaki zorlu etkileşimi karakterize bir protokol sunar. Yazının boyunca ATP molekülü üzerindeki aptamer bağlanma yeri ATP adenin grubuna aşağı eşleştirilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Aptamer Çalışma Stok 1. Hazırlık

  1. Üreticinin talimatlarını takip ve 100 uM nihai konsantrasyon ulaşan su (18 referans 5-Cy5 CCTG GGGGAGTATTGCGGAGGAAGG-3, sıra) oligonükleotidi çözülür.
  2. Bağlama tamponu ile 200 nM oligonükleotid stokları seyreltilerek aptamer çalışma çözeltisi hazırlayın (20 mM Tris, pH 7.6, 300 mM NaCI, 5 mM MgCl2,% 0.01 Tween 20).
  3. 90 ° C'de 2 dakika süreyle inkübe karışımı Numune hemen buz üzerinde soğuması ve oda sıcaklığında örneğini kullanır.

Ligand seyreltme serisi 2. hazırlanması

  1. ) SAM (her ligandın (adenozin trifosfat (ATP), adenosin difosfat (ADP), adenosin monofosfat (AMP), adenin, guanosin trifosfat (GTP), sitosin trifosfat (CTP) deoksiadenosin trifosfat (dATP), ve S-adenosil metiyonin ; 10 mM stok her), bir 16 adım seri diluti hazırlamaküzerinde 200 ul mikro reaksiyon tüpleri.
    NOT: agrega kaldırmak için yardımcı olabilir 14.000 xg'de 5 dakika boyunca ligand stoklarının Santrifüj. Düşük hacimli, düşük bağlanma reaksiyon tüpleri tüp duvarları moleküllerin adsorpsiyonu önlemek için tavsiye edilir.
  2. Tahmini yakınlığından daha yüksek, en az 50 kez maksimum konsantrasyonu ile başlar ve her seyreltme basamağında% 50 lıgand konsantrasyonunu azaltır.
    NOT: Kontrol yazılım uygulanan konsantrasyon bulma aracı bağlama verileri taklit ve seyreltme serileri için doğru konsantrasyon aralığı bulma yardımcı olur.
  3. 16 mikro tepkime tüpleri içine 2 aptamer bağlanma tamponu 10 ul ekle borunun 1 ligand stok (10 mM) 20 ul doldurun.
  4. Transferi 10 tüp 2 tüp 1 ul ve yukarı pipetleme ve birkaç kez aşağı düzgün karıştırın. Bir sonraki tüp 10 uL aktarın ve kalan tüpler için bu seyreltme tekrarlayın.
  5. Son tüpten 10 ul fazlalığı atın. Herhangi b önlemekUffer dilüsyon etkisi. tüp 1 ve tüpler 2-16 tampon aynı olmalıdır.

Nihai reaksiyon karışımı 3. hazırlanması

  1. Pipetleme hatalarını en aza indirmek için, bireysel bağlama 20 | il hacminde reaksiyonları (aptamer hazır çözelti + ilgili ligand seyreltme 10 ul, 10 ul) hazırlayın. Sadece 4 ul bir hacim kılcal ll fi oluşturulmasına yeterli olduğunu.
  2. Her bir bağ seyreltme 10 ul 200 nM aptamer çalışma çözeltisinin 10 ul ilave edin ve pipetleme ve birkaç kez aşağı doğru karıştırılır.
  3. numune içine kılcal damarların batırarak standart kılcal damarların içine numunelerin ll oda sıcaklığında ve fi 5 dakika boyunca örnekleri inkübe. Daha uzun inkübasyon süreleri, bazı etkileşimler için gerekli olabilir; Bununla birlikte, 5 dakika için en uygundur. DEĞİL optik ölçüm alınacak orta kısmında, üzerinde, sadece tarafta kılcal dokunun.
  4. th üzerine kılcal yerleştirine kılcal tepsisi ve MST cihazı başlatmak.

4. MST Cihazı Başlangıç

NOT: Cihaz iki önceden yüklenmiş yazılım paketlerini, üretilen verilerin yorumlanması için yazılımın ' "' analiz kontrolü deneysel koşullar ve teknik kurulumu için yazılım '" sağlar.

  1. MST cihazın içine kılcal tepsisini yerleştirmeden önce, kontrol yazılımını başlatmak ve 'açılır menüden' " 'sıcaklık kontrolü de" el sıcaklık kontrolü sağlamak' seçerek genel istenilen sıcaklığa ayarlayın. Bu şekilde, 25 ° C'ye kadar sıcaklık ayarlayın.
    Not: MST araçlar ısı kontrollü, 45 ° C 22 arasında olabilir.
  2. Beklenen seviyeye ulaşmak için sıcaklık bekleyin ve ardından MST cihazın içine kılcal tepsiye yerleştirin.
  3. Cy5 boyalar için "kırmızı 'LED kanalı ayarlamak ve bir fl uorescenc kazanmak için LED güç ayarlamakStandart sensör MST cihaz 300 ila 1000 floresans birimleri e sinyali. % 25 LED güç bu çalışmada kullanılmıştır.
    NOT: 6,000 18,000 floresan üniteleri yüksek hassasiyetli sensörü ile MST için tavsiye edilir.

