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Biochemistry

बाध्यकारी microscale thermophoresis का उपयोग करते हुए एटीपी पर एक Aptamer की साइट मानचित्रण

Published: January 7, 2017 doi: 10.3791/55070
Automatic Translation
1, 1
12bind GmbH

Introduction

अणुओं के बीच बातचीत प्रकृति का आधार है। इसलिए, बुनियादी और अनुप्रयुक्त अनुसंधान के कई क्षेत्रों में वैज्ञानिकों ने विभिन्न प्रकार के आणविक बातचीत के मौलिक सिद्धांतों को समझने की कोशिश करते हैं। Microscale thermophoresis (एमएसटी) बफ़र्स के एक मुक्त विकल्प के साथ, समाधान में तेजी, सटीक, लागत, कुशल, और गुणवत्ता नियंत्रण आणविक बातचीत के लक्षण वर्णन प्रदर्शन करने के लिए वैज्ञानिकों को सक्षम बनाता है। वहां पहले से ही अकेले मासिक सीजन टिकट का उपयोग कर, 2016 से, पुस्तकालय चोकर सहित विश्लेषण के विभिन्न प्रकार, का वर्णन, कई बंधन भागीदारों 1-8 के साथ घटना सत्यापन, प्रतियोगिता assays, और प्रयोगों बाध्यकारी 1,000 से अधिक प्रकाशन कर रहे हैं। सामान्य में, इस तरह के मासिक सीजन टिकट बंधन आत्मीयता (मिमी बजे), stoichiometry, और ऊष्मा, आणविक बातचीत की किसी भी तरह के रूप में शास्त्रीय बाध्यकारी मापदंडों के अध्ययन के लिए परमिट। एमएसटी का एक बड़ा लाभ बातचीत भागीदारों के आकार के स्वतंत्र बाध्यकारी घटनाओं का अध्ययन करने की क्षमता है। यहाँ तक कि chalइस तरह के छोटे अणुओं, दवाओं, एंटीबायोटिक दवाओं, या चयापचयों के रूप में छोटे न्यूक्लिक एसिड aptamers के बीच बातचीत lenging (15-30 NT) और लक्ष्य मात्रा निर्धारित किया जा सकता है।

वर्तमान राज्य के अत्याधुनिक प्रौद्योगिकियों को चिह्नित aptamer लक्ष्य बातचीत या तो प्रयोगशाला तीव्र और अत्यधिक जटिल कर रहे हैं या यों तो aptamer-छोटे अणु बातचीत 9,10 विफल करने के लिए। सतह plasmon अनुनाद (एसपीआर) आधारित assays 11,12 और ऐसे इज़ोटेर्माल अनुमापन calorimetry (आईटीसी) 13-15, isocratic क्षालन 16, संतुलन फाई ltration 17,18 के रूप में वास्तव लेबल मुक्त उष्मापन दृष्टिकोण,, में लाइन की जांच कर रही 19, gel- assays बदलाव, stopped- FL ओउ FL uorescence स्पेक्ट्रोस्कोपी 20,21, प्रतिदीप्ति anisotropy (एफए) 22,23, एकल अणु फ्लोरिडा uorescence इमेजिंग 24,25, और बायो-परत इंटरफेरोमेट्री (BLI) 26 भी या तो imprecise या aptamer-छोटे अणु के साथ असंगत हैं बातचीत। अन्य principaइन तरीकों में से एल मुद्दों कम संवेदनशीलता, उच्च नमूना खपत, स्थिरीकरण, सतहों पर जन परिवहन सीमाओं, और / या बफर प्रतिबंध है। इन प्रौद्योगिकियों के केवल कुछ ही एकत्रीकरण और सोखना प्रभाव के लिए एकीकृत नियंत्रण प्रदान करते हैं।

एमएसटी वैज्ञानिकों ऐसे प्रोटीन 30-33 के रूप में aptamers और छोटे अणुओं 27-29 के बीच बातचीत, साथ ही अन्य ठिकानों अध्ययन करने के लिए इस सीमा को पार करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण का प्रतिनिधित्व करता है। प्रौद्योगिकी तापमान ढ़ाल के माध्यम से अणुओं के आंदोलन पर निर्भर करता है। यह निर्देशित आंदोलन, तथाकथित "thermophoresis," आकार, प्रभारी, और अणु 34,35 के हाइड्रेशन खोल पर निर्भर करता है। अणु को एक ligand के बंधन सीधे इन मानकों में से कम से कम एक बदल जाएगा, एक बदल thermophoretic गतिशीलता में जिसके परिणामस्वरूप। छोटे आकार के साथ ligands अनबाउंड से ही राज्य को आकार परिवर्तन के मामले में काफी प्रभाव नहीं हो सकता है, लेकिन वे डॉ हो सकता है हाइड्रेशन खोल और / या आरोप पर amatic प्रभाव। बाध्यकारी साथी के साथ बातचीत के बाद अणुओं के thermophoretic आंदोलन में परिवर्तन के बुनियादी मानकों को बाध्यकारी 2,7,34,36,37 की मात्रा का ठहराव सक्षम बनाता है।

जैसा कि चित्र में दिखाया गया है 1 ए, एमएसटी डिवाइस प्रतिदीप्ति का पता लगाने के लिए के रूप में ही प्रकाशिकी का उपयोग कांच केशिकाओं के भीतर नमूना पर ध्यान केंद्रित एक अवरक्त लेजर के होते हैं। जबकि लेजर एक तापमान ढाल (2-6 डिग्री सेल्सियस के ΔT) स्थापित करता है tryptophans 6 या एक fluorescently लेबल बातचीत साथी 3,8 की आंतरिक FL uorescence के माध्यम से प्रोटीन के thermophoretic आंदोलन पर नजर रखी जा सकती है। अंतरिक्ष, ΔT, जिसके परिणामस्वरूप तापमान अंतर कमी या ऊंचा तापमान के क्षेत्र में अणुओं का संचय, जो Soret द्वारा मात्रा निर्धारित किया जा सकता है की ओर जाता है coef फाई cient (एस टी):

जी "/>

सी गर्म गर्म क्षेत्र में एकाग्रता का प्रतिनिधित्व करता है, और सी ठंड प्रारंभिक ठंड क्षेत्र में एकाग्रता है।

