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Biochemistry

La cartographie du site de liaison d'un aptamère sur ATP utilisant MicroScale thermophorèse

Published: January 7, 2017 doi: 10.3791/55070
Automatic Translation
1, 1
12bind GmbH

Introduction

L'interaction entre les molécules est la base de la nature. Par conséquent, les scientifiques dans de nombreux domaines de la recherche fondamentale et appliquée tentent de comprendre les principes fondamentaux des interactions moléculaires de différents types. MicroScale thermophorèse (MST) permet aux scientifiques d'effectuer la caractérisation précise rapide, rentable et de qualité contrôlée des interactions moléculaires en solution, avec un libre choix de tampons. Il y a déjà plus de 1000 publications en utilisant MST, à partir de 2016 seulement, décrivant les différents types d'analyses, y compris des projections de la bibliothèque, les validations d'événements, des essais de compétition, et les expériences de liaison avec plusieurs partenaires de liaison 1-8. En général, le MST permet l'étude des paramètres de liaison classiques, tels que l'affinité de liaison (pM ​​mM), stoechiométrie, et de la thermodynamique, de tout type d'interaction moléculaire. Un grand avantage de MST est la possibilité d'étudier des événements de liaison indépendants de la taille des partenaires d'interaction. Même chalinteractions lenging entre les petites aptamères d'acides nucléiques (15-30 nt) et des cibles telles que des petites molécules, des médicaments, des antibiotiques, ou métabolites peuvent être quantifiés.

Les technologies actuelles state-of-the-art pour caractériser les interactions aptamère-cibles sont soit en laboratoire intense et très complexe ou ne parviennent pas à quantifier les interactions aptamère-petite molécule 9,10. Surface Plasmon Resonance (SPR) à base de dosages 11,12 et approches colorimétriques vraiment sans étiquette, comme Calorimétrie titration isotherme (ITC) 13-15, élution isocratique 16, l' équilibre fi ltration 17,18, en ligne de sondage 19, gel - passer des tests, arrêt - fl ux fl uorescence spectroscopie 20,21, anisotropie de fluorescence (FA) 22,23, une seule molécule fl uorescence imagerie 24,25, et Bio-couche interférométrie (BLI) 26 sont également soit imprécis ou incompatible avec la molécule d'aptamères-petite interactions. Autres principal enjeux de ces méthodes sont une faible sensibilité, une consommation élevée de l'échantillon, l'immobilisation, les limitations de transport de masse sur les surfaces, et / ou des restrictions de mémoire tampon. Seules quelques-unes de ces technologies offrent des contrôles intégrés pour l'agrégation et d'adsorption des effets.

MST représente un outil puissant pour les scientifiques de surmonter cette limitation pour étudier les interactions entre les aptamères et les petites molécules 27-29, ainsi que d' autres cibles telles que les protéines 30-33. La technologie repose sur le mouvement de molécules à travers des gradients de température. Ce mouvement dirigé, appelé "thermophorèse," dépend de la taille, la charge, et la coquille d'hydratation de la molécule 34,35. La liaison d'un ligand à la molécule directement altérer au moins l'un de ces paramètres, ce qui entraîne une mobilité thermophorétique changé. Ligands avec de petites tailles peuvent ne pas avoir un impact considérable en termes de changement de taille de la non liée à l'état lié, mais ils peuvent avoir dr effets Amatic sur la coque et / ou la charge hydratation. Les changements dans le mouvement thermophorétique des molécules après interactions avec le partenaire de liaison permet la quantification des paramètres de liaison de base 2,7,34,36,37.

Comme cela est représenté sur la figure 1A, le dispositif MST est constitué d'un laser infrarouge focalisé sur l'échantillon à l' intérieur des tubes capillaires en verre optique en utilisant les mêmes que pour la détection de la fluorescence. Le mouvement thermophorétique de protéines via le fl uorescence intrinsèque de tryptophanes 6 ou d'un partenaire d' interaction 3,8 marqué par fluorescence peut être surveillée tandis que le laser établit un gradient de température (AT de 2-6 ° C). La différence de température dans l' espace, AT, conduit à l'épuisement ou l' accumulation de molécules dans le domaine de température élevée, qui peut être quantifiée par la Soret coef fi cient (S T):

g "/>

c représente la concentration à chaud dans la région chauffée et froid c est la concentration initiale dans la zone froide.

Comme le montre la figure 1B, un exemple typique de résultats expérimentaux MST dans un profil de mouvement MST (trace de temps), composé de différentes phases, qui peuvent être séparés par leurs échelles de temps respectives. La fluorescence initiale est mesurée au cours des 5 premières secondes en absence de gradient de température pour définir la fluorescence de départ précis et pour vérifier photoblanchiment ou photoenhancement. Le saut de température (T-Jump) représente la phase dans laquelle les changements de fluorescence avant le mouvement thermophorétique. Cette diminution initiale de la fluorescence dépend des changements de chaleur dépendant de fl uorophore rendement quantique. La phase de thermophorèse suit, dans laquelle les baisses de fluorescence (ou augmente) en raison du mouvement thermophorétique des molécules jusqu'à ce que la distribution à l'état d'équilibre est atteint.Le tjump inverse et rétrodiffusion concomitante de molécules fluorescents peuvent être observées comme indiqué dans la figure 1B après le laser est éteint. Pour accéder aux paramètres de liaison de base, différents rapports molaires des partenaires d'interaction sont analysées et comparées. En règle générale, 16 rapports différents sont étudiés dans une expérience MST, tandis que la molécule visible optique est maintenue constante et est alimentée avec une quantité croissante du ligand non marqué. L'interaction entre les deux partenaires de liaison induit des changements dans la thermophorèse, et donc dans la fluorescence normalisée, F norme, qui est calculé comme suit:

Équation

F chaud et froid F représentent en moyenne fl intensités uorescence au dé fi nies points de temps des traces du MST. Les affinités de liaison (K d ou CE 50 valeurs) peuvent être calculées par curve montage (figure 1C).