5. Kılcal Tarama

  1. "Kontrol" yazılım üzerinde kılcal konumunu seçme ve tıklayarak numunenin farklı kalite yönlerini kontrol etmek için bir kılcal taraması yürütmek "kap tarama başlatmak" MST ölçümü başlamadan önce.
  2. floresan geliştirme / söndürme ve yazılım sokma etkileri (zirveleri U-şeklinde veya düzleştirilmiş) için kılcal taraması kontrol edin.
    Not: algılama ve floresan işlenmesi ve yapışma etkileri hakkında daha fazla ayrıntı tartışma bulunabilir.

6. MST Ölçümü

NOT: MST ölçümü başlamadan önce, dışlamak emin olun yapışmasını etkileri, geliştirme / söndürme etkisi, ya dapipetleme hataları ve kılcal tarama fl uorescence sinyali oluşturulmasına yeterli olduğunu gösterir emin olun. Daha fazla bilgi için, tartışma bakın.

  1. . '' Kontrolü "yazılım ilgili kılcal konumuna sulandırma dizileri 'nden ligand konsantrasyonları atama aptamer liganda karıştırma seyreltme adım olarak (1: 1).
  2. Kılcal # 1 için ligand yüksek konsantrasyon (5 mM) doğru olarak girin seyreltme türünü seçin (burada, 1: 1), maksimum konsantrasyon tıklayın ve otomatik kılcal kalan konsantrasyonlarını # 2- atamak için sürükle işlevini kullanın 16. düşük konsantrasyon 152.6 nM'dir.
  3. kontrol yazılımı ilgili bölümündeki fl uorescent aptamer (burada, 100 nM) konsantrasyonunu girin.
  4. 5 sn fl uorescence tespit varsayılan ayarları kullanın 30 sn MST kayıt ve lazer t inaktivasyonu sonra başka bir 5 saniye floresan kayıt o moleküllerin geri emilimini izlemek.
  5. kontrol yazılımı ilgili bölümündeki% 20 lazer gücünü ayarlayın.
    NOT: sipariş en iyi sinyal-gürültü oranını almak ve belirsiz etkileri önlemek için ise,% 20-40 bir lazer güç tavsiye edilir. Belirli durumlarda, daha yüksek bir lazer gücü bağlanmamış ve bağlanmış moleküller, iyi bir ayırma için gerekli olabilir.
  6. Hedef klasörü seçtikten sonra deney kaydedin ve 'Başlat MST ölçümü "düğmesine basarak MST ölçümü başlatmak.
    NOT: .ntp dosyası hedef klasörde oluşturulur. Bu kurulumu kullanarak, bir ölçüm 10-15 dakika sürer.
  7. EC50 değeri daha doğru bir şekilde belirlenmesi için en az iki kez deney prosedürü tekrarlayın.
    Not: Teknik tekrarlanabilirliğini test etmek amacıyla, aynı kılcal taranabilir birkaç kez (Teknik tekrarlar).

7. MST Veri Analizi

nt "> Not: analiz yazılımı ölçüm sırasında fl y ilişkin verilerin analizini sağlayan analiz yazılımı ligand konsantrasyonu 37 karşı MST zaman izleri ve normalize fl uorescence (F norm) değişiklikleri çizer..