चित्रा 1 बी, एक मासिक सीजन टिकट आंदोलन प्रोफ़ाइल (समय का पता लगाने), अलग-अलग चरणों है, जो अपने संबंधित timescales के द्वारा अलग किया जा सकता से मिलकर में एक ठेठ एमएसटी प्रयोग के परिणाम में दिखाया गया है। प्रारंभिक प्रतिदीप्ति तापमान ढाल के अभाव में पहले 5 एस में मापा जाता है सटीक शुरू प्रतिदीप्ति परिभाषित करने के लिए और photobleaching या photoenhancement के लिए जाँच करें। तापमान कूद (टी-कूद) चरण में जो thermophoretic आंदोलन से पहले प्रतिदीप्ति परिवर्तन का प्रतिनिधित्व करता है। प्रतिदीप्ति में यह प्रारंभिक कमी क्वांटम उपज uorophore फ्लोरिडा की गर्मी पर निर्भर परिवर्तन पर निर्भर करता है। thermophoresis चरण इस प्रकार है, जिसमें रोशनी कम हो जाती है (या बढ़ जाती है) स्थिर राज्य वितरण तक के अणुओं की thermophoretic आंदोलन की वजह से पहुँच जाता है।के रूप में चित्रा 1 बी में संकेत लेजर के बाद बंद है रिवर्स TJump और फ्लोरिडा uorescent अणुओं के सहवर्ती वापस प्रसार मनाया जा सकता है। बुनियादी बाध्यकारी मापदंडों का उपयोग करने के लिए, बातचीत के भागीदारों के विभिन्न दाढ़ अनुपात का विश्लेषण किया और तुलना कर रहे हैं। आमतौर पर, 16 विभिन्न अनुपात, एक मासिक सीजन टिकट प्रयोग में अध्ययन कर रहे हैं, जबकि ऑप्टिकल दिखाई अणु स्थिर रखा जाता है और लेबल हटाया गया ligand के एक बढ़ती हुई राशि के साथ आपूर्ति की है। दो बंधन भागीदारों के बीच बातचीत thermophoresis में परिवर्तन लाती है, और इस तरह सामान्यीकृत FL uorescence में, एफ आदर्श है, जो निम्नलिखित के रूप में गणना की है:

समीकरण

एफ गर्म और ठंडे एफ एमएसटी निशान के डी फाई नेड समय बिंदुओं पर फ्लोरिडा uorescence तीव्रता के औसत का प्रतिनिधित्व करते हैं। बाध्यकारी समानताएं (कश्मीर डी या चुनाव आयोग 50 मान) curv द्वारा गणना की जा सकती हैई फिटिंग (चित्रा 1 सी)।

कुल मिलाकर, मासिक सीजन टिकट किसी भी प्रकार की आणविक बातचीत का अध्ययन करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है। और 25-NT कम ssDNA aptamer DH25.42 (7.9 केडीए); इस पांडुलिपि छोटे अणु adenosine triphosphate (0.5 केडीए एटीपी) के बीच चुनौतीपूर्ण बातचीत को चिह्नित करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रदान करता है। पांडुलिपि के दौरान, एटीपी अणु पर aptamer के बंधन साइट एटीपी के adenine समूह के लिए नीचे मैप किया गया है।

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Protocol

1. Aptamer काम कर रहे शेयर की तैयारी

  1. निर्माता के निर्देशों का पालन करें और पानी में (संदर्भ 18 से 5 Cy5-CCTG GGGGAGTATTGCGGAGGAAGG -3, अनुक्रम) oligonucleotide भंग, एक 100 माइक्रोन अंतिम एकाग्रता तक पहुंच गया।
  2. बफर बंधन के साथ 200 एनएम के लिए oligonucleotide शेयर गिराए द्वारा aptamer काम कर समाधान तैयार (20 मिमी Tris, पीएच 7.6, 300 मिमी NaCl, 5 मिमी 2 MgCl; 0.01% Tween20)।
  3. 90 डिग्री सेल्सियस पर 2 मिनट के लिए मिश्रण को सेते हैं, नमूना बर्फ पर तुरंत ठंडा होने दें, और कमरे के तापमान पर नमूना का उपयोग करें।

2. Ligand कमजोर पड़ने श्रृंखला की तैयारी

  1. सैम प्रत्येक ligand (adenosine triphosphate (एटीपी), adenosine diphosphate (ADP), एडेनोसाइन मोनोफास्फेट (एएमपी), एडेनाइन ग्वानोसिन triphosphate (जीटीपी), साइटोसिन triphosphate (सीटीपी), deoxyadenosine triphosphate (dATP), और एस adenosyl methionine के लिए () ; 10 मिमी स्टॉक प्रत्येक), एक 16-कदम सीरियल diluti तैयारपर में 200 μl सूक्ष्म प्रतिक्रिया ट्यूबों।
    नोट: 5 मिनट के 14,000 XG पर समुच्चय को दूर करने में मदद कर सकते हैं के लिए ligand शेयरों की centrifugation। कम मात्रा, कम बाध्यकारी प्रतिक्रिया ट्यूबों ट्यूब दीवारों से अणुओं के सोखना से बचने के लिए सिफारिश कर रहे हैं।
  2. कम से कम 50 बार अनुमान की तुलना में अधिक समानता की एक अधिकतम एकाग्रता के साथ शुरू और प्रत्येक कमजोर पड़ने कदम में 50% से ligand एकाग्रता कम।
    नोट: एकाग्रता खोजक नियंत्रण सॉफ्टवेयर में लागू उपकरण बाध्यकारी डेटा simulates और कमजोर पड़ने श्रृंखला के लिए सही एकाग्रता रेंज खोजने के साथ मदद करता है।
  3. ligand शेयर (10 मिमी) ट्यूब 1 में से 20 μl भरें 16 करने के लिए 2 माइक्रो प्रतिक्रिया ट्यूबों में aptamer बाध्यकारी बफर के 10 μl जोड़ें।
  4. स्थानांतरण ट्यूब 2 के लिए ट्यूब 1 का 10 μl और ऊपर pipetting द्वारा और कई बार नीचे ठीक से मिला लें। अगले ट्यूब के लिए 10 μL स्थानांतरण और शेष ट्यूबों के लिए यह कमजोर पड़ने दोहराएँ।
  5. पिछले ट्यूब से 10 μl अतिरिक्त त्यागें। किसी भी ख से बचेंuffer कमजोर पड़ने प्रभाव। ट्यूब 1 में और ट्यूबों 2-16 में बफर समान होना चाहिए।