Dans l'ensemble, le MST est un outil puissant pour étudier les interactions moléculaires de toute nature. Ce manuscrit propose un protocole pour caractériser l'interaction difficile entre la petite triphosphate molécule d'adénosine (ATP; 0,5 kDa) et le 25-nt court ADNss aptamère DH25.42 (7,9 kDa). Au cours du manuscrit, le site de liaison de l'aptamère sur la molécule d'ATP est mappée vers le bas pour le groupe adénine de l'ATP.

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Protocol

1. Préparation de l'aptamère de travail Stock

  1. Suivez les instructions du fabricant et de dissoudre l'oligonucléotide (5-Cy5-CCTG GGGGAGTATTGCGGAGGAAGG-3, la séquence de référence 18) dans l' eau, pour atteindre une concentration finale de 100 uM.
  2. Préparer la solution de travail en diluant aptamère l'oligonucléotide actions pour 200 nM avec un tampon de liaison (Tris 20 mM, pH 7,6, NaCl 300 mM, MgCl2 5 mM, 0,01% de Tween 20).
  3. Incuber le mélange pendant 2 min à 90 ° C, laisser refroidir l'échantillon immédiatement vers le bas sur la glace, et d'utiliser l'échantillon à température ambiante.

2. Préparation de la dilution de la série Ligand

  1. Pour chaque ligand (adénosine triphosphate (ATP), l'adénosine diphosphate (ADP), l'adénosine monophosphate (AMP), l'adénine, la guanosine triphosphate (GTP), cytosine triphosphate (CTP), désoxyadénosine triphosphate (dATP), et S-adénosyl méthionine (SAM) ; 10 mM chacun), préparer une série diluti 16 étapesdans 200 micro-tubes de réaction ul.
    NOTE: Centrifugation des stocks de ligand pendant 5 min à 14000 xg peut aider à éliminer les agrégats. Faible volume des tubes à faible réaction de liaison sont recommandés pour éviter l'adsorption de molécules sur les parois du tube.
  2. Commencer avec une concentration maximale d'au moins 50 fois supérieure à l'affinité estimée et réduire la concentration en ligand de 50% à chaque étape de dilution.
    REMARQUE: L'outil concentration finder mis en œuvre dans le logiciel de contrôle simule les données de liaison et aide à trouver la plage de concentration juste pour la série de dilution.
  3. Remplir 20 pi de ligand stock (10 mM) dans le tube 1. Ajouter 10 pi de tampon de liaison de l'aptamère dans des tubes de réaction micro 2-16.
  4. Transfert 10 pi de tube 1 à tube 2 et bien mélanger par pipetage de haut en bas plusieurs fois. Transférer 10 pi au tube suivant et répétez cette dilution pour les tubes restants.
  5. Jeter l'excès de 10 ul du dernier tube. Évitez tout bUffer effets de dilution. Le tampon dans le tube 1 et 2-16 dans les tubes doivent être identiques.

3. Préparation du mélange final de réaction

  1. Préparer les réactions de liaison individuelles avec un volume de 20 pi (10 pi de solution de travail aptamère + 10 pl de la dilution du ligand respectif) afin de minimiser les erreurs de pipetage. Un volume de seulement 4 pi est suf fi sante pour fi ll le capillaire.
  2. Ajouter 10 ul de la solution de travail 200 nM aptamère à 10 ul de chaque dilution du ligand et bien mélanger par pipetage de haut en bas plusieurs fois.
  3. Incuber les échantillons pendant 5 min à température ambiante et fi ll les échantillons dans les capillaires classiques en plongeant les capillaires dans l'échantillon. De plus longs temps d'incubation peuvent être nécessaires pour certaines interactions; cependant, 5 minutes est suffisante pour la plupart. Touchez les capillaires que sur les côtés, pas sur la partie centrale, où la mesure optique sera prise.
  4. Placer les capillaires th SUR DESe plateau capillaire et démarrer le périphérique MST.

4. À partir de l'appareil MST

NOTE: Le dispositif fournit deux logiciels pré-installés, le "logiciel pour la configuration technique des conditions expérimentales et de contrôle '' analyse« logiciel pour l'interprétation des données produites.

  1. Avant de placer le bac capillaire dans le dispositif MST, démarrez le logiciel de commande et de régler la température globale souhaitée en sélectionnant '' activer le contrôle manuel de la température "dans le '' contrôle de la température" menu déroulant. Ajuster la température à 25 ° C de cette manière.
    REMARQUE: Les instruments peuvent être MST 22-45 ° C, à température contrôlée.
  2. Attendez que la température pour atteindre le niveau attendu, puis placer le plateau capillaire dans le dispositif MST.
  3. Réglez le canal LED '' rouge "pour les colorants Cy5 et ajuster la puissance LED pour obtenir un fl uorescencsignal e de 300 à 1000 unités de fluorescence au niveau du dispositif MST avec un capteur standard. 25% de la puissance LED est utilisé dans cette étude.
    NOTE: 6.000 à 18.000 unités de fluorescence sont recommandées pour le MST avec un capteur à haute sensibilité.