  1. MST analiz yazılımı (MO.Affinity Analizi) başlatın ve hedef klasörden .ntp dosyasını yüklemek. veri seçme menüsünde analiz türü olarak "MST" i seçin.
    Not: liganda bağımlı floresans etkileri durumunda, başlangıç ​​floresans analizi için seçilebilir.
  2. sürükle-bırak yöntemiyle veya ilgili deneysel çalışma altındaki "+" düğmesine basarak yeni bir analize ilgili teknik veya biyolojik run (ler) ekleyin.
  3. Deneyin, MST izleri, kılcal tarama, kılcal şekli, ilk floresan ve ağartma oranı özellikleri hakkında bilgi edinmek için ilgili deneysel çalışma Aşağıdaki bilgiler düğmesine basın.
    NOT: Bu ham veriler can albu yüzden analizin daha sonraki adımlarda kontrol edilmelidir.
  4. Görme görünür darbelere ve ani olarak toplama ve yağış etkilerinden MST izleri, kontrol edin.
    NOT: algılama ve toplama etkilerinin aktarılması konusunda daha fazla bilgi için, tartışma okudum.
  5. Görme düzleştirilmiş ya da U-şekilli zirveleri olarak görünür kılcal tarama ve adsorpsiyon etkileri kılcal şekil bindirme, kontrol edin. Görme kılcal tarama ve floresan efektleri için ilk floresan inceleyin. Görme etkileri photobleaching için ağartma oranını kontrol edin.
  6. doz-yanıt moduna geçin ve ilgili düğmeye basarak kadar "uzman" mod analizi ayarını değiştirin. MST değerlendirme stratejisi olarak "T-Jump" seçeneğini seçin.
  7. eğri fi tting için "Tepe" modelini seçin. bağlayıcı parametreleri otomatik olarak hesaplanacaktır. "Sonuçları karşılaştırmak" menüsünden normalleşme ilgili türünü seçerek veri normalleştirmek. ihracatBir .xls veya .pdf gibi ya veri.
    NOT: bağlayıcı grafiğin Aşağıdaki tabloda hesaplanan bağlanma parametreleri özetlemektedir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Bu çalışmada, MST ATP DH25.42 DNA aptamer 18 bağlanma sitesi karakterize etmek için uygulanmıştır. ATP veya rasgele bir veya daha fazla fluorophores 38-40 ile etiketlenmiş proteinler ile küçük moleküller ATP'ye taklit etkileşimlerini karakterize eden başka çalışmalardan farklı olarak, bu çalışma 5'ucundaki bir Cy5 molekülü ile 7.9 kDa ssDNA aptamer etiketlenmiş bir versiyonunu içerir . Farklı ATP türevlerinin ve ilgili moleküllerin, çeşitli pozisyonlarda ATP'den farklı tüm ATP molekülü üzerindeki bağlanma sitesi eşlemek için kullanılmıştır. Farklı ligandların (% 50 her biri tarafından lıgand konsantrasyonunu azaltmak 16 adımda,) seyreltme serisi hazırlanır ve Cy5 etiketli aptamer sabit bir miktarı ile karıştırılmıştır. Numuneler 25 LED ve% 20,% lazer gücü standart kılcal damarların analiz edildi. Hareket profilleri (MST zaman izleri) kaydedildi ve T-Jump fazında elde edilen floresan birimleri, ligand concentr karşı çizilmiştirtirme (Şekil 1C karşılaştırın). Eğri uydurma EC50 değerleri ile sonuçlanır, Hill denklemi uygulanarak gerçekleştirilmiştir. 5 bağımsız biyolojik tekrarlar (4 farklı operatörler, 2 farklı aptamer hisse senedi, 2 farklı ATP stoklar) ise, ATP-aptamer etkileşim 6 ila 13 ünite negatif bağlayıcı genlik ve 52.3 ± 5.0 uM ortalama EC 50 değeri (Şekil 2A gösterir ). Hata bağlama grafiklerde bar ve afinite verilerinin sunulan "±" 5 biyolojik tekrarlar (farklı kılcal 5 bağımsız ölçümler) standart sapmasını temsil eder. [2,8,5'- 3H] -adenosine ve ATP agaroz ile DH25.42 aptamer etkileşim için daha önce rapor afiniteleri karşılaştırılabilir. Aptamer olan radyo-etiketli adenozinin etkileşim santrifüj filtre deneyi ile belirlendi ve 6 ± 3 uM'lik bir afinite (Kd) belirlenmiştir. ATP Hareketsizleştirmesi ile izokratik elüsyon deneyleri13 uM 18,41 arasında bir afinite (Kd) ile sonuçlanmıştır agaroz ize.

Daha iyi bir yan-yana karşılaştırma için veriler aşağıdaki denklem kullanılarak (FB bağlı fraksiyonu) kompleks moleküllerin kesir normalize edilebilir:
denklem
değeri (C) konsantrasyonu c ölçülen MST değeri olan, serbest bağlanmamış durumda (düşük konsantrasyon) MST değeridir ve kompleks tamamen bağlanmış durumda (Şekil 2B) MST değerdir. Şekil 2C gösterildiği gibi bu normalleşme, bir grafikte farklı ligandların sonuçlarını karşılaştırmak için ideal bir yerdir. nu ATP farklılık tespit af fi ADP (biyolojik çiftleri 63.6 ± 5.9 uM), AMP nities (biyolojik çiftleri 91.6 ± 9.1 iM) ve SAM (biyolojik çiftleri 44,4 ± 3,2 iM),Fosfat grupları mber, bu pozisyon ya hiç ya da aptamer (Şekil 2C ve D) bağlanma davranışı üzerindeki etkilemeli sadece küçük olduğu anlamına gelmektedir. dATP da biraz azalmış af fi topluluğun (biyolojik çiftleri 64.4 ± 6.1 uM) ile aptamer bağlı olduğu gibi ATP riboz C2 karbonuna OH grubu da, önemli bağlanma yeri olmaktan çıkarılmış olabilir. CTP etkileşim bu grubun önemini gösteren, aptamer bağlayıcı olmayan sonuçlandı pirimidin grubuna ATP pürin grubunun değiştirilmesi. bağlama sahası ATP molekülün bu kısmının olması gerektiğini gösteriyor (biyolojik çiftleri olarak) 141.7 ± 9.4 uM bir afinite ile adenin bağlı aptamer. Pürin molekülleri GTP ve ATP ATP aptamer ana bağlanma bölgesini temsil eden Şekil 2B, temsil yeşil gölgeli alanda farklıdır. Başka bir çalışmada farklı ATP türevleri olmayan nicel yıkama deneyleri kullanılanBu MST çalışmaya 18 karşılaştırılabilir sonuçlar gösterdi ATP agaroz, bir radyoaktif olarak işaretlenmiş aptamer Zehir.