3. अंतिम प्रतिक्रिया मिश्रण की तैयारी

  1. pipetting त्रुटियों को कम करने के लिए 20 μl की एक मात्रा के साथ अलग-अलग बाध्यकारी प्रतिक्रियाओं (aptamer काम समाधान + संबंधित ligand के कमजोर पड़ने के 10 μl के 10 μl) तैयार करें। केवल 4 μl की एक मात्रा केशिका करूँगा फाई के लिए SUF फाई दक्ष है।
  2. प्रत्येक ligand के कमजोर पड़ने के 10 μl के लिए 200 एनएम aptamer काम कर समाधान के 10 μl जोड़ें और ऊपर pipetting द्वारा और कई बार नीचे ठीक से मिला लें।
  3. नमूना में केशिकाओं सूई से कमरे के तापमान और फाई मानक केशिकाओं में नमूने करूँगा पर 5 मिनट के लिए नमूने सेते हैं। अब ऊष्मायन बार कुछ बातचीत के लिए आवश्यक हो सकता है; हालांकि, 5 मिनट के अधिकांश के लिए पर्याप्त है। केवल पक्षों पर केशिकाओं को स्पर्श नहीं, मध्य भाग, जहां ऑप्टिकल माप लिया जाएगा पर।
  4. वें पर केशिकाओं की जगहई केशिका ट्रे और मासिक सीजन टिकट डिवाइस शुरू करते हैं।

4. मासिक सीजन टिकट डिवाइस शुरू

नोट: डिवाइस दो पूर्व स्थापित सॉफ्टवेयर संकुल, उत्पादित डेटा की व्याख्या के लिए सॉफ्टवेयर '' '' विश्लेषण नियंत्रण प्रयोगात्मक शर्तों और तकनीकी की स्थापना के लिए सॉफ्टवेयर '' प्रदान करता है।

  1. एमएसटी डिवाइस में केशिका ट्रे रखने से पहले, नियंत्रण सॉफ्टवेयर शुरू करते हैं और 'ड्रॉपडाउन मेनू' '' तापमान नियंत्रण में "मैनुअल तापमान नियंत्रण सक्षम 'का चयन करके समग्र वांछित तापमान को समायोजित। इस तरह से 25 डिग्री सेल्सियस के तापमान को समायोजित करें।
    नोट: मासिक सीजन टिकट के साधन तापमान नियंत्रित 22 से 45 डिग्री सेल्सियस तक हो सकता है।
  2. तापमान के लिए प्रतीक्षा की उम्मीद के स्तर तक पहुंचने के लिए और उसके बाद मासिक सीजन टिकट डिवाइस में केशिका ट्रे जगह है।
  3. Cy5 रंगों के लिए लाल करने के लिए '' "एलईडी चैनल सेट और एलईडी शक्ति एक FL uorescenc हासिल करने के लिए समायोजितएक मानक संवेदक के साथ मासिक सीजन टिकट डिवाइस पर 300 से 1000 प्रतिदीप्ति इकाइयों की ई संकेत। 25% एलईडी शक्ति इस अध्ययन में प्रयोग किया जाता है।
    नोट: 6,000 18,000 करने के लिए प्रतिदीप्ति इकाइयों एक उच्च संवेदनशीलता सेंसर के साथ मासिक सीजन टिकट के लिए सिफारिश कर रहे हैं।

5. केशिका स्कैन

  1. "नियंत्रण" सॉफ्टवेयर पर केशिका स्थिति को चुनने और पर क्लिक करके नमूना के विभिन्न पहलुओं की गुणवत्ता की जांच करने के लिए एक केशिका स्कैन बाहर ले 'टोपी स्कैन शुरू " एमएसटी माप शुरू करने से पहले।
  2. प्रतिदीप्ति वृद्धि / शमन और चिपके प्रभाव (यू के आकार या चपटा चोटियों) सॉफ्टवेयर में केशिका स्कैन का निरीक्षण किया।
    नोट: पता लगाने और प्रतिदीप्ति की हैंडलिंग और चिपके हुए प्रभाव के बारे में अधिक जानकारी के लिए चर्चा में पाया जा सकता है।

6. एमएसटी मापन

नोट: मासिक सीजन टिकट माप शुरू करने से पहले, बाहर करने के लिए सुनिश्चित करें चिपके प्रभाव, वृद्धि / शमन प्रभाव, याpipetting त्रुटियों, और यह सुनिश्चित केशिका स्कैन इंगित करता है कि फ्लोरिडा uorescence संकेत SUF फाई दक्ष है। अधिक जानकारी के लिए चर्चा देखें।

  1. '' नियंत्रण 'सॉफ्टवेयर में संबंधित केशिका की स्थिति को कमजोर पड़ने श्रृंखला से ligand सांद्रता निरुपित aptamer और ligand मिश्रण के कमजोर पड़ने के कदम पर विचार करें। (1: 1)।
  2. # 1 केशिका के लिए ligand के सर्वोच्च एकाग्रता (5 मिमी) दर्ज सही कमजोर पड़ने प्रकार का चयन करें (यहाँ, 1: 1), अधिकतम एकाग्रता पर क्लिक करें और खींचें समारोह का उपयोग स्वचालित रूप से केशिकाओं में शेष सांद्रता # 2- आवंटित करने के लिए 16। सबसे कम एकाग्रता 152.6 एनएम है।
  3. नियंत्रण सॉफ्टवेयर के संबंधित अनुभाग में फ्लोरिडा uorescent aptamer (यहाँ, 100 एनएम) की एकाग्रता दर्ज करें।
  4. डिफ़ॉल्ट सेटिंग्स, जो 5 सेकंड के लिए फ्लोरिडा uorescence का पता लगाने का प्रयोग करें, 30 सेकंड के लिए मासिक सीजन टिकट रिकॉर्ड, और लेजर टी की निष्क्रियता के बाद एक और 5 सेकंड के लिए प्रतिदीप्ति रिकॉर्ड ओ अणुओं की पीठ प्रसार की निगरानी।
  5. नियंत्रण सॉफ्टवेयर के संबंधित खंड में 20% करने के लिए लेजर शक्ति को समायोजित करें।
    नोट: क्रम में सबसे अच्छा संकेत करने वाली शोर अनुपात प्राप्त करने के लिए और unspecific प्रभाव से बचने के लिए, 20-40% की एक लेजर बिजली की सिफारिश की है। विशेष मामलों में, एक उच्च शक्ति लेजर अबाध और बाध्य अणुओं का एक अच्छा जुदाई पाने के लिए आवश्यक हो सकता है।
  6. गंतव्य फ़ोल्डर का चयन करने के बाद प्रयोग बचाने के लिए और '' आरंभ एमएसटी माप "बटन दबाने से मासिक सीजन टिकट माप शुरू करते हैं।
    ध्यान दें: .ntp फ़ाइल गंतव्य फ़ोल्डर में उत्पन्न हो जाएगा। इस सेटअप का उपयोग करना, एक माप 10-15 मिनट तक रहता है।
  7. प्रयोगात्मक प्रक्रिया चुनाव आयोग 50 मूल्य का एक और अधिक सटीक निर्धारण के लिए कम से कम दो बार दोहराएँ।
    नोट: आदेश में तकनीकी reproducibility का परीक्षण करने के लिए, एक ही केशिकाओं स्कैन किया जा सकता कई बार (तकनीकी दोहराता)।