5. Capillaire Numériser

  1. Effectuer une analyse capillaire pour vérifier les différents aspects de la qualité de l'échantillon en choisissant la position capillaire sur le logiciel de «contrôle» et en cliquant sur "start cap scan" avant de commencer la mesure MST.
  2. Inspecter l'analyse capillaire pour la fluorescence d'amélioration / trempe et les effets de collage (U ou aplatie pics) dans le logiciel.
    NOTE: Plus de détails sur la détection et la manipulation de la fluorescence et les effets de collage peuvent être trouvés dans la discussion.

6. MST Mesure

NOTE: Avant de commencer la mesure MST, assurez-vous d'exclure coller des effets, l'amélioration / effets de trempe, ouerreurs de pipetage, et veiller à ce que l'analyse capillaire indique que le signal de fluorescence est suffisante. Pour plus de détails, voir la discussion.

  1. Affecter les concentrations de ligand de la série de dilution à la position respective dans le capillaire "logiciel" "contrôle Considérons l'étape de dilution du mélange de l'aptamère et un ligand. (1: 1).
  2. Entrez la plus forte concentration de ligand (5 mM) pour capillaire # 1, sélectionnez le type de dilution correct (ici, 1: 1), cliquez sur la concentration maximale, et utiliser la fonction de glisser pour attribuer automatiquement les concentrations restantes dans les capillaires # 2- 16. La concentration la plus faible est 152,6 nm.
  3. Entrer la concentration de l'aptamère fluorescents (ici 100 nM) dans la section respective du logiciel de commande.
  4. Utilisez les paramètres par défaut, qui détectent la fl uorescence pendant 5 secondes, enregistrer le MST pendant 30 secondes, et enregistrer la fluorescence pendant encore 5 secondes après l'inactivation du laser t o surveiller la diffusion arrière de molécules.
  5. Régler la puissance du laser à 20%, dans la partie correspondante du logiciel de commande.
    NOTE: Afin de recevoir le meilleur rapport signal-bruit et éviter les effets non spécifiques, une puissance laser de 20-40% est recommandé. Dans certains cas, une puissance laser plus élevée peut être nécessaire pour obtenir une bonne séparation des molécules non liées et liées.
  6. Enregistrer l'expérience après avoir sélectionné le dossier de destination et démarrer la mesure MST en appuyant sur le bouton '' de mesure Démarrer MST ".
    REMARQUE: Le fichier .ntp sera généré dans le dossier de destination. Grâce à cette configuration, une mesure dure 10-15 min.
  7. Répétez la procédure expérimentale au moins deux fois pour une détermination plus précise de la valeur CE 50.
    NOTE: Afin de tester la reproductibilité technique, les mêmes capillaires peuvent être numérisés à plusieurs reprises (répétitions techniques).

7. MST Analyse des données

nt "> NOTE: Le logiciel d'analyse permet à l'analyse des données sur la fl y pendant la mesure Le logiciel d'analyse trace les traces de temps MST et des changements dans la normalisation de fluorescence (F norme) par rapport à la concentration de ligand 37..

  1. Démarrez le logiciel d'analyse MST (MO.Affinity Analysis) et charger le fichier .ntp à partir du dossier de destination. Sélectionnez "MST" comme le type d'analyse dans le menu de sélection des données.
    NOTE: En cas d'effets de fluorescence ligand-dépendante, la fluorescence initiale peut être choisie pour l'analyse.
  2. Ajouter la course technique ou biologique respective (s) à une nouvelle analyse par glisser-déposer ou en appuyant sur le bouton "+" en dessous de la course expérimentale respective.
  3. Appuyez sur le bouton d'information ci-dessous la course expérimentale respective pour obtenir des informations sur les propriétés de l'expérience, des traces du MST, analyse capillaire, la forme capillaire, fluorescence initiale, et le taux de blanchiment.
    NOTE: Ces données brutes peuvent alalors être inspecté dans les étapes ultérieures de l'analyse.
  4. Inspecter visuellement les traces du MST pour l'agrégation et de précipitation effets, visibles comme des bosses et des pointes.
    NOTE: Pour plus d'informations sur la détection et le traitement des effets d'agrégation, lisez la discussion.
  5. Inspecter visuellement l'analyse capillaire et le capillaire forme overlay pour les effets d'adsorption, visible sous forme de pics aplatis ou en forme de U. Inspecter visuellement l'analyse capillaire et la fluorescence initiale pour les effets de fluorescence. Inspecter visuellement le taux de blanchiment pour les effets photoblanchiment.
  6. Passez en mode dose-réponse et modifier le paramètre d'analyse en mode "expert" en appuyant sur la touche correspondante. Sélectionnez "T-Jump» comme stratégie d'évaluation MST.
  7. Sélectionnez le modèle "Hill" pour la courbe fi Prép. Les paramètres de liaison seront automatiquement calculés. Normaliser les données en choisissant le type respectif de la normalisation dans le menu "comparer les résultats". Export de lales données soit en tant .xls ou .pdf.
    NOTE: Le tableau ci-dessous le graphique de liaison résume les paramètres de liaison calculés.