şekil 2
Şekil 1: Mikro Termoforesis. (A) MST teknolojisi teknik kurulum gösterilmektedir. optik, böylece optik görünür molekülün floresan sinyali tespit, cam kapiller merkezine odaklanır. Bir IR lazer optik sistemin gözlem penceresi bir sıcaklık gradyanı kurmak için kullanılır. Floresanstaki değişimler, bir ısı gradyanı içinde solüsyon (B) MST zaman iz hareket pro fi moleküllerin molekül thermophoretic hareketini izlemek için kullanılabilir. Lazer kapalı iken başlangıç ​​floresans 5 saniye için ölçülür. lazer açılması bir sıcaklık farkı oluşturur. acil T-Jump p sonraFL uorescent boya ısı indüksiyondan sonra, sinyal verimini düşürür ki Hase, thermophoretic hareketi gerçekleşir ve 30 saniye süreyle gözlenmiştir. Lazer kapatıldıktan sonra, moleküller geri diffüz. Tipik MST deneyi (C) Sonuçlar: (Sol) flüoresan molekül aynı konsantrasyon ve etiketlenmemiş ligandın artan konsantrasyonu içeren 16 kılcal; MST zaman izleri kaydedilir ve ilk floresan normalize edilir. (Sağ) normalize fl uorescence; F, soğuk ve F, sıcak arasındaki fark ligand konsantrasyonuna karşı çizilmiştir. Böyle bağlanma af fi topluluğun gibi parametreler, bağlama bu veriler verimleri bir eğri fit. Elsevier, Yöntemleri 28 izniyle yeniden yazdırmak; Lisans numarası 3890230800113. bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

şekil 2
Şekil 2: MST veri analizi. (A), temel MST TJump sinyalinden türetilen mesafe kadar taşınmış normuna (‰), uorescence normalize fl düzeltilmiş (uM olarak) ATP konsantrasyonuna karşı çizilmiştir. Tepesi denklemi (EC 50) eğri uydurma uygulanmıştır. Hata çubukları beş biyolojik tekrarlar standart sapmasını temsil eder. (B) söz konusu veri seti bağlanan parçaların normalleştirildi A'da veri Fraksiyon bağlı grafiği ve bu normalize ortalama veri bağlama grafikte gösterilmiştir. Hata çubukları 5 biyolojik tekrarlar standart sapma gösterir. (C), fraksiyon-bağlı grafiği aptamer farklı ligandlar nicel bir karşılaştırma (Hill uygun) gösterir. Hata çubukları standart Devia temsiliki biyolojik tekrarlar yon. Aptamer Farklı ligandlar (D) bağlama af Fi nities (EC50). yeşil gölgeli alan ATP adenin grup aptamer bağlama sahasını gösterir. Bu rakam Elsevier, Yöntemleri 28 modifiye edilir; önceki çalışmada lisans numarası 3890230800113. Veri kümeleri tekrar analiz ve bu çalışma kapsamında genişletilir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 3,
Şekil 3: MST deneyler için deney optimizasyonu. (A) Protein adsorpsiyon ve yapıştırma etkileri kılcal tarama tespit edilebilir. Bu düzleştirilmiş ya da U-şekilli bir tepe olarak düzensiz Zirve şekilleri, cam yüzeyine numune malzemesinin yapışmasını göstermektedir. Ckılcal türünü (standart, prim veya hidrofobik) asılı düzenli bir tepe şeklinde sonuçlanan, molekül adsorpsiyonu önleyebilir. Agrega çarpma ve sivri olarak orada tespit edilebilir beri (B) MST zaman izleri de, bir kalite kontrol olarak hizmet vermektedir. Deney koşulları (örneğin, Pluronik F-127 ya da farklı pH değerlerinde ya da tuz konsantrasyonu benzeri deterjanlar dahil olmak üzere, örneğin) moleküllerin çözünürlüğünü arttırmak optimize edilebilir. Santrifüj büyük agrega kaldırmak için yardımcı olabilir. optimal veri kalitesini sağlamak için, MST zaman izleri verilen örneğe benzemesi gerekir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Kalite kontrolleri:

Spesifik olmayan yapışma / yüzeylere örnek malzeme, hem de çekiş etkileri adsorpsiyon, afinite verinin kalitesi üzerinde önemli bir etkisi vardır. Ancak, sadece bir kaç state-of-the-art teknolojileri izlemek ve bu etkilerden kaçınmak için doğru ve hızlı seçenekler sunuyoruz. MST algılar ve teknik kurulum adım adım optimizasyonu sağlayan, bu sorunların üstesinden gelmek için yardımcı entegre kalite kontrolleri sunmaktadır. toplama / yağış etkileri (adım 7.7) hareket profillerinde izlenebilir ise yapıştırma ve floresan etkileri hakkında önemli bilgiler, kılcal tarama ve kılcal şekli (5.2 ve 7.5 adımları) elde edilebilir. Bu kontroller veri kalitesinin sürekli iyileştirilmesi için etkinleştirin ve protokol kritik adımlar temsil etmektedir.