7. एमएसटी डेटा विश्लेषण

NT "> नोट: विश्लेषण सॉफ्टवेयर माप के दौरान फ्लोरिडा y पर डेटा के विश्लेषण के लिए सक्षम बनाता विश्लेषण सॉफ्टवेयर एमएसटी समय निशान और सामान्यीकृत FL uorescence (एफ के आदर्श) में परिवर्तन ligand एकाग्रता 37 बनाम भूखंडों।।

  1. एमएसटी विश्लेषण सॉफ्टवेयर (MO.Affinity विश्लेषण) को प्रारंभ और गंतव्य फ़ोल्डर से .ntp फ़ाइल लोड। डेटा चयन मेनू में विश्लेषण प्रकार के रूप में "मासिक सीजन टिकट" का चयन करें।
    नोट: ligand-निर्भर प्रतिदीप्ति प्रभाव के मामले में, प्रारंभिक प्रतिदीप्ति विश्लेषण के लिए चुना जा सकता है।
  2. ड्रैग और ड्रॉप द्वारा या "+" संबंधित प्रायोगिक रन नीचे बटन दबाने से एक नए विश्लेषण करने के लिए संबंधित तकनीकी या जैविक रन (एस) जोड़ें।
  3. प्रयोग, एमएसटी निशान, केशिका स्कैन, केशिका आकार, प्रारंभिक प्रतिदीप्ति, और विरंजन दर के गुणों के बारे में जानकारी प्राप्त करने के लिए संबंधित प्रायोगिक रन नीचे दी गई जानकारी बटन दबाएँ।
    नोट: ये कच्चे डेटा कर सकते हैं अलइसलिए विश्लेषण के बाद के चरणों में निरीक्षण किया।
  4. दिखने में समान है और spikes के रूप में दिखाई दे एकत्रीकरण और वर्षा के प्रभाव के लिए मासिक सीजन टिकट निशान, का निरीक्षण किया।
    नोट: पता लगाने और एकत्रीकरण प्रभाव से निपटने के बारे में अधिक जानकारी के लिए, चर्चा पढ़ें।
  5. दिखने में केशिका स्कैन और सोखना प्रभाव के लिए केशिका आकार ओवरले, चपटा या यू के आकार चोटियों के रूप में दिखाई निरीक्षण किया। दिखने में केशिका स्कैन और प्रतिदीप्ति प्रभाव के लिए प्रारंभिक प्रतिदीप्ति का निरीक्षण किया। नेत्रहीन प्रभाव photobleaching के लिए ब्लीचिंग दर का निरीक्षण किया।
  6. खुराक प्रतिक्रिया मोड के लिए स्विच और संबंधित बटन दबाने से विश्लेषण करने के लिए "विशेषज्ञ" मोड सेटिंग बदल जाते हैं। चयन एमएसटी मूल्यांकन रणनीति के रूप में "टी-कूद"।
  7. वक्र फाई tting के लिए "हिल" मॉडल का चयन करें। बाध्यकारी मापदंडों स्वचालित रूप से गणना की जाएगी। "परिणामों की तुलना" मेनू में सामान्य बनाने के संबंधित प्रकार का चयन करके डेटा मानक के अनुसार। निर्यातया तो एक .xls या पीडीएफ के रूप में डेटा।
    नोट: बंधन ग्राफ नीचे दी गई तालिका गणना बाध्यकारी पैरामीटर सार।

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Representative Results

इस अध्ययन में, मासिक सीजन टिकट एटीपी पर DH25.42 डीएनए aptamer 18 के बंधन साइट को चिह्नित करने के लिए लागू किया गया था। एटीपी या प्रोटीन बेतरतीब ढंग से एक या एक से अधिक fluorophores 38-40 के साथ लेबल के साथ छोटे अणुओं एटीपी नकल उतार की बातचीत निस्र्पक अन्य अध्ययनों के विपरीत, इस अध्ययन के एक लेबल 5'अंत पर एक Cy5 अणु के साथ 7.9 केडीए ssDNA aptamer के संस्करण शामिल । विभिन्न एटीपी डेरिवेटिव और संबंधित अणुओं, सभी विभिन्न पदों में एटीपी से भिन्न, एटीपी अणु पर बाध्यकारी साइट नक्शा करने के लिए इस्तेमाल किया गया। कमजोर पड़ने श्रृंखला (16 चरणों में, 50% प्रत्येक द्वारा ligand एकाग्रता को कम करने) विभिन्न ligands के लिए तैयार है और Cy5 लेबल aptamer की एक निरंतर राशि के साथ मिलाया गया। नमूने 25% और 20% एलईडी लेजर शक्ति पर मानक केशिकाओं में विश्लेषण किया गया। आंदोलन प्रोफाइल (एमएसटी समय निशान) दर्ज किया गया और बनाम ligand concentr प्रतिदीप्ति इकाइयों, टी-कूद चरण से निकाली गई, प्लॉट किए जाते थेव्यावहारिक (चित्रा 1C तुलना)। वक्र ढाले चुनाव आयोग 50 मूल्यों में जिसके परिणामस्वरूप हिल समीकरण लागू करने से प्रदर्शन किया गया था। 5 स्वतंत्र जैविक दोहराता (4 विभिन्न ऑपरेटरों, 2 अलग aptamer शेयरों में 2 अलग एटीपी स्टॉक) में, एटीपी aptamer बातचीत 6 से 13 इकाइयों के एक नकारात्मक बाध्यकारी आयाम और 52.3 ± 5.0 माइक्रोन की औसत चुनाव आयोग 50 मूल्य (2A चित्रा से पता चलता है )। बाध्यकारी रेखांकन में त्रुटि सलाखों और "±" आत्मीयता के डेटा में प्रस्तुत 5 जैविक दोहराता (एक अलग केशिका में 5 स्वतंत्र माप) के मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करते हैं। साथ [2,8,5'- 3 एच] -adenosine और एटीपी agarose DH25.42 aptamer की बातचीत के लिए पहले की रिपोर्ट समानताएं तुलनीय थे। Aptamer साथ radiolabeled एडेनोसाइन की बातचीत एक केन्द्रापसारक फिल्टर परख द्वारा मात्रा गया था, और 6 ± 3 माइक्रोन के एक समानता (कश्मीर घ) निर्धारित किया गया था। एटीपी immobil साथ isocratic क्षालन प्रयोगों13 माइक्रोन के 18,41 के एक समानता (कश्मीर घ) में हुई agarose के ized।