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Representative Results

Dans cette étude, le MST a été appliquée pour caractériser le site de liaison de l'aptamère ADN DH25.42 18 sur l' ATP. Contrairement à d' autres études caractérisant l'interaction de l' ATP ou d' ATP mimant les petites molécules avec des protéines marquées de façon aléatoire avec un ou plusieurs fluorophores 38-40, cette étude comprend une version marquée de l'aptamère 7,9 kDa ADNsb avec une molécule Cy5 sur l'extrémité 5 ' . Différents dérivés de l'ATP et des molécules apparentées, toutes différentes de l'ATP dans diverses positions, ont été utilisés pour cartographier le site de liaison sur la molécule d'ATP. Des séries de dilution (en 16 étapes, ce qui réduit la concentration en ligand de 50% chacun) des différents ligands ont été préparées et mélangées avec une quantité constante de l'aptamère marqué au Cy5. Les échantillons ont été analysés dans les capillaires classiques à LED 25% et 20% de la puissance laser. profils de Mouvement (traces de temps MST) ont été enregistrés et les unités de fluorescence, dérivées de la phase T-Jump, ont été tracées par rapport au concentr ligandation (comparer Figure 1C). Ajustement de la courbe a été réalisée l' application de l'équation de Hill, résultant en CE 50 valeurs. Dans 5 répétitions indépendantes biologiques (4 opérateurs différents, 2 stocks aptamères différents, 2 stocks de ATP différents), l'interaction ATP-aptamère montre une amplitude de liaison négative de 6 à 13 unités et une EC 50 valeur moyenne de 52,3 ± 5,0 uM (Figure 2A ). Les barres d'erreur dans les graphiques de liaison et "±" présenté dans les données d'affinité représentent l'écart-type de 5 répétitions biologiques (5 mesures indépendantes dans un capillaire différent). Affinités rapportées précédemment pour l'interaction de l'aptamère avec DH25.42 [2,8,5'- 3 H] adénosine et ATP d' agarose étaient comparables. L'interaction de l' adénosine radiomarqués avec l'aptamère a été quantifié par un essai de filtration centrifuge et une affinité (Kd) de 6 ± 3 pM a été déterminée. expériences d'élution isocratiques avec immobil ATPized à agarose entraîné une affinité (K d) de 13 uM 18,41.

Pour une meilleure comparaison côte à côte, les données peuvent être normalisées à la fraction de molécules complexées (fraction liée, FB) en utilisant l'équation suivante:
Équation
où la valeur (c) est la valeur mesurée MST pour la concentration c, libre est la valeur MST pour l'état non lié (concentration la plus basse), et complexée est la valeur MST pour l'état complètement lié (figure 2B). Cette normalisation est idéale pour comparer les résultats de différents ligands dans un même graphique, comme représenté sur la figure 2C. Les nautés détectées af fi d'ADP (63,6 ± 5,9 uM en double biologiques), AMP (91,6 ± 9,1 uM en double biologiques) et SAM (44,4 ± 3,2 uM en double biologiques), qui diffèrent de l'ATP dans le numbre des groupes phosphates, implique que cette position n'a pas ou seulement mineure in fl uence sur le comportement de liaison de l'aptamère (figure 2C et D). Le groupe OH sur le carbone C2 du ribose de l'ATP pourrait également être exclu d'être le site de liaison majeur, comme dATP a également été lié par l'aptamère avec une affinité légèrement réduite (64,4 ± 6,1 uM en double biologiques). Modification du groupe purine de l'ATP au groupe pyrimidine CTP a abouti à la non-liaison de l'aptamère, ce qui démontre l'importance de ce groupe pour l'interaction. L'aptamère lié à l'adénine avec une affinité de 141,7 ± 9,4 uM (en double biologiques), montrant que le site de liaison doit être dans cette partie de la molécule d'ATP. Les molécules de purine de l' ATP et GTP diffèrent dans la zone hachurée verte représentée à la figure 2D, qui représente le principal site de liaison de l'aptamère à l' ATP. Une autre étude a utilisé des expériences non quantitatives élution avec différents dérivés de l'ATPéluer un aptamère radiomarqué ATP agarose, qui a montré des résultats comparables à cette étude MST 18.

Figure 2
Figure 1: MicroScale thermophorèse. (A) La configuration technique de la technologie MST est montré. Les éléments optiques focalisent sur le centre des capillaires de verre, afin de détecter le signal de fluorescence de la molécule optiquement visible. Un laser infrarouge est utilisé pour établir un gradient de température dans la fenêtre d'observation du système optique. Les variations de fluorescence peuvent être utilisés pour surveiller le mouvement thermophorétique des molécules en solution (B) MST trace temporelle mouvement pro fi de molécules dans un gradient de température. La fluorescence initiale est mesurée pendant 5 secondes tandis que le laser est éteint. Allumer le laser génère un gradient de température. Après le T-Jump immédiate phase, dans lequel le colorant fluorescent fl diminue son rendement de signal lors de l'induction de la chaleur, le mouvement thermophorétique a lieu et est observé pendant 30 secondes. Après le laser est éteint, les molécules diffusent en arrière. (C) Les résultats d'une expérience typique: HNR ( à gauche) 16 capillaires contenant la même concentration de molécule fluorescente et une concentration croissante du ligand non marqué; les traces de temps MST sont enregistrées et normalisée à leur fluorescence initiale. (À droite) Le fl uorescence normalisé; la différence entre F et F froid à chaud est fonction de la concentration du ligand. Un ajustement de la courbe de ces données donne des paramètres, tels que la liaison af fi nité de liaison. Re-imprimer avec la permission d'Elsevier, Méthodes 28; numéro de licence 3890230800113. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2
Figure 2: MST analyse des données. (A) La valeur de référence corrigée normalisée fl fluorescence norme AF (‰), dérivé du signal MST tjump, est tracée en fonction de la concentration en ATP (en uM). L'équation de Hill (CE 50) a été appliquée pour l' ajustement de courbe. Les barres d'erreur représentent l'écart-type à partir de cinq répétitions biologiques. (B) de la parcelle de Fraction liée des données présentées dans A. Les ensembles de données respectifs ont été normalisées à la fraction liée, et la moyenne de ces données normalisées sont présentées dans le graphique de liaison. Les barres d'erreur indiquent l'écart-type de 5 répétitions biologiques. (C) Le graphe de la fraction liée à une comparaison quantitative (Hill TRG) des ligands différents à l'aptamère. Les barres d'erreur représentent la norme deviation de deux répétitions biologiques. (D) de liaison des affinités (CE 50) de différents ligands à l'aptamère. La zone ombrée verte indique le site de liaison de l'aptamère sur le groupe adénine de l'ATP. Ce chiffre est modifié à partir d' Elsevier, Méthodes 28; numéro de licence 3890230800113. Les ensembles de données de l'étude précédente sont réanalysés et développées au sein de cette étude. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 3
Figure 3: optimisation de dosage pour les expériences du MST. (A) l' adsorption des protéines et des effets de collage peuvent être détectés dans l'analyse capillaire. les formes des pics irréguliers, tels que des pics aplatis ou en forme de U, indiquent l'adhérence du matériau d'échantillon à la surface du verre. Caccrochant le type capillaire (standard, premium, ou hydrophobe) peut empêcher l'adsorption molécule, ce qui entraîne une forme régulière de pointe. (B) Les traces de temps MST servent également de contrôle de la qualité, étant donné que les agrégats peuvent y être détectés comme des bosses et des pointes. Les conditions expérimentales peuvent être optimisées en améliorant la solubilité des molécules (par exemple, y compris les détergents tels que le Pluronic F-127 ou en faisant varier des valeurs de pH ou une concentration en sel). Centrifugation peut aider à éliminer les plus gros agrégats. Pour garantir une qualité optimale des données, les traces de temps MST doivent ressembler à l'exemple donné. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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Discussion