adsorpsiyon etkileri ve sorun giderme Algılama:

kılcal tarama öncelikle bir ini olarak yapılırFark sıcaklık adım üzerine floresan tarama tepsi tutucu kılcal damarların konumunu belirlemek için. Her tepe MST ölçümü için başlangıç ​​noktası gösteren bir kılcal temsil eder. pik şekli Görsel inceleme MST deney başlamadan önce yapılmalıdır önemli bir kalite kontrol olan cam yüzeyine moleküllerin adsorpsiyonu, belirlenmesini sağlar. Kılcal şekil kalıbı kılcal (Şekil 3A, üst levha) ve iç cam yüzeyine moleküllerin adsorpsiyon / yapışmasını gösteren, ya da U biçimli benzer piklerin düzleştirilmiş, inişli çıkışlı bir pik şekillerinin kolay tespiti sağlar. Farklı kılcal moleküllerin çözünürlük ve minimum adsorpsiyonu sağlamak için kılcal tipte (standart, prim ve hidrofobik) yardım kaplı. Kılcal damarlar önce bağlama deneyleri uygunluğu test edilmelidir. Tween (0.005-0.1%) ve Pluronic F 127 (0.01-0.1%) MA gibi deterjanlary de belirsiz adsorpsiyon etkilerini önlemek. Deneyin bu aşamada Optimizasyonu yüksek veri kalitesi (alt panel Şekil 3A karşılaştırın) için gereklidir.

floresan etkileri ve sorun giderme Algılama:

Taranan kılcal damarların zirve yüksekliği Varyasyonları örnek özelliklerine ilişkin bilgi başka bir katman sunuyoruz. Kılcal floresanstaki rastlantısal farklılıklar, bir taraftan, diğer taraftan, hataları pipetleme veya bağlı olduğu büyük ölçüde floresan arttırabilir tarama bölümü içinde büyük örnek agrega kaynaklanabilir. Yüksek pipetleme doğruluğu seyreltme etkilerini önlemek için zorunludur. aşağı yukarı pipetleme tüm çözümler Karıştırma ve daha fazla hassasiyeti artırır. Buna ek olarak, her kılcal tutarlı tamponu tutmak esastır. toplama etkilerini ele Stratejiler bir sonraki paragrafta sunulmaktadır.

increa ile floresan sistemik değişikliklerligand konsantrasyonu şarkı sık sık ligand bağımlı söndürme / geliştirme etkileri olduğunu göstermemektedir. "SD Testi" spesifik olmayan floresans kaybı bağlanma ile indüklenen Floresan değişiklikleri, ayırt etmek amacıyla gerçekleştirilir; Bu test, denatüre edici koşullar altında floresan yoğunlukları izler. liganda bağımlı floresans etki durumunda, denatüre koşulları altında floresan yoğunlukları, titran konsantrasyonundan bağımsız aynı olmalıdır. floresan yoğunlukları fark yine de bu şartlar altında, mevcut ise, malzemenin, ya bağlı tüp duvarları spesifik olmayan adsorpsiyon ya da bağlı agregasyonu ve daha sonra santrifüj kayboldu.

SD Testi gerçekleştirmek için, ilk 10 ul son ligand seyreltme basamağının 10 ul, her dikkatli bir şekilde 2x SD Mix (% ​​4 SDS, 40 mM DTT) içinde 10 ul ihtiva eden yeni bir tüpe aktarılır. örnekler karıştırılır ve molekülleri 95 ° C'de 5 dakika boyunca denatüre bulunmaktadır. aftekılcal damarların içine örnekleri doldurma r, floresan yoğunlukları ölçülür. Bir liganda bağımlı floresans etkisi tespit edilirse, veri floresan yoğunluğu değişikliklerden çıkarılabilir bağlama bilgileri doğrudan analiz edilebilir.

toplama etkileri ve sorun giderme Algılama:

Inişli çıkışlı, düzensiz MST zaman izleri agregasyonu ve / veya çökelme etkisi (Şekil 3B, üst panel) gösterir. Toplu olmayan numune malzeme temiz ve pürüzsüz bir thermophoretic hareket profili (Şekil 3B, alt panel) gösterir. Örnek malzeme santrifüj öncesi, deterjan eklenmesi (0.005-0.1% Tween-20, 0.01-0.1% Pluronic F-127 ya da benzer), BSA kullanımı ((5-10 dk xg 14,000) kullanımı > 0.5 mg / ml), ya da tampon koşulları (pH ve iyonik kuvveti değişimi) çekiş etkilerini en aza indirmek için ve veri kalitesini optimize etmek için önerilmektedir. Yüksek kaliteli veriler elde etmek amacıyla,çekiş etkilerini en aza indirmek için önemlidir.