एक बेहतर पक्ष द्वारा साइड तुलना के लिए, डेटा complexed अणुओं के अंश (अंश ही, एफबी) निम्न समीकरण का उपयोग करने के लिए सामान्यीकृत जा सकता है:
समीकरण
जहां मूल्य (ग) एकाग्रता ग के लिए मापा मासिक सीजन टिकट मूल्य है, नि: शुल्क अपार राज्य (सबसे कम एकाग्रता) के लिए मासिक सीजन टिकट मूल्य है, और complexed पूरी तरह से बाध्य राज्य (चित्रा 2 बी) के लिए मासिक सीजन टिकट मूल्य है। के रूप में चित्रा -2 में दिखाया गया है यह सामान्य, एक ग्राफ में विभिन्न ligands के परिणामों की तुलना करने के लिए आदर्श है। पता चला ADP (63.6 ± 5.9 जैविक डुप्लिकेट में सुक्ष्ममापी), एएमपी के वायुसेना फाई nities (91.6 ± 9.1 जैविक डुप्लिकेट में सुक्ष्ममापी), और सैम (44.4 ± 3.2 जैविक डुप्लिकेट में माइक्रोन) के है, जो परमाणु में एटीपी से अलगफॉस्फेट समूहों की mber, मतलब ये नहीं है या केवल aptamer (चित्रा -2 सी और डी) के बंधन व्यवहार पर फ्लोरिडा uence में नाबालिग है कि इस स्थिति। एटीपी के राइबोज़ की C2 कार्बन ओह समूह भी प्रमुख बाध्यकारी साइट होने से बाहर रखा जा सकता है के रूप dATP भी एक से थोड़ा कम वायुसेना फाई सामुदायिक (64.4 ± 6.1 जैविक डुप्लिकेट में माइक्रोन) के साथ aptamer से बाध्य किया गया था। pyrimidine समूह सीटीपी aptamer की गैर बाध्यकारी, बातचीत के लिए इस समूह के महत्व के प्रदर्शन में हुई एटीपी की प्यूरीन समूह बदल रहा है। aptamer 141.7 ± 9.4 माइक्रोन की एक समानता (जैविक डुप्लिकेट में) के साथ adenine करने के लिए बाध्य है, दिखा रहा है कि बाध्यकारी साइट एटीपी अणु के इस हिस्से में होना चाहिए। प्यूरीन अणुओं जीटीपी और एटीपी चित्रा 2 डी, जो एटीपी पर aptamer का मुख्य बाध्यकारी साइट का प्रतिनिधित्व करता है में प्रतिनिधित्व हरी छायांकित क्षेत्र में भिन्न होते हैं। एक अन्य अध्ययन के अलग अलग एटीपी डेरिवेटिव के साथ गैर मात्रात्मक क्षालन प्रयोगों में इस्तेमाल कियाएटीपी agarose है, जो इस एमएसटी अध्ययन करने के लिए 18 तुलनीय परिणाम दिखाया से एक radiolabeled aptamer elute।