Les contrôles de qualité:

l'adhérence non spécifique / adsorption de l'échantillon de matériau sur les surfaces, ainsi que des effets d'agrégation, ont une influence considérable sur la qualité des données d'affinité. Cependant, seulement quelques technologies state-of-the-art offrent des options précises et rapides pour surveiller et éviter ces effets. MST offre des contrôles de qualité intégrés qui détectent et aident à surmonter ces problèmes, permettant l'optimisation des étapes de la configuration technique. Informations importantes sur le collage et la fluorescence des effets peut être extraite de l'analyse capillaire et la forme capillaire (étapes 5.2 et 7.5), alors que l'agrégation / effets de précipitation (étape 7.7) peuvent être surveillés dans les profils de mouvement. Ces commandes permettent à l'amélioration constante de la qualité des données et représentent des étapes cruciales dans le protocole.

La détection des effets d'adsorption et de dépannage:

L'analyse capillaire est principalement réalisée en tant inil'étape tielle pour déterminer la position des capillaires sur le support de plateau par balayage de la fluorescence au-dessus. Chaque pic représente un capillaire, ce qui indique le point de départ pour la mesure MST. Une inspection visuelle de la forme de pointe permet la détermination de l'adsorption des molécules à la surface du verre, qui est un contrôle de la qualité essentielle qui doit être effectuée avant de commencer l'expérience MST. La superposition de forme capillaire permet la détection facile des aplaties, des formes de pointe bosselées, ou même des pics qui ressemblent à une forme de U, indiquant l'adsorption / collage de molécules à la surface de verre intérieure du capillaire (figure 3A, panneau supérieur). Différemment revêtu types capillaires (standard, premium et hydrophobe) aident à assurer la solubilité et une adsorption minimale des molécules aux capillaires. Capillaires doivent être testés pour leur aptitude avant les expériences de liaison. Détergents tels que le Tween (0,005-0,1%) ou F127 Pluronic (0,01-0,1% de) may empêcher aussi des effets d'adsorption non spécifiques. Optimisation à ce stade de l'expérience est essentielle pour la qualité des données (comparer la figure 3A, panneau inférieur).

La détection des effets de fluorescence et dépannage:

Les variations dans la hauteur de pic des capillaires numérisés offrent une autre couche d'informations sur les caractéristiques de l'échantillon. différences aléatoires dans la fluorescence capillaire peuvent, d'une part, être due à des erreurs de pipetage ou, d'autre part, proviennent de grands agrégats de l'échantillon dans la région de balayage qui peut augmenter la fluorescence de manière drastique. Haute précision de pipetage est obligatoire pour éviter des effets de dilution. Mélanger toutes les solutions par pipetage de haut en bas augmente la précision plus loin. En outre, il est essentiel de maintenir le tampon cohérent dans chaque capillaire. Les stratégies pour traiter les effets d'agrégation sont présentés dans un paragraphe ultérieur.

Des changements systémiques de fluorescence avec augchanter concentration ligand indiquent souvent des effets de trempe / de mise en valeur dépendante du ligand. Le "Test SD" est réalisée afin de discriminer induite par liaison-fluorescence des changements de perte de fluorescence non spécifique; ce test surveille l'intensité de fluorescence dans des conditions de dénaturation. En cas d'effets de fluorescence dépendant du ligand, les intensités de fluorescence dans des conditions de dénaturation soient identiques, indépendamment de la concentration du réactif de titrage. Si la différence entre les intensités de fluorescence est toujours présente dans ces conditions, la matière a été soit perdue en raison de l'adsorption non spécifique aux parois du tube, ou en raison de l'agrégation et centrifugation subséquente.

Afin d'effectuer le test de SD, 10 pl de la première et de 10 pi de la dernière étape ligand de dilution sont chacun transférés avec précaution dans un tube frais contenant 10 pi d'une SD Mix 2x (4% de SDS et 40 mM de DTT). Les échantillons sont mélangés et les molécules sont dénaturés pendant 5 min à 95 ° C. after remplissage des échantillons dans les capillaires, les intensités de fluorescence sont mesurées. Si un effet de fluorescence dépendant du ligand est détectée, les données peuvent être analysées directement par les informations de liaison déduites des variations d'intensité de fluorescence.

La détection des effets d'agrégation et de dépannage:

Bumpy, traces inégales de temps MST indiquent l' agrégation et / ou de précipitation des effets (Figure 3B, panneau supérieur). Matériau d'échantillon non agrégées affiche un profil propre et lisse thermophorétique mouvement (figure 3B, panneau inférieur). La centrifugation de l'échantillon avant l'utilisation (5 à 10 min à 14 000 x g), l'addition de détergents (de 0,005 à 0,1% de Tween-20, 0,01 à 0,1% de Pluronic F-127, ou similaire), l'utilisation de la BSA ( > 0,5 mg / ml), ou le changement des conditions de tampon (pH et force ionique) sont recommandées pour minimiser les effets d'agrégation et d'optimiser la qualité des données. Afin d'obtenir des données de haute qualité, ilil est essentiel de réduire au minimum les effets d'agrégation.

L'analyse des données et l'ajustement de courbe:

Un profil de mouvement thermophorétique est divisé en différentes phases, qui peuvent être contrôlés séparément ou de façon concomitante. Le T-Jump décrit le brusque changement de rendement de fluorescence lors d'un changement de température, ce qui représente une caractéristique intrinsèque de fluorophores. obligatoire dans les environs proches des fluorophores ou conformation des changements lors de la liaison très directe affectent le T-Jump. Le ralentissement de la thermophorèse se réfère au mouvement des molécules dans le domaine de la température, fournissant des informations sur la structure générale du complexe formé. Le type d'analyse de données par défaut utilise le paramètre "thermophorèse + T-Jump", en exploitant les deux phénomènes pour déterminer les paramètres de liaison. Dans le cas où les deux phases ont des directions opposées, il est recommandé d'analyser les phases séparément. S'il vous plaît noter que les délais d'effets et différentes espèces de molecules pourrait conduire à des différences dans l'affinité de la thermophorèse et T-Jump. Un autre type d'option d'analyse est le réglage manuel, ce qui permet l'étude des régions spécifiques du profil de mouvement. Les perturbations dues à l'agrégation ou la convection peuvent être exclus de cette façon. Afin d'améliorer la qualité des données, les curseurs peuvent être définis avant des signaux d'agrégation. L'examen du début thermophorèse produit couramment des données avec moins de bruit, puisque la convection est un processus dépendant du temps. Ce réglage manuel rapide est fortement recommandé pour les expériences avec la puissance laser élevée (80%). Sur le choix du réglage de l'analyse des données, deux modèles de montage intégrées dans le logiciel d'analyse peuvent être appliquées pour adapter la courbe de liaison. La fonction d' ajustement K d de la loi d'action de masse est adapté pour 1: 1 modes de liaison ou pour la liaison plusieurs sites possédant la même affinité. La concentration indépendante de la dissociation constante K D décrit l'équilibre entre la bound et de l'état non lié; Ainsi, l'affinité d'un site de liaison à un ligand est mesurée. La CE 50 valeur de concentration-dépendante dérivée de l'équation de Hill représente la dose efficace d'un ligand à laquelle la moitié des molécules marquées sont dans l'état lié. L'ajustement Colline devrait être appliquée à multivalent modèles contraignants, surtout si elles sont coopératifs.

Les contrôles de qualité intégrés représentent un grand avantage des MST sur des technologies telles que SPR ou ITC. Ces contrôles permettent l'optimisation rapide et facile de la configuration technique pour assurer la qualité optimale des données. En plus des mesures de temps efficace (K j en 15 min) et la configuration sans immobilisation, MST offre le libre choix des tampons, ce qui permet l'évaluation des interactions moléculaires, même dans les lysats et les sérums 5,42,43. En raison du fait que la thermophorèse moléculaire dépend de la taille, la charge et la coquille d'hydratation des molécules, il n'y a pas de limitationsla taille des partenaires d'interaction de mesure pendant les mesures MST. La gamme dynamique af fi nité, de pM mM, ainsi que la consommation d'échantillon faible, complète les points forts de la technologie MST. Il est à noter que la TMS génère des données précises sur les paramètres de liaison de base, tels que l'affinité de liaison, stoechiométrie, et de la thermodynamique. Cependant, le MST ne permet pas la mesure de k sur k et sur les tarifs. En outre, il faut considérer que, pour la plupart des expériences MST, une modification de fluorescence doit être ajouté à l'un des partenaires d'interaction. Les données générées sont en bon accord avec l' état de l'art des technologies, telles que les SPR et ITC 32,43-46. Cependant, ces données sont de qualité contrôlée, les expériences sont plus rapides, et ils consomment moins de matériaux. Dans l'ensemble, MST représente un orthogonal technologie puissante aux technologies state-of-the-art, avec quelques avantages supplémentaires.

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Disclosures

CE et TS sont des employés de 2bind GmbH, qui fournit des services d'analyse biophysiques. frais de publication pour cette vidéo-article sont payés par 2bind GmbH.

Acknowledgments

Les auteurs ont pas accusés de réception.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Aptamer binding buffer 20 mM Tris pH 7.6; 300 mM NaCl; 5 mM MgCl2; 0.01% Tween-20
Fluorescently labeled ATP aptamer IDT, Leuven, Belgium sequence: DH25.42 50-Cy5-CCTGGGGGAGT-
ATTGCGGAGGAAGG-3
ATP Sigma Aldrich, Germany  A2383 10 mM stock solutions stored at - 20 °C
ADP Sigma Aldrich, Germany  A2754 10 mM stock solutions stored at - 20 °C
AMP Sigma Aldrich, Germany  A2252 10 mM stock solutions stored at - 20 °C
Adenine Sigma Aldrich, Germany  A8626 10 mM stock solutions stored at - 20 °C
SAM Sigma Aldrich, Germany  A7007 10 mM stock solutions stored at - 20 °C
dATP Sigma Aldrich, Germany  11934511001 10 mM stock solutions stored at - 20 °C
CTP Sigma Aldrich, Germany  C1506 10 mM stock solutions stored at - 20 °C
GTP Sigma Aldrich, Germany  G8877 10 mM stock solutions stored at - 20 °C
Monolith NT.115  NanoTemper Technologies, Munich, Germany MO-G008 Blue/Red Channel
MST device with standard detector, Monolith NT115 pico is MST device with high sensitivity detector
Monolith NT.115 capillaries Standard NanoTemper Technologies, Munich, Germany MO-K002
Eppendorf PCR tubes Eppendorf, Germany 30124537
Monolith control software. 2.1.33, pre-installed on the device NanoTemper Technologies, Munich, Germany
MO.affinity analysis v2.1.1 NanoTemper Technologies, Munich, Germany
Kaleidagraph 4.5.2 Synergy Software

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References

  1. Linke, P., et al. An Automated Microscale Thermophoresis Screening Approach for Fragment-Based Lead Discovery. J Biomol Screen. 21 (4), 414-421 (2015).
  2. Jerabek-Willemsen, M., et al. MicroScale Thermophoresis: Interaction analysis and beyond. Journal of Molecular Structure. 1077, 101-113 (2014).
  3. Zillner, K., et al. Microscale thermophoresis as a sensitive method to quantify protein: nucleic acid interactions in solution. Methods Mol Biol. 815, 241-252 (2012).
  4. Zhang, W., Duhr, S., Baaske, P., Laue, E. Microscale thermophoresis for the assessment of nuclear protein-binding affinities. Methods Mol Biol. 1094, 269-276 (2014).
  5. Wienken, C. J., Baaske, P., Rothbauer, U., Braun, D., Duhr, S. Protein-binding assays in biological liquids using microscale thermophoresis. Nat Commun. 1, 100 (2010).
  6. Seidel, S. A., et al. Label-free microscale thermophoresis discriminates sites and affinity of protein-ligand binding. Angew Chem Int Ed Engl. 51 (42), 10656-10659 (2012).
  7. Seidel, S. A., et al. Microscale thermophoresis quantifies biomolecular interactions under previously challenging conditions. Methods. 59 (3), 301-315 (2013).
  8. Schubert, T., et al. Df31 protein and snoRNAs maintain accessible higher-order structures of chromatin. Mol Cell. 48 (3), 434-444 (2012).
  9. McKeague, M., Derosa, M. C. Challenges and opportunities for small molecule aptamer development. J Nucleic Acids. 2012, 748913 (2012).
  10. Ruscito, A., DeRosa, M. C. Small-Molecule Binding Aptamers: Selection Strategies, Characterization, and Applications. Front Chem. 4, 14 (2016).
  11. Chang, A. L., McKeague, M., Liang, J. C., Smolke, C. D. Kinetic and equilibrium binding characterization of aptamers to small molecules using a label-free, sensitive, and scalable platform. Anal Chem. 86 (7), 3273-3278 (2014).
  12. Chang, A. L., McKeague, M., Smolke, C. D. Facile characterization of aptamer kinetic and equilibrium binding properties using surface plasmon resonance. Methods Enzymol. 549, 451-466 (2014).
  13. Jing, M., Bowser, M. T. Methods for measuring aptamer-protein equilibria: a review. Anal Chim Acta. 686 (1-2), 9-18 (2011).
  14. Sokoloski, J. E., Dombrowski, S. E., Bevilacqua, P. C. Thermodynamics of ligand binding to a heterogeneous RNA population in the malachite green aptamer. Biochemistry. 51 (1), 565-572 (2012).
  15. Burnouf, D., et al. kinITC: a new method for obtaining joint thermodynamic and kinetic data by isothermal titration calorimetry. J Am Chem Soc. 134 (1), 559-565 (2012).
  16. Mannironi, C., Scerch, C., Fruscoloni, P., Tocchini-Valentini, G. P. Molecular recognition of amino acids by RNA aptamers: the evolution into an L-tyrosine binder of a dopamine-binding RNA motif. RNA. 6 (4), 520-527 (2000).
  17. Jenison, R. D., Gill, S. C., Pardi, A., Polisky, B. High-resolution molecular discrimination by RNA. Science. 263 (5152), 1425-1429 (1994).
  18. Huizenga, D. E., Szostak, J. W. A DNA aptamer that binds adenosine and ATP. Biochemistry. 34 (2), 656-665 (1995).
  19. Lee, E. R., Baker, J. L., Weinberg, Z., Sudarsan, N., Breaker, R. R. An allosteric self-splicing ribozyme triggered by a bacterial second messenger. Science. 329 (5993), 845-848 (2010).
  20. Wickiser, J. K., Cheah, M. T., Breaker, R. R., Crothers, D. M. The kinetics of ligand binding by an adenine-sensing riboswitch. Biochemistry. 44 (40), 13404-13414 (2005).
  21. Jucker, F. M., Phillips, R. M., McCallum, S. A., Pardi, A. Role of a heterogeneous free state in the formation of a specific RNA-theophylline complex. Biochemistry. 42 (9), 2560-2567 (2003).
  22. Zhao, Q., Lv, Q., Wang, H. Aptamer fluorescence anisotropy sensors for adenosine triphosphate by comprehensive screening tetramethylrhodamine labeled nucleotides. Biosens Bioelectron. 70, 188-193 (2015).
  23. Zhang, D., et al. A sensitive fluorescence anisotropy method for detection of lead (II) ion by a G-quadruplex-inducible DNA aptamer. Anal Chim Acta. 812, 161-167 (2014).
  24. Elenko, M. P., Szostak, J. W., van Oijen, A. M. Single-molecule imaging of an in vitro-evolved RNA aptamer reveals homogeneous ligand binding kinetics. J Am Chem Soc. 131 (29), 9866-9867 (2009).
  25. Elenko, M. P., Szostak, J. W., van Oijen, A. M. Single-molecule binding experiments on long time scales. Rev Sci Instrum. 81 (8), 083705 (2010).
  26. Zichel, R., Chearwae, W., Pandey, G. S., Golding, B., Sauna, Z. E. Aptamers as a sensitive tool to detect subtle modifications in therapeutic proteins. PLoS One. 7 (2), 31948 (2012).
  27. Baaske, P., Wienken, C. J., Reineck, P., Duhr, S., Braun, D. Optical thermophoresis for quantifying the buffer dependence of aptamer binding. Angew Chem Int Ed Engl. 49 (12), 2238-2241 (2010).
  28. Entzian, C., Schubert, T. Studying small molecule-aptamer interactions using MicroScale Thermophoresis (MST). Methods. 97, 27-34 (2016).
  29. Valenzano, S., et al. Screening and Identification of DNA Aptamers to Tyramine Using in Vitro Selection and High-Throughput Sequencing. ACS Comb Sci. 18 (6), 302-313 (2016).
  30. Jauset Rubio, M., et al. beta-Conglutin dual aptamers binding distinct aptatopes. Anal Bioanal Chem. 408 (3), 875-884 (2016).
  31. Breitsprecher, D., et al. Aptamer Binding Studies Using MicroScale Thermophoresis. Methods Mol Biol. 1380, 99-111 (2016).
  32. Stoltenburg, R., Schubert, T., Strehlitz, B. In vitro Selection and Interaction Studies of a DNA Aptamer Targeting Protein A. PLoS One. 10 (7), 0134403 (2015).
  33. Kinghorn, A. B., et al. Aptamer Affinity Maturation by Resampling and Microarray Selection. Anal Chem. 88 (14), 6981-6985 (2016).
  34. Duhr, S., Braun, D. Why molecules move along a temperature gradient. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (52), 19678-19682 (2006).
  35. Braun, D., Libchaber, A. Trapping of DNA by thermophoretic depletion and convection. Phys Rev Lett. 89 (18), 188103 (2002).
  36. Duhr, S., Arduini, S., Braun, D. Thermophoresis of DNA determined by microfluidic fluorescence. Eur Phys J E Soft Matter. 15 (3), 277-286 (2004).
  37. Jerabek-Willemsen, M., Wienken, C. J., Braun, D., Baaske, P., Duhr, S. Molecular interaction studies using microscale thermophoresis. Assay Drug Dev Technol. 9 (4), 342-353 (2011).
  38. He, K., Dragnea, V., Bauer, C. E. Adenylate Charge Regulates Sensor Kinase CheS3 To Control Cyst Formation in Rhodospirillum centenum. MBio. 6 (3), 00546 (2015).
  39. Brvar, M., et al. Structure-based discovery of substituted 4,5'-bithiazoles as novel DNA gyrase inhibitors. J Med Chem. 55 (14), 6413-6426 (2012).
  40. Pogorelcnik, B., et al. 4,6-Substituted-1,3,5-triazin-2(1H)-ones as monocyclic catalytic inhibitors of human DNA topoisomerase IIalpha targeting the ATP binding site. Bioorg Med Chem. 23 (15), 4218-4229 (2015).
  41. Jhaveri, S., Rajendran, M., Ellington, A. D. In vitro selection of signaling aptamers. Nat Biotechnol. 18 (12), 1293-1297 (2000).
  42. Khavrutskii, L., et al. Protein purification-free method of binding affinity determination by microscale thermophoresis. J Vis Exp. (78), (2013).
  43. Ramakrishnan, M., et al. Probing cocaine-antibody interactions in buffer and human serum. PLoS One. 7 (7), 40518 (2012).
  44. Chen, M., et al. Antiviral activity and interaction mechanisms study of novel glucopyranoside derivatives. Bioorg Med Chem Lett. 25 (18), 3840-3844 (2015).
  45. Wan, C., et al. Insights into the molecular recognition of the granuphilin C2A domain with PI(4,5)P2. Chem Phys Lipids. 186 (4,5), 61-67 (2015).
  46. Harazi, A., et al. The Interaction of UDP-N-Acetylglucosamine 2-Epimerase/N-Acetylmannosamine Kinase (GNE) and Alpha-Actinin 2 Is Altered in GNE Myopathy M743T Mutant. Mol Neurobiol. , (2016).

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Biochimie No. 119 Petite interaction molécule-aptamère les paramètres de liaison MicroScale thermophorèse l'affinité la stoechiométrie la thermodynamique les acides nucléiques de liaison la cartographie du site de liaison
La cartographie du site de liaison d'un aptamère sur ATP utilisant MicroScale thermophorèse
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Entzian, C., Schubert, T. Mapping… More

Entzian, C., Schubert, T. Mapping the Binding Site of an Aptamer on ATP Using MicroScale Thermophoresis. J. Vis. Exp. (119), e55070, doi:10.3791/55070 (2017).

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