Veri analizi ve eğri uydurma:

Bir thermophoretic hareket profili ayrı olarak ya da eş zamanlı olarak ya da kontrol edilebilir, farklı fazlar ayrılmıştır. T-Jump fluorophores içsel bir özelliği temsil eden sıcaklık değişimi üzerine floresan verim ani değişikliği anlatılmaktadır. Çok bağlanma üzerine florofor ya da konformasyon değişikliklerinin yakın bir ortamda bağlama Doğrudan T-Jump etkiler. yavaş Termoforosis oluşturulan kompleksin genel yapısı hakkında bilgi veren, sıcaklık alanında moleküllerinin hareketi ifade eder. Veri analizi varsayılan tipi bağlama parametrelerini belirlemek için her iki fenomeni istismar, "Termoforesis + T-Jump" ayarını kullanır. İki faz zıt yönlere sahip durumda, ayrı ayrı aşamaları analiz etmek önerilir. O zaman etkileri ve Molec farklı türler unutmayınules Termoforosis ve T Toplam afinite farklılıklara yol açabilir. Analiz seçeneği başka bir türü hareketi profilinin belirli bölgelerde soruşturma sağlayan manuel ayar vardır. toplama veya konveksiyon nedeniyle bozukluklar bu şekilde bırakılabilir. veri kalitesini artırmak amacıyla, imleçleri toplama sinyalleri daha önce ayarlanmış olabilir. konveksiyon zamana bağımlı bir süreç olduğundan erken Termoforosis incelenmesi yaygın az gürültü ile veri üretir. Bu erken manuel ayar yüksek yüksek lazer gücü (% 80) ile deneyler için tavsiye edilir. veri analizi ayarını seçerek üzerine, analiz yazılımına entegre iki uydurma modeller bağlayıcı eğriye uyacak şekilde uygulanabilir. 1 bağlayıcı modları veya aynı afinite sahip birden fazla bağlanma bölgeleri için: Kitle eylem yasasından Kd için uygun fonksiyon 1 için uygundur. Konsantrasyonu bağımsız ayrışma sabiti Kd bou arasında bir denge tarifnd ve bağlanmamış devlet; Bu durumda, bir liganda bir bağlanma afinitesi ölçüldü. Hill denklemine türetilen konsantrasyona bağımlı EC50 değeri ilişkili halde olan işaretli moleküllerin yarısının bir ligandın etkili bir dozunu ifade eder. Tepesi uyum onlar kooperatif, özellikle bağlama modelleri değerlikli uygulanmalıdır.

Entegre kalite kontrolleri gibi SPR veya ITC gibi teknolojiler üzerinde MST biri büyük bir avantaj oluşturmaktadır. Bu kontroller optimal veri kalitesini sağlamak için teknik kurulum hızlı ve kolay optimizasyonu için izin verir. Zaman verimli ölçümler (15 dakika içinde Kd) ve immobilizasyon içermeyen kurulum ek olarak, MST da lizatları ve serumlar 5,42,43, moleküler etkileşimin değerlendirilmesi izin, tamponlar serbest sunmaktadır. Moleküler Termoforosis boyutu, ücret ve moleküllerin hidrasyon kabuğu bağlı olması nedeniyle, herhangi bir sınırlama yokturMST ölçümler sırasında ölçülen etkileşim ortakları boyutu. Birlikte düşük numune tüketimi ile pM mM dinamik af fi dilmekte aralığı, MST teknolojisi güçlü tamamlar. Bu MST gibi bağlanma afinitesi, stokiometri ve termodinamik gibi temel bağlayıcı parametreler hakkında kesin veriler üretir olduğunu belirtmekte yarar var. Bununla birlikte, MST ilgili k ölçümü sağlar ve fiyat koff etmez. Buna ek olarak, tek bir çok MST deneyleri için, bir flüoresan modifikasyon etkileşimi mümkün birine eklenmelidir, bu dikkate alınmalıdır. Oluşturulan veriler, SPR ve ITC 32,43-46 olarak state-of-the-art teknolojileri ile iyi bir uyum içindedir. Ancak bu veriler deneyler daha hızlı ve daha az malzeme tüketir, kalite-kontrol edilir. Genel olarak, MST bazı ek avantajları ile state-of-the-art teknolojileri için güçlü bir teknoloji ortogonal temsil eder.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

CE ve TS biyofiziksel analitik hizmet vermektedir 2bind GmbH çalışanlarıdır. Bu video-makale için yayın ücreti 2bind GmbH tarafından karşılanır.

Acknowledgments

Yazarlar hiçbir onayları var.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Aptamer binding buffer 20 mM Tris pH 7.6; 300 mM NaCl; 5 mM MgCl2; 0.01% Tween-20
Fluorescently labeled ATP aptamer IDT, Leuven, Belgium sequence: DH25.42 50-Cy5-CCTGGGGGAGT-
ATTGCGGAGGAAGG-3
ATP Sigma Aldrich, Germany  A2383 10 mM stock solutions stored at - 20 °C
ADP Sigma Aldrich, Germany  A2754 10 mM stock solutions stored at - 20 °C
AMP Sigma Aldrich, Germany  A2252 10 mM stock solutions stored at - 20 °C
Adenine Sigma Aldrich, Germany  A8626 10 mM stock solutions stored at - 20 °C
SAM Sigma Aldrich, Germany  A7007 10 mM stock solutions stored at - 20 °C
dATP Sigma Aldrich, Germany  11934511001 10 mM stock solutions stored at - 20 °C
CTP Sigma Aldrich, Germany  C1506 10 mM stock solutions stored at - 20 °C
GTP Sigma Aldrich, Germany  G8877 10 mM stock solutions stored at - 20 °C
Monolith NT.115  NanoTemper Technologies, Munich, Germany MO-G008 Blue/Red Channel
MST device with standard detector, Monolith NT115 pico is MST device with high sensitivity detector
Monolith NT.115 capillaries Standard NanoTemper Technologies, Munich, Germany MO-K002
Eppendorf PCR tubes Eppendorf, Germany 30124537
Monolith control software. 2.1.33, pre-installed on the device NanoTemper Technologies, Munich, Germany
MO.affinity analysis v2.1.1 NanoTemper Technologies, Munich, Germany
Kaleidagraph 4.5.2 Synergy Software