चित्र 2
चित्रा 1: microscale thermophoresis। (ए) मासिक सीजन टिकट प्रौद्योगिकी के तकनीकी सेटअप दिखाया गया है। प्रकाशिकी कांच केशिकाओं के केंद्र पर ध्यान देते हैं, जिससे ऑप्टिकली दिखाई अणु की प्रतिदीप्ति संकेत का पता लगाने। एक आईआर लेजर ऑप्टिकल प्रणाली का अवलोकन खिड़की में एक तापमान ढाल स्थापित करने के लिए उपयोग किया जाता है। प्रतिदीप्ति में परिवर्तन एक तापमान ढाल में समाधान (बी) एमएसटी समय का पता लगाने आंदोलन समर्थक फाई के अणुओं की le में अणुओं की thermophoretic आवाजाही पर नजर रखने के लिए उपयोग किया जा सकता है। प्रारंभिक प्रतिदीप्ति 5 सेकंड के लिए मापा जाता है, जबकि लेजर बंद है। लेजर पर स्विचिंग एक तापमान ढाल उत्पन्न करता है। तत्काल टी-कूद पी के बादHASE, जिसमें FL uorescent डाई गर्मी प्रेरण पर इसके संकेत उपज कम हो जाती है, thermophoretic आंदोलन जगह लेता है और 30 सेकंड के लिए मनाया जाता है। बाद लेजर बंद कर दिया है, अणुओं वापस फैलाना। (सी) एक ठेठ एमएसटी प्रयोग के परिणाम: (बाएं) 16 केशिकाओं फ्लोरोसेंट अणु का एक ही एकाग्रता और लेबल हटाया गया ligand के एक बढ़ती हुई एकाग्रता युक्त; एमएसटी समय निशान दर्ज की गई और उनकी प्रारंभिक प्रतिदीप्ति के लिए सामान्यीकृत कर रहे हैं। (सही) सामान्यीकृत FL uorescence; एफ ठंड और एफ गर्म के बीच अंतर ligand की एकाग्रता के खिलाफ साजिश रची है। बंधन बाध्यकारी वायुसेना फाई सामुदायिक रूप में मानकों, इस डेटा की पैदावार का एक वक्र फिट। Elsevier, तरीके से 28 से अनुमति के साथ फिर से प्रिंट; लाइसेंस संख्या 3890230800113. यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2: मासिक सीजन टिकट डेटा विश्लेषण। (ए) आधारभूत ΔF आदर्श (‰), मासिक सीजन टिकट TJump संकेत से निकाली गई uorescence सामान्यीकृत FL सही, (माइक्रोन में) एटीपी एकाग्रता के खिलाफ साजिश रची है। हिल समीकरण (ईसी 50) वक्र ढाले के लिए लागू किया गया था। त्रुटि सलाखों पांच जैविक दोहराता से मानक विचलन प्रतिनिधित्व करते हैं। (बी) के आंकड़ों ए में दिखाया संबंधित डेटा सेट अंश बाध्य करने के लिए सामान्यीकृत थे के अंश बाध्य साजिश है, और इन सामान्यीकृत डेटा की औसत बाध्यकारी ग्राफ में प्रस्तुत किया है। त्रुटि सलाखों 5 जैविक दोहराता की मानक विचलन का संकेत मिलता है। (सी) अंश बाध्य ग्राफ aptamer करने के लिए विभिन्न ligands के एक मात्रात्मक तुलना (हिल फिट) से पता चलता है। त्रुटि सलाखों के मानक devia का प्रतिनिधित्वदो जैविक दोहराता की tion। (डी) बाध्यकारी वायुसेना फाई nities (ईसी 50) aptamer करने के लिए विभिन्न ligands के। हरी छायांकित क्षेत्र एटीपी के adenine समूह पर aptamer के बंधन साइट इंगित करता है। यह आंकड़ा Elsevier, तरीके से 28 से संशोधित किया गया है; पिछले अध्ययन से लाइसेंस नंबर 3890230800113. डेटा सेट reanalyzed और इस अध्ययन के भीतर विस्तार कर रहे हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3: मासिक सीजन टिकट के प्रयोगों के लिए परख अनुकूलन। (ए) प्रोटीन सोखना और चिपके प्रभाव केशिका स्कैन में पता लगाया जा सकता है। इस तरह चपटा या यू के आकार चोटियों के रूप में अनियमित चोटी आकार, कांच की सतह के लिए नमूना सामग्री का चिपके संकेत मिलता है। सीकेशिका प्रकार (मानक, प्रीमियम, या हाइड्रोफोबिक) फांसी अणु सोखना रोका जा सकता है, एक नियमित रूप से शिखर आकार में जिसके परिणामस्वरूप। (बी) एमएसटी समय निशान भी एक गुणवत्ता नियंत्रण के रूप में सेवा समुच्चय समान है और spikes के रूप में वहाँ से पता लगाया जा सकता है के बाद से। प्रयोगात्मक शर्तों (जैसे, इस तरह के Pluronic एफ 127 या अलग-अलग पीएच मान या नमक सांद्रता के रूप में डिटर्जेंट सहित) के अणुओं की घुलनशीलता सुधार के द्वारा अनुकूलित किया जा सकता। Centrifugation बड़ा समुच्चय को दूर करने में मदद कर सकता है। इष्टतम डेटा की गुणवत्ता सुनिश्चित करने के लिए एमएसटी समय निशान दिए गए उदाहरण के समान होना चाहिए। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

गुणवत्ता नियंत्रण:

Unspecific चिपके / सतहों के लिए नमूना सामग्री, साथ ही एकत्रीकरण प्रभाव के सोखना, आत्मीयता के डेटा की गुणवत्ता पर एक नाटकीय प्रभाव है। हालांकि, केवल कुछ ही राज्य के अत्याधुनिक प्रौद्योगिकियों सटीक और तेजी से विकल्प पर नजर रखने और इन प्रभावों से बचने के लिए प्रदान करते हैं। एमएसटी एकीकृत गुणवत्ता नियंत्रण है कि पता लगाने और इन मुद्दों पर काबू पाने के लिए, तकनीकी सेटअप की चरणबद्ध अनुकूलन के लिए अनुमति देने के लिए मदद प्रदान करता है। चिपके हुए हैं और प्रतिदीप्ति प्रभाव के बारे में महत्वपूर्ण जानकारी, केशिका स्कैन और केशिका आकार (कदम 5.2 और 7.5) से निकाला जा सकता है, जबकि एकत्रीकरण / वर्षा प्रभाव (कदम 7.7) आंदोलन प्रोफाइल पर नजर रखी जा सकती है। इन नियंत्रणों डेटा की गुणवत्ता की लगातार सुधार के लिए सक्षम और प्रोटोकॉल में महत्वपूर्ण कदम प्रतिनिधित्व करते हैं।

सोखना प्रभाव और समस्या निवारण की जांच:

केशिका स्कैन मुख्य रूप से एक पहल के रूप में आयोजित किया जाता हैTiAl कदम इस पर प्रतिदीप्ति स्कैनिंग द्वारा ट्रे धारक पर केशिकाओं की स्थिति का निर्धारण करने के लिए। प्रत्येक चोटी, एक केशिका का प्रतिनिधित्व करता है एमएसटी माप के लिए प्रारंभिक बिंदु का संकेत है। शिखर आकार के दृश्य निरीक्षण कांच की सतह के अणुओं के सोखना, जो एक अनिवार्य गुणवत्ता नियंत्रण कि एमएसटी प्रयोग शुरू करने से पहले किया जाना चाहिए है के निर्धारण के लिए सक्षम बनाता है। केशिका आकार ओवरले सोखना / केशिका (चित्रा 3 ए, ऊपरी पैनल) की अंदरूनी कांच की सतह के अणुओं के चिपके का संकेत है, चपटा, ऊबड़ चोटी के आकार, या यहां तक कि एक चोटियों यू-फार्म के समान के लिए आसान पता लगाने के लिए अनुमति देता है। अलग ढंग से केशिका प्रकार (मानक, प्रीमियम, और हाइड्रोफोबिक) मदद लेपित घुलनशीलता और केशिकाओं के अणुओं के न्यूनतम सोखना सुनिश्चित करने के लिए। केशिकाओं बाध्यकारी प्रयोगों के लिए पहले उनकी उपयुक्तता के लिए परीक्षण किया जाना चाहिए। इस तरह के बीच (.005-.1%) या Pluronic F127 (0.01-0.1%) एमए के रूप में डिटर्जेंटy भी unspecific सोखना प्रभाव को रोकने के। प्रयोग के इस स्तर पर अनुकूलन उच्च गुणवत्ता वाले डाटा (चित्रा 3 ए की तुलना में कम पैनल) के लिए आवश्यक है।

प्रतिदीप्ति प्रभाव और समस्या निवारण की जांच:

स्कैन केशिकाओं के शिखर ऊंचाई में बदलाव नमूना विशेषताओं के बारे में जानकारी की एक और परत प्रदान करते हैं। केशिका प्रतिदीप्ति में रैंडम मतभेद, एक हाथ पर, दूसरे हाथ पर त्रुटियों pipetting करने के लिए या, कारण हो सकता है स्कैनिंग क्षेत्र है कि प्रतिदीप्ति काफी वृद्धि हो सकती है में बड़ा नमूना समुच्चय से उत्पन्न। उच्च सटीकता pipetting कमजोर पड़ने प्रभाव से बचने के लिए अनिवार्य है। ऊपर pipetting द्वारा सभी समाधान मिश्रण और नीचे सटीकता आगे बढ़ जाती है। इसके अलावा, यह बफर प्रत्येक केशिका में लगातार रखने के लिए आवश्यक है। एकत्रीकरण प्रभाव को संभालने के लिए रणनीतियाँ एक बाद पैराग्राफ में प्रस्तुत कर रहे हैं।

increa साथ प्रतिदीप्ति की प्रणालीगत परिवर्तनligand एकाग्रता गाना अक्सर ligand निर्भर शमन / वृद्धि प्रभाव का संकेत मिलता है। "एसडी टेस्ट" आदेश बाध्यकारी प्रेरित unspecific प्रतिदीप्ति नुकसान से प्रतिदीप्ति परिवर्तन भेदभाव करने में किया जाता है; इस परीक्षण denaturing शर्तों के तहत प्रतिदीप्ति तीव्रता नजर रखता है। ligand-निर्भर प्रतिदीप्ति प्रभाव के मामले में, अप्राकृतिकरण शर्त के तहत प्रतिदीप्ति तीव्रता titrant की एकाग्रता की स्वतंत्र समान होना चाहिए। प्रतिदीप्ति तीव्रता में अंतर अभी भी इन परिस्थितियों में मौजूद है, तो सामग्री या तो ट्यूब दीवारों को unspecific सोखना करने के लिए या एकत्रीकरण और बाद centrifugation के कारण की वजह से खो गया था।

आदेश में प्रदर्शन करने के लिए एसडी टेस्ट में पहले के 10 μl और पिछले ligand कमजोर पड़ने कदम के 10 μl प्रत्येक ध्यान की एक 2x एसडी मिक्स (4% एसडीएस और 40 मिमी डीटीटी) 10 μl युक्त एक ताजा ट्यूब स्थानांतरित कर रहे हैं। नमूने मिश्रित कर रहे हैं और अणुओं 95 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए विकृत कर रहे हैं। afteआर केशिकाओं में नमूने भरने, प्रतिदीप्ति तीव्रता मापा जाता है। एक ligand-निर्भर प्रतिदीप्ति प्रभाव का पता चला है, तो डेटा प्रतिदीप्ति तीव्रता परिवर्तन से deduced बाध्यकारी जानकारी के द्वारा सीधे विश्लेषण किया जा सकता है।

एकत्रीकरण प्रभाव और समस्या निवारण की जांच:

ऊबड़, असमान एमएसटी समय निशान एकत्रीकरण और / या वर्षा प्रभाव (चित्रा 3 बी, ऊपरी पैनल) से संकेत मिलता है। गैर एकत्रित नमूना सामग्री एक स्वच्छ और चिकनी thermophoretic आंदोलन प्रोफ़ाइल (चित्रा 3 बी, कम पैनल) प्रदर्शित करता है। नमूना सामग्री की centrifugation से पहले (5-10 14,000 पर मिनट XG), डिटर्जेंट के अलावा (0.005-0.1% बीच 20, 0.01-0.1% Pluronic एफ 127, या समान), बीएसए का उपयोग करें (उपयोग करने के > 0.5 मिलीग्राम / एमएल), या बफर की स्थिति (पीएच और ईओण शक्ति) के परिवर्तन के एकत्रीकरण प्रभाव को कम करने और डेटा की गुणवत्ता का अनुकूलन करने की सिफारिश कर रहे हैं। आदेश में उच्च गुणवत्ता वाले डेटा प्राप्त करने के लिए, यहएकत्रीकरण प्रभाव को कम करने के लिए आवश्यक है।

डेटा विश्लेषण और वक्र ढाले:

एक thermophoretic आंदोलन प्रोफ़ाइल विभिन्न चरणों, जो या तो अलग से या समन्वित रूप से निरीक्षण किया जा सकता है में विभाजित है। टी-कूद तापमान परिवर्तन पर प्रतिदीप्ति उपज में अचानक परिवर्तन का वर्णन है, fluorophores का अभिन्न विशेषता का प्रतिनिधित्व। प्रत्यक्ष अत्यधिक बाध्यकारी पर fluorophore या रचना में परिवर्तन की करीब परिवेश में बाध्यकारी टी-कूद प्रभावित करते हैं। धीमी thermophoresis, तापमान क्षेत्र में अणुओं के आंदोलन को संदर्भित गठन परिसर के समग्र संरचना के बारे में जानकारी की पेशकश की। डेटा विश्लेषण के डिफ़ॉल्ट प्रकार बाध्यकारी मानकों का निर्धारण करने के लिए दोनों घटनाएं शोषण, "thermophoresis + टी-कूद" सेटिंग कार्यरत हैं। मामले में दो चरणों विपरीत दिशाओं है, यह अलग चरणों का विश्लेषण करने की सिफारिश की है। कृपया ध्यान दें कि समय-प्रभाव और molec की विभिन्न प्रजातियोंules thermophoresis और टी-कूद की आत्मीयता में मतभेद हो सकती है। विश्लेषण के विकल्प का एक अन्य प्रकार मैनुअल सेटिंग है, जो आंदोलन प्रोफ़ाइल के विशिष्ट क्षेत्रों की जांच में सक्षम बनाता है। एकत्रीकरण या संवहन के कारण गड़बड़ी को इस तरह से बाहर रखा जा सकता है। डेटा की गुणवत्ता में सुधार करने के लिए, कर्सर एकत्रीकरण संकेतों से पहले सेट किया जा सकता है। प्रारंभिक जांच thermophoresis आमतौर पर, कम शोर के साथ डेटा का उत्पादन के बाद से संवहन एक समय पर निर्भर प्रक्रिया है। यह जल्दी मैनुअल सेटिंग अत्यधिक उच्च शक्ति लेजर (80%) के साथ प्रयोग के लिए सिफारिश की है। डेटा विश्लेषण सेटिंग के चयन पर दो फिटिंग विश्लेषण सॉफ्टवेयर में एकीकृत मॉडल बाध्यकारी वक्र फिट करने के लिए लागू किया जा सकता है। 1 बाध्यकारी मोड या एकाधिक बाध्यकारी साइटों में एक ही समानता रखने के लिए बड़े पैमाने पर कार्रवाई की व्यवस्था से कश्मीर घ के लिए फिट समारोह 1 के लिए अनुकूल है। एकाग्रता स्वतंत्र हदबंदी निरंतर कश्मीर डी Bou के बीच संतुलन का वर्णनएन डी और अबाध राज्य; इस प्रकार, एक ligand के लिए एक बाध्यकारी साइट की आत्मीयता मापा जाता है। एकाग्रता पर निर्भर चुनाव आयोग 50 मूल्य हिल समीकरण से निकाली गई एक ligand लेबल अणुओं की जो आधे पर ही राज्य में कर रहे हैं के प्रभावी खुराक का प्रतिनिधित्व करता है। हिल फिट बाध्यकारी मॉडल multivalent करने के लिए, खासकर अगर वे सहकारी रहे हैं लागू किया जाना चाहिए।

एकीकृत गुणवत्ता नियंत्रण ऐसे एसपीआर या आईटीसी के रूप में प्रौद्योगिकियों पर मासिक सीजन टिकट से एक बड़ा लाभ यह है प्रतिनिधित्व करते हैं। इन नियंत्रणों तकनीकी सेटअप की तेज और आसान अनुकूलन इष्टतम डेटा की गुणवत्ता सुनिश्चित करने के लिए अनुमति देते हैं। समय कुशल माप (15 मिनट में कश्मीर घ) और स्थिरीकरण मुक्त सेटअप के अलावा, मासिक सीजन टिकट आणविक बातचीत के आकलन की अनुमति, lysates और सीरा 5,42,43 में भी, buffers के चुनाव प्रदान करता है। तथ्य यह है कि आणविक thermophoresis आकार, प्रभारी, और अणुओं के हाइड्रेशन खोल पर निर्भर करता है के कारण, वहाँ कोई सीमा नहीं हैएमएसटी माप के दौरान मापा बातचीत भागीदारों के आकार में। गतिशील वायुसेना फाई सामुदायिक रेंज, बजे से मिमी, एक साथ कम नमूना खपत के साथ, मासिक सीजन टिकट प्रौद्योगिकी की ताकत से पूरा करती है। यह उल्लेखनीय है कि इस तरह के मासिक सीजन टिकट बंधन आत्मीयता, stoichiometry, और ऊष्मा के रूप में बुनियादी मानकों पर बाध्यकारी सटीक डेटा उत्पन्न करने लायक है। हालांकि, मासिक सीजन टिकट पर कश्मीर की माप के लिए अनुमति देते हैं और दरों में कश्मीर बंद नहीं करता। इसके अलावा, एक है कि विचार करने के लिए, सबसे एमएसटी प्रयोगों के लिए, एक फ्लोरोसेंट संशोधन बातचीत भागीदारों में से एक में जोड़ा जाना चाहिए है। उत्पन्न डेटा ऐसे एसपीआर और आईटीसी 32,43-46 के रूप में राज्य के अत्याधुनिक प्रौद्योगिकी, के साथ अच्छे समझौते में हैं। हालांकि, इन आंकड़ों की गुणवत्ता नियंत्रित कर रहे हैं, प्रयोगों तेजी से कर रहे हैं, और वे कम सामग्री खपत करते हैं। कुल मिलाकर, एमएसटी राज्य के अत्याधुनिक प्रौद्योगिकियों के लिए एक शक्तिशाली प्रौद्योगिकी orthogonal, कुछ अतिरिक्त लाभ के साथ प्रतिनिधित्व करता है।

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Disclosures

सीई और टीएस 2bind GmbH, जो biophysical विश्लेषणात्मक सेवाएं प्रदान करता है के कर्मचारी हैं। इस वीडियो लेख के लिए प्रकाशन फीस 2bind GmbH द्वारा भुगतान किया जाता है।

Acknowledgments

लेखकों कोई स्वीकृतियां है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Aptamer binding buffer 20 mM Tris pH 7.6; 300 mM NaCl; 5 mM MgCl2; 0.01% Tween-20
Fluorescently labeled ATP aptamer IDT, Leuven, Belgium sequence: DH25.42 50-Cy5-CCTGGGGGAGT-
ATTGCGGAGGAAGG-3
ATP Sigma Aldrich, Germany  A2383 10 mM stock solutions stored at - 20 °C
ADP Sigma Aldrich, Germany  A2754 10 mM stock solutions stored at - 20 °C
AMP Sigma Aldrich, Germany  A2252 10 mM stock solutions stored at - 20 °C
Adenine Sigma Aldrich, Germany  A8626 10 mM stock solutions stored at - 20 °C
SAM Sigma Aldrich, Germany  A7007 10 mM stock solutions stored at - 20 °C
dATP Sigma Aldrich, Germany  11934511001 10 mM stock solutions stored at - 20 °C
CTP Sigma Aldrich, Germany  C1506 10 mM stock solutions stored at - 20 °C
GTP Sigma Aldrich, Germany  G8877 10 mM stock solutions stored at - 20 °C
Monolith NT.115  NanoTemper Technologies, Munich, Germany MO-G008 Blue/Red Channel
MST device with standard detector, Monolith NT115 pico is MST device with high sensitivity detector
Monolith NT.115 capillaries Standard NanoTemper Technologies, Munich, Germany MO-K002
Eppendorf PCR tubes Eppendorf, Germany 30124537
Monolith control software. 2.1.33, pre-installed on the device NanoTemper Technologies, Munich, Germany
MO.affinity analysis v2.1.1 NanoTemper Technologies, Munich, Germany
Kaleidagraph 4.5.2 Synergy Software

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जैव रसायन अंक 119 छोटे अणु-aptamer बातचीत बाध्यकारी पैरामीटर microscale thermophoresis बंधन आत्मीयता stoichiometry ऊष्मा न्यूक्लिक एसिड बाध्यकारी साइट मानचित्रण
बाध्यकारी microscale thermophoresis का उपयोग करते हुए एटीपी पर एक Aptamer की साइट मानचित्रण
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Entzian, C., Schubert, T. Mapping the Binding Site of an Aptamer on ATP Using MicroScale Thermophoresis. J. Vis. Exp. (119), e55070, doi:10.3791/55070 (2017).

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