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Linke, P., et al. An Automated Microscale Thermophoresis Screening Approach for Fragment-Based Lead Discovery. J Biomol Screen. 21 (4), 414-421 (2015).
  2. Jerabek-Willemsen, M., et al. MicroScale Thermophoresis: Interaction analysis and beyond. Journal of Molecular Structure. 1077, 101-113 (2014).
  3. Zillner, K., et al. Microscale thermophoresis as a sensitive method to quantify protein: nucleic acid interactions in solution. Methods Mol Biol. 815, 241-252 (2012).
  4. Zhang, W., Duhr, S., Baaske, P., Laue, E. Microscale thermophoresis for the assessment of nuclear protein-binding affinities. Methods Mol Biol. 1094, 269-276 (2014).
  5. Wienken, C. J., Baaske, P., Rothbauer, U., Braun, D., Duhr, S. Protein-binding assays in biological liquids using microscale thermophoresis. Nat Commun. 1, 100 (2010).
  6. Seidel, S. A., et al. Label-free microscale thermophoresis discriminates sites and affinity of protein-ligand binding. Angew Chem Int Ed Engl. 51 (42), 10656-10659 (2012).
  7. Seidel, S. A., et al. Microscale thermophoresis quantifies biomolecular interactions under previously challenging conditions. Methods. 59 (3), 301-315 (2013).
  8. Schubert, T., et al. Df31 protein and snoRNAs maintain accessible higher-order structures of chromatin. Mol Cell. 48 (3), 434-444 (2012).
  9. McKeague, M., Derosa, M. C. Challenges and opportunities for small molecule aptamer development. J Nucleic Acids. 2012, 748913 (2012).
  10. Ruscito, A., DeRosa, M. C. Small-Molecule Binding Aptamers: Selection Strategies, Characterization, and Applications. Front Chem. 4, 14 (2016).
  11. Chang, A. L., McKeague, M., Liang, J. C., Smolke, C. D. Kinetic and equilibrium binding characterization of aptamers to small molecules using a label-free, sensitive, and scalable platform. Anal Chem. 86 (7), 3273-3278 (2014).
  12. Chang, A. L., McKeague, M., Smolke, C. D. Facile characterization of aptamer kinetic and equilibrium binding properties using surface plasmon resonance. Methods Enzymol. 549, 451-466 (2014).
  13. Jing, M., Bowser, M. T. Methods for measuring aptamer-protein equilibria: a review. Anal Chim Acta. 686 (1-2), 9-18 (2011).
  14. Sokoloski, J. E., Dombrowski, S. E., Bevilacqua, P. C. Thermodynamics of ligand binding to a heterogeneous RNA population in the malachite green aptamer. Biochemistry. 51 (1), 565-572 (2012).
  15. Burnouf, D., et al. kinITC: a new method for obtaining joint thermodynamic and kinetic data by isothermal titration calorimetry. J Am Chem Soc. 134 (1), 559-565 (2012).
  16. Mannironi, C., Scerch, C., Fruscoloni, P., Tocchini-Valentini, G. P. Molecular recognition of amino acids by RNA aptamers: the evolution into an L-tyrosine binder of a dopamine-binding RNA motif. RNA. 6 (4), 520-527 (2000).
  17. Jenison, R. D., Gill, S. C., Pardi, A., Polisky, B. High-resolution molecular discrimination by RNA. Science. 263 (5152), 1425-1429 (1994).
  18. Huizenga, D. E., Szostak, J. W. A DNA aptamer that binds adenosine and ATP. Biochemistry. 34 (2), 656-665 (1995).
  19. Lee, E. R., Baker, J. L., Weinberg, Z., Sudarsan, N., Breaker, R. R. An allosteric self-splicing ribozyme triggered by a bacterial second messenger. Science. 329 (5993), 845-848 (2010).
  20. Wickiser, J. K., Cheah, M. T., Breaker, R. R., Crothers, D. M. The kinetics of ligand binding by an adenine-sensing riboswitch. Biochemistry. 44 (40), 13404-13414 (2005).
  21. Jucker, F. M., Phillips, R. M., McCallum, S. A., Pardi, A. Role of a heterogeneous free state in the formation of a specific RNA-theophylline complex. Biochemistry. 42 (9), 2560-2567 (2003).
  22. Zhao, Q., Lv, Q., Wang, H. Aptamer fluorescence anisotropy sensors for adenosine triphosphate by comprehensive screening tetramethylrhodamine labeled nucleotides. Biosens Bioelectron. 70, 188-193 (2015).
  23. Zhang, D., et al. A sensitive fluorescence anisotropy method for detection of lead (II) ion by a G-quadruplex-inducible DNA aptamer. Anal Chim Acta. 812, 161-167 (2014).
  24. Elenko, M. P., Szostak, J. W., van Oijen, A. M. Single-molecule imaging of an in vitro-evolved RNA aptamer reveals homogeneous ligand binding kinetics. J Am Chem Soc. 131 (29), 9866-9867 (2009).
  25. Elenko, M. P., Szostak, J. W., van Oijen, A. M. Single-molecule binding experiments on long time scales. Rev Sci Instrum. 81 (8), 083705 (2010).
  26. Zichel, R., Chearwae, W., Pandey, G. S., Golding, B., Sauna, Z. E. Aptamers as a sensitive tool to detect subtle modifications in therapeutic proteins. PLoS One. 7 (2), 31948 (2012).
  27. Baaske, P., Wienken, C. J., Reineck, P., Duhr, S., Braun, D. Optical thermophoresis for quantifying the buffer dependence of aptamer binding. Angew Chem Int Ed Engl. 49 (12), 2238-2241 (2010).
  28. Entzian, C., Schubert, T. Studying small molecule-aptamer interactions using MicroScale Thermophoresis (MST). Methods. 97, 27-34 (2016).
  29. Valenzano, S., et al. Screening and Identification of DNA Aptamers to Tyramine Using in Vitro Selection and High-Throughput Sequencing. ACS Comb Sci. 18 (6), 302-313 (2016).
  30. Jauset Rubio, M., et al. beta-Conglutin dual aptamers binding distinct aptatopes. Anal Bioanal Chem. 408 (3), 875-884 (2016).
  31. Breitsprecher, D., et al. Aptamer Binding Studies Using MicroScale Thermophoresis. Methods Mol Biol. 1380, 99-111 (2016).
  32. Stoltenburg, R., Schubert, T., Strehlitz, B. In vitro Selection and Interaction Studies of a DNA Aptamer Targeting Protein A. PLoS One. 10 (7), 0134403 (2015).
  33. Kinghorn, A. B., et al. Aptamer Affinity Maturation by Resampling and Microarray Selection. Anal Chem. 88 (14), 6981-6985 (2016).
  34. Duhr, S., Braun, D. Why molecules move along a temperature gradient. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (52), 19678-19682 (2006).
  35. Braun, D., Libchaber, A. Trapping of DNA by thermophoretic depletion and convection. Phys Rev Lett. 89 (18), 188103 (2002).
  36. Duhr, S., Arduini, S., Braun, D. Thermophoresis of DNA determined by microfluidic fluorescence. Eur Phys J E Soft Matter. 15 (3), 277-286 (2004).
  37. Jerabek-Willemsen, M., Wienken, C. J., Braun, D., Baaske, P., Duhr, S. Molecular interaction studies using microscale thermophoresis. Assay Drug Dev Technol. 9 (4), 342-353 (2011).
  38. He, K., Dragnea, V., Bauer, C. E. Adenylate Charge Regulates Sensor Kinase CheS3 To Control Cyst Formation in Rhodospirillum centenum. MBio. 6 (3), 00546 (2015).
  39. Brvar, M., et al. Structure-based discovery of substituted 4,5'-bithiazoles as novel DNA gyrase inhibitors. J Med Chem. 55 (14), 6413-6426 (2012).
  40. Pogorelcnik, B., et al. 4,6-Substituted-1,3,5-triazin-2(1H)-ones as monocyclic catalytic inhibitors of human DNA topoisomerase IIalpha targeting the ATP binding site. Bioorg Med Chem. 23 (15), 4218-4229 (2015).
  41. Jhaveri, S., Rajendran, M., Ellington, A. D. In vitro selection of signaling aptamers. Nat Biotechnol. 18 (12), 1293-1297 (2000).
  42. Khavrutskii, L., et al. Protein purification-free method of binding affinity determination by microscale thermophoresis. J Vis Exp. (78), (2013).
  43. Ramakrishnan, M., et al. Probing cocaine-antibody interactions in buffer and human serum. PLoS One. 7 (7), 40518 (2012).
  44. Chen, M., et al. Antiviral activity and interaction mechanisms study of novel glucopyranoside derivatives. Bioorg Med Chem Lett. 25 (18), 3840-3844 (2015).
  45. Wan, C., et al. Insights into the molecular recognition of the granuphilin C2A domain with PI(4,5)P2. Chem Phys Lipids. 186 (4,5), 61-67 (2015).
  46. Harazi, A., et al. The Interaction of UDP-N-Acetylglucosamine 2-Epimerase/N-Acetylmannosamine Kinase (GNE) and Alpha-Actinin 2 Is Altered in GNE Myopathy M743T Mutant. Mol Neurobiol. , (2016).

Tags

Biyokimya Sayı 119 Küçük molekül-aptamer etkileşim bağlanma parametreleri Mikro Termoforesis yakınlık stokiyometri termodinamik nükleik asitleri bağlama bağlama site haritalama
Mikro Termoforesis kullanarak ATP bir aptamer Bağlama Sitesi Haritalama
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Entzian, C., Schubert, T. Mapping… More

Entzian, C., Schubert, T. Mapping the Binding Site of an Aptamer on ATP Using MicroScale Thermophoresis. J. Vis. Exp. (119), e55070, doi:10.3791/55070 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter