Introduction
L'interazione tra le molecole è la base della natura. Quindi, gli scienziati in molti campi della ricerca di base e applicata cercano di capire i principi fondamentali delle interazioni molecolari di diversi tipi. MicroScale termoforesi (MST) consente agli scienziati di effettuare il veloce, preciso, caratterizzazione economicamente efficiente e di qualità controllata delle interazioni molecolari in soluzione, con una scelta di buffer. Ci sono già più di 1.000 pubblicazioni utilizzando MST, a partire dal 2016 da solo, che descrive i diversi tipi di analisi, tra cui proiezioni di libreria, convalide di eventi, analisi della concorrenza, e gli esperimenti di legame con partner multipli vincolanti 1-8. In generale, MST consente lo studio dei parametri vincolanti classici, come affinità di legame (pM a mM), stechiometria e termodinamica, di qualsiasi tipo di interazione molecolare. Un grande vantaggio di MST è la capacità di studiare eventi di legame indipendenti dalla dimensione dei partner di interazione. anche Chalinterazioni lenging tra piccole aptameri di acidi nucleici (15-30 nt) e target, quali piccole molecole, farmaci, antibiotici, o metaboliti possono essere quantificati.
Le attuali tecnologie state-of-the-art di caratterizzare le interazioni aptamer bersaglio sono o laboratorio-intenso e molto complesso o non riescono a quantificare aptameri-piccola molecola Interazioni 9,10. Risonanza plasmonica di superficie (SPR) a base di test di 11,12 e approcci calorimetrica veramente libero-label, come Calorimetria isotermica di titolazione (ITC) 13-15, eluizione isocratica 16, equilibrio filtrazione 17,18, in linea di sondaggio 19, gel- spostare saggi, stopped- flusso fluorescenza spettroscopia 20,21, anisotropia di fluorescenza (FA) 22,23, singola molecola fluorescenza di imaging 24,25, e Bio-strato di interferometria (BLI) 26 siano anche imprecisi o incompatibile con la molecola aptameri-piccole interazioni. Altro Principal temi di questi metodi sono bassa sensibilità, elevato consumo di campione, l'immobilizzazione, limitazioni di trasporto di massa su superfici e / o limitazioni del buffer. Solo pochi di queste tecnologie forniscono controlli integrati per aggregazione e di adsorbimento effetti.
MST rappresenta un potente strumento per gli scienziati di superare questa limitazione per studiare le interazioni tra aptameri e piccole molecole 27-29, nonché altri obiettivi come le proteine 30-33. La tecnologia si basa sul movimento delle molecole attraverso gradienti di temperatura. Questo movimento diretto, chiamato "termoforesi," dipende dalle dimensioni, carica, e shell idratazione della molecola 34,35. Il legame di un ligando alla molecola modificherà direttamente almeno uno di questi parametri, con un conseguente mobilità thermophoretic cambiato. Ligandi con le piccole dimensioni non possono avere un notevole impatto in termini di cambio formato dal non associata alla stato legato, ma possono avere dr effetti Amatic sul guscio di idratazione e / o carica. I cambiamenti nel movimento delle molecole thermophoretic dopo interazioni con il partner legante consente la quantificazione dei parametri vincolanti di base 2,7,34,36,37.
Come illustrato in figura 1A, il dispositivo MST costituito da un laser a infrarossi focalizzato sul campione entro i capillari di vetro con la stessa ottica come per la rilevazione della fluorescenza. Il movimento thermophoretic delle proteine tramite fluorescenza intrinseca di triptofani 6 o di un 3,8 socio interazione fluorescente può essere monitorato mentre il laser stabilisce un gradiente di temperatura (DT di 2-6 ° C). La differenza di temperatura risultante nello spazio, DT, porta alla deplezione o accumulo di molecole nella zona di temperatura elevata, che può essere quantificato dal Soret coefficiente (S T):
g "/>
c rappresenta caldo la concentrazione nella regione riscaldata, ec freddo è la concentrazione nella regione fredda iniziale.
Come mostrato nella Figura 1B, un tipico esperimento MST ottiene un profilo di movimento MST (traccia temporale), costituito da diverse fasi, che possono essere separati dai rispettivi tempi. La fluorescenza iniziale è misurata nei primi 5 s in assenza del gradiente di temperatura per definire la precisione di fluorescenza iniziale e per controllare photobleaching o photoenhancement. Il salto di temperatura (T-Jump) rappresenta la fase in cui le variazioni di fluorescenza prima del movimento thermophoretic. Questa diminuzione iniziale della fluorescenza dipende da sbalzi termici-dipendente di fl uorophore resa quantica. La fase termoforesi segue, in cui diminuisce fluorescenza (o aumenta) dovuti al movimento thermophoretic delle molecole fino alla distribuzione dello stato stazionario viene raggiunto.Il tjump retromarcia e retrodiffusione concomitante di molecole fl uorescenti possono essere osservati come indicato in Figura 1B dopo il laser è spento. Per accedere ai parametri di base vincolanti, diversi rapporti molari dei partner di interazione sono analizzati e confrontati. Tipicamente, 16 differenti rapporti sono studiati in un esperimento MST, considerando che la molecola visibile ottica viene mantenuta costante ed è fornita con una quantità crescente di ligando non marcato. L'interazione tra i due partner di legame induce cambiamenti nella termoforesi, e quindi nella fluorescenza normalizzato, F norma, che viene calcolato come segue:
F calda e fredda F rappresentano una media di fl intensità fluorescenza a de fi nite momenti delle tracce MST. Affinità di legame (K D o valori di EC 50) possono essere calcolati curve montaggio (Figura 1C).
Nel complesso, MST è un potente strumento per studiare le interazioni molecolari di qualsiasi tipo. Questo manoscritto offre un protocollo per caratterizzare l'interazione sfida tra la piccola molecola di adenosina trifosfato (ATP; 0,5 kDa) e il 25-nt breve ssDNA aptameri DH25.42 (7,9 kDa). Nel corso del manoscritto, il sito di legame del aptamer sulla molecola ATP viene mappato verso il gruppo adenina dell'ATP.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Preparazione del lavoro Aptamero l'Archivio
- Seguire le istruzioni del produttore e sciogliere il oligonucleotide (5-Cy5-CCTG GGGGAGTATTGCGGAGGAAGG-3, la sequenza di riferimento 18) in acqua, raggiungendo una concentrazione finale di 100 micron.
- Preparare la soluzione aptameri di lavoro diluendo lo stock oligonucleotide a 200 Nm con tampone assorbente (20 mM Tris, pH 7,6; 300 mM NaCl, 5 mM MgCl 2; 0,01% Tween20).
- Incubare la miscela per 2 minuti a 90 ° C, lasciate raffreddare il campione immediatamente sul ghiaccio, e utilizzare il campione a temperatura ambiente.
2. Preparazione del Ligand diluizione Series
- Per ogni ligando (adenosina trifosfato (ATP), adenosina difosfato (ADP), adenosina monofosfato (AMP), adenina, guanosintrifosfato (GTP), citosintrifosfato (CTP), deossiadenosina trifosfato (dATP), e S-adenosilmetionina (SAM) ; 10 mM magazzino ciascuno), preparare un diluti di serie 16-stepsu in 200 provette micro microlitri.
NOTA: centrifugazione delle scorte ligando per 5 minuti a 14000 g può aiutare a rimuovere gli aggregati. Basso volume, si raccomanda provette vincolante basso per evitare l'assorbimento delle molecole alle pareti del tubo. - Iniziare con una concentrazione massima di almeno 50 volte superiore all'affinità stimata e ridurre la concentrazione del ligando del 50% in ogni fase di diluizione.
NOTA: Lo strumento concentrazione finder implementato nel software di controllo simula dati vincolanti e aiuta a trovare l'intervallo di concentrazione giusta per la serie di diluizioni. - Riempire 20 ml di legante magazzino (10 mm) in tubo 1. Aggiungere 10 ml di tampone di legame aptameri in tubi di reazione micro 2-16.
- Trasferimento 10 ml di tubo da 1 a tubo 2 e miscelare correttamente pipettando su e giù parecchie volte. Trasferire 10 microlitri al tubo successivo e ripetere questa diluizione per i rimanenti tubi.
- Eliminare l'eccesso di 10 ml dall'ultima provetta. Evitare qualsiasi Beffetti diluitivi Uffer. Il tampone nella provetta 1 e in tubi 2-16 deve essere identica.
3. Preparazione della miscela di reazione finale
- Preparare le singole reazioni di legame con un volume di 20 microlitri (10 ml di soluzione di lavoro aptamer + 10 ml di rispettiva diluizione ligando) per minimizzare errori di pipettamento. Un volume di soli 4 microlitri è suf fi ciente per il riempimento capillare.
- Aggiungere 10 ml di soluzione di lavoro 200 nM aptameri a 10 microlitri di ogni diluizione ligando e miscelare correttamente pipettando su e giù diverse volte.
- Incubare i campioni per 5 min a temperatura ambiente e riempire i campioni nei capillari standard, immergendo i capillari nel campione. tempi di incubazione più lunghi possono essere necessari per alcune interazioni; Tuttavia, 5 min è adeguato per la maggior parte. Selezionare i capillari solo sui lati, NON sulla parte centrale, dove viene effettuata la misurazione ottica.
- Posizionare i capillari si aVassoio capillare e ed avviare il dispositivo MST.
4. Avvio del dispositivo MST
NOTA: Il dispositivo fornisce due pacchetti software preinstallati, l ' "software per la messa a punto tecnica delle condizioni sperimentali e il controllo' 'analisi"' software per l'interpretazione dei dati prodotti.
- Prima di effettuare il vassoio capillare nel dispositivo MST, avviare il software di controllo e regolare la temperatura complessiva desiderata selezionando '' attivare il controllo manuale della temperatura "del '' controllo della temperatura" menu a discesa. Regolare la temperatura a 25 ° C in questo modo.
NOTA: Gli strumenti MST possono essere a temperatura controllati attraverso 22 a 45 ° C. - Attendere che la temperatura per raggiungere il livello previsto e quindi inserire il vassoio capillare nel dispositivo MST.
- Impostare il canale LED per '' rosso "per le tinture Cy5 e regolare la potenza del LED per ottenere un fl uorescence segnale 300 a 1000 unità di fluorescenza del dispositivo MST con un sensore standard. potere LED 25% è utilizzato in questo studio.
NOTA: 6.000 a 18.000 unità di fluorescenza sono raccomandati per il MST con un sensore ad alta sensibilità.
5. capillare Scan
- Effettuare una scansione capillare per controllare diversi aspetti di qualità del campione, scegliendo la posizione capillare sul software "di controllo" e cliccando su "avviare la scansione cap" prima della misurazione MST.
- Ispezionare la scansione capillare per la fluorescenza valorizzazione / tempra e gli effetti che attaccano (a forma di U o appiattita picchi) nel software.
NOTA: Maggiori dettagli sul rilevamento e la gestione della fluorescenza e gli effetti che attaccano possono essere trovati nella discussione.
6. Misura MST
NOTA: Prima di iniziare la misura MST, assicurarsi di escludere attaccare effetti, valorizzazione / effetti tempra, oerrori di pipettamento, e garantire che la scansione capillare indica che il segnale fluorescenza è suf fi ciente. Per maggiori dettagli, vedere la discussione.
- Assegnare le concentrazioni di ligando della serie di diluizione alla rispettiva posizione capillare nel software '' di controllo "consideri la fase di diluizione della miscelazione del aptamer e ligando. (1: 1).
- Inserisci la più alta concentrazione di ligando (5 mm) per capillare # 1, selezionare il tipo di diluizione corretto (qui, 1: 1), cliccare sulla massima concentrazione, e utilizzare la funzione di trascinamento per assegnare automaticamente le restanti concentrazioni in capillari # 2 16. La concentrazione più bassa è 152,6 nM.
- Inserire la concentrazione del aptamer uorescenti fl (qui, 100 nM) nella rispettiva sezione del software di controllo.
- Utilizzare le impostazioni predefinite, che rilevano la fluorescenza fl per 5 secondi, registrare il MST per 30 secondi, e registrare la fluorescenza per altri 5 secondi dopo l'inattivazione del t laser o monitorare la diffusione posteriore delle molecole.
- Regolare la potenza del laser al 20% nella rispettiva sezione del software di controllo.
NOTA: per ricevere il miglior rapporto segnale-rumore e per evitare effetti non specifici, si consiglia una potenza laser di 20-40%. In casi specifici, una potenza del laser più elevato può essere richiesto per ottenere una buona separazione delle molecole non legati e legati. - Salvare l'esperimento dopo aver selezionato la cartella di destinazione e avviare la misura MST premendo il pulsante '' misura di inizio MST ".
NOTA: Il file .ntp verrà generato nella cartella di destinazione. Usando questa configurazione, una misurazione dura 10-15 minuti. - Ripetere la procedura sperimentale almeno due volte per una determinazione più accurata del valore EC 50.
NOTA: Al fine di testare la riproducibilità tecnica, gli stessi capillari possono essere acquisiti più volte (ripete tecnici).
7. Analisi dei dati MST
nt "> NOTA: Il software di analisi permette l'analisi dei dati sul fl y durante la misurazione Il software di analisi traccia le tracce del tempo MST e dei cambiamenti nel normalizzato fluorescenza (F norma) contro la concentrazione del ligando 37..- Avviare il software di analisi MST (Analisi MO.Affinity) e caricare il file .ntp dalla cartella di destinazione. Selezionare "MST" come tipo di analisi nel menu di selezione dei dati.
NOTA: Nel caso di effetti di fluorescenza ligando-dipendente, la fluorescenza iniziale può essere scelto per l'analisi. - Aggiungere la rispettiva corsa (s) tecnico o biologico per una nuova analisi con il drag-and-drop o premendo il tasto "+" al di sotto del rispettivo periodo sperimentale.
- Premere il pulsante di informazioni al di sotto del rispettivo periodo di sperimentazione per ottenere informazioni sulle proprietà di questo esperimento, tracce MST, scansione capillare, forma capillare, fluorescenza iniziale e tasso di sbiancamento.
NOTA: I dati grezzi possono alcosì da ispezionare in fasi successive dell'analisi. - Visivamente le tracce MST per l'aggregazione e la precipitazione effetti, visibile come urti e picchi.
NOTA: Per ulteriori informazioni sul rilevamento e la gestione degli effetti di aggregazione, leggere la discussione. - Ispezionare visivamente la scansione capillare e la capillare forma di sovrapposizione per gli effetti di adsorbimento, visibile come picchi o appiattite a forma di U. Ispezionare visivamente la scansione capillare e la fluorescenza iniziale per gli effetti di fluorescenza. Ispezionare visivamente il tasso sbiancante per photobleaching effetti.
- Passare alla modalità dose-risposta e modificare l'impostazione di analisi in modalità "esperto" premendo il tasto corrispondente. Selezionare "T-Jump", come la strategia di valutazione MST.
- Selezionare il modello di "Hill" per la curva fi tting. saranno automaticamente calcolati i parametri vincolanti. Normalizzare i dati scegliendo il rispettivo tipo di normalizzazione nel menu "confrontare i risultati". esportare ili dati sia come un file .xls o .pdf.
Nota: La tabella sotto il grafico legame riassume i parametri vincolanti calcolati.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
In questo studio, MST è stato applicato per caratterizzare il sito di legame del DNA aptamer DH25.42 18 ATP. A differenza di altri studi che caratterizzano l'interazione di ATP o ATP-mimando piccole molecole con proteine marcate casualmente con uno o più fluorofori 38-40, questo studio include una etichetta versione del aptamer 7,9 kDa ssDNA con una molecola Cy5 sull'estremità 5' . Diversi derivati ATP e molecole correlate, che differiscono da ATP in varie posizioni, sono stati utilizzati per mappare il sito di legame della molecola di ATP. Serie di diluizioni (in 16 passi, riducendo la concentrazione di ligando del 50% ciascuno) dei diversi ligandi sono stati preparati e mescolato con una quantità costante di aptamer Cy5 marcato. I campioni sono stati analizzati in capillari standard con LED 25% e la potenza del laser 20%. profili di movimento (MST tracce tempo) sono state registrate e unità di fluorescenza, derivate dalla fase di T-Jump, sono stati tracciati rispetto al Conc ligandozione (confrontare Figura 1C). Montaggio di curva è stata effettuata applicando l'equazione Hill, con conseguente valori di EC 50. In 5 ripetizioni indipendenti biologici (4 operatori diversi, 2 titoli aptamer differenti, 2 titoli ATP differenti), l'interazione ATP-aptamero mostra un'ampiezza vincolante negativo di 6 a 13 unità e un valore medio CE 50 del 52,3 ± 5,0 micron (Figura 2A ). Le barre di errore nei grafici vincolanti e "±" presentato nei dati di affinità rappresentano la deviazione standard di 5 ripetizioni biologici (5 misurazioni indipendenti in un capillare diverso). Affinità precedentemente riportati per l'interazione del aptamer DH25.42 con [2,8,5'- 3 H] -adenosine e agarosio ATP erano comparabili. L'interazione di adenosina radiomarcato con l'aptamero è stato quantificato mediante saggio filtro centrifugo, e un'affinità (K d) di 6 ± 3 mM è stato determinato. esperimenti eluizione isocratica con Immobil ATPzata a agarosio comportato un affinità (K d), del 13 micron 18,41.
Per un miglior confronto side-by-side, i dati possono essere normalizzati alla frazione di molecole complessati (frazione legata, FB) mediante la seguente equazione: 
dove il valore (c) è il valore MST misurato per la concentrazione c, libero è il valore MST per lo stato non legato (concentrazione più bassa), e complessato è il valore MST per lo stato pienamente legata (Figura 2B). Questa normalizzazione è ideale per confrontare i risultati di differenti ligandi in un grafico, come mostrato nella Figura 2C. Le nità rilevati af fi di ADP (63,6 ± 5,9 micron di duplicati biologici), AMP (91.6 ± 9.1 micron di duplicati biologici) e Sam (44.4 ± 3.2 micron di duplicati biologici), che differiscono da ATP nel number di gruppi fosfato, implica che questa posizione non ha, o solo debolmente L'influenza sul comportamento vincolante del aptamer (Figura 2C e D). Il gruppo OH al carbonio C2 del ribosio di ATP potrebbe anche essere escluso dall'essere il principale sito di legame, come dATP era legato anche dal aptamero con un po 'ridotta nità fi af (64,4 ± 6,1 micron di duplicati biologici). Modifica del gruppo purine di ATP al gruppo pirimidina CTP comportato non vincolante del aptamer, dimostrando l'importanza di questo gruppo per l'interazione. L'aptamero legato ad adenina con un'affinità di 141,7 ± 9,4 mM (in duplicati biologici), mostrando che il sito di legame deve essere in questa parte della molecola ATP. Le molecole purinici GTP e ATP differiscono nella zona ombreggiata verde rappresentato nella figura 2D, che rappresenta il principale sito di legame del aptamer ATP. Un altro studio ha utilizzato esperimenti di eluizione non quantitativi con diversi derivati ATPeluire un aptamero radioattivo da ATP agarosio, che ha mostrato risultati comparabili a questo studio MST 18.
Figura 1: MicroScale termoforesi. (A) viene visualizzata la configurazione tecnica della tecnologia MST. Le ottiche concentrano sul centro di capillari di vetro, rilevando così il segnale di fluorescenza della molecola otticamente visibile. Un laser IR viene utilizzato per stabilire un gradiente di temperatura nella finestra di osservazione del sistema ottico. Le variazioni nella fluorescenza possono essere utilizzati per monitorare il movimento thermophoretic delle molecole in soluzione (B) MST tempo traccia movimento pro fi di molecole in un gradiente di temperatura. La fluorescenza iniziale è misurata per 5 secondi mentre il laser è spento. Accensione del laser genera un gradiente di temperatura. Dopo l'immediato T-Jump phase, in cui il colorante uorescente fl diminuisce il suo rendimento segnale dopo induzione di calore, il movimento thermophoretic avviene e si osserva per 30 sec. Dopo che il laser è spento, le molecole diffondono indietro. (C) i risultati di un tipico esperimento MST: (a sinistra) 16 capillari contenenti la stessa concentrazione di molecola fluorescente e una crescente concentrazione del legante senza etichetta; le tracce del tempo MST sono registrati e normalizzati per loro fluorescenza iniziale. (A destra) La fluorescenza normalizzato; la differenza tra F fredda e calda F è tracciata contro la concentrazione del ligando. Una misura della curva di questi rendimenti dati parametri, come ad esempio l'infinito AF vincolante vincolanti. Ristampa con il permesso di Elsevier, Metodi 28; numero di licenza 3890230800113. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2: MST analisi dei dati. (A) La linea di base corretto fl normalizzato fluorescenza Af norma (‰), derivato dal segnale MST tjump, viene tracciata contro la concentrazione di ATP (in micron). L'equazione di Hill (CE 50) è stato applicato per curve fitting. Le barre di errore rappresentano la deviazione standard da cinque ripete biologici. (B) trama Frazione-bound dei dati riportati in A. I rispettivi insiemi di dati sono stati normalizzati per la frazione legata, e la media di questi dati normalizzati è presentato nel grafico vincolante. Le barre di errore indicano la deviazione standard di 5 ripetizioni biologici. (C) Il grafico frazione legata mostra un confronto quantitativo (Hill fit) dei diversi ligandi al aptamer. Le barre di errore rappresentano la devia di seriezione di due ripetizioni biologici. (D) rilegatura nità fi AF (CE 50) di differenti ligandi al aptamer. L'area ombreggiata verde indica il sito di legame della aptamer sul gruppo adenina di ATP. Questa cifra viene modificato da Elsevier, Metodi 28; numero di licenza 3890230800113. I set di dati dello studio precedente vengono rianalizzati ed espanse in questo studio. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3: ottimizzazione del dosaggio per gli esperimenti MST. (A) adsorbimento Proteine e effetti sporgenti possono essere rilevati nella scansione capillare. forma dei picchi irregolari, come picchi appiattite o ad U, indicano l'incollaggio del materiale del campione alla superficie del vetro. Cappeso il tipo capillare (Standard, Premium, o idrofobica) può prevenire l'assorbimento molecola, con un conseguente forma regolare picco. (B) Le tracce del tempo MST servono anche come controllo di qualità, dal momento che gli aggregati possono essere rilevati anche lì urti e picchi. Le condizioni sperimentali possono essere ottimizzate migliorando la solubilità delle molecole (ad esempio, compresi detergenti tipo Pluronic F-127 o diversi valori di pH o concentrazione salina). La centrifugazione può aiutare a rimuovere gli aggregati più grandi. Per garantire una qualità ottimale dei dati, le tracce del tempo MST dovrebbe assomigliare l'esempio dato. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Controlli di qualità:
Aspecifico sticking / adsorbimento di materiale campione a superfici, così come gli effetti di aggregazione, hanno una influenza notevole sulla qualità dei dati di affinità. Tuttavia, solo un paio di tecnologie state-of-the-art offrono opzioni precise e rapide per monitorare ed evitare questi effetti. MST offre controlli di qualità integrati che consentono di rilevare e aiutano a superare questi problemi, consentendo l'ottimizzazione graduale della configurazione tecnica. Informazioni importanti sui attaccare e fluorescenza effetti può essere estratto dalla scansione capillare e la forma capillare (punti 5.2 e 7.5), mentre l'aggregazione / effetti delle precipitazioni (passo 7.7) possono essere monitorati nei profili di movimento. Questi controlli consentono per il costante miglioramento della qualità dei dati e rappresentano passaggi critici nel protocollo.
Rilevazione degli effetti di adsorbimento e la risoluzione dei problemi:
La scansione capillare è principalmente condotta come inipasso ziale per determinare la posizione dei capillari sul supporto vassoio scansione fluorescenza su di esso. Ogni picco rappresenta un capillare, che indica il punto di partenza per la misurazione MST. Controllo visivo della forma del picco consente di determinare l'adsorbimento di molecole alla superficie del vetro, che è un controllo di qualità essenziale che deve essere eseguita prima di iniziare l'esperimento MST. La sovrapposizione di figura capillare permette una facile individuazione di appiattite, forma dei picchi sconnesse, o addirittura di picchi che assomigliano a forma U, indicando l'adsorbimento / incollaggio delle molecole alla superficie di vetro interna del capillare (Figura 3A, pannello superiore). Diversamente rivestito tipi capillari (Standard, Premium, e idrofobico) contribuiscono a garantire la solubilità e assorbimento minimo delle molecole ai capillari. Capillari dovrebbero essere testati per la loro idoneità prima degli esperimenti di legame. Detergenti, come Tween (0,005-,1%) o F127 Pluronic (0,01-0,1%) may prevenire anche gli effetti di adsorbimento non specifici. Ottimizzazione in questa fase dell'esperimento è essenziale per l'alta qualità dei dati (confrontare Figura 3A, pannello inferiore).
Rilevazione degli effetti di fluorescenza e la risoluzione dei problemi:
Le variazioni di altezza del picco dei capillari digitalizzati offrono un ulteriore livello di informazioni sulle caratteristiche del campione. differenze casuali in capillare di fluorescenza possono, da un lato, essere causa di pipettaggio errori o, invece, provengono da grandi aggregati di esempio nella zona di scansione che possono aumentare la fluorescenza drasticamente. Alta precisione di pipettaggio è obbligatoria per evitare gli effetti di diluizione. Miscelazione tutte le soluzioni pipettando su e giù aumenta ulteriormente la precisione. Inoltre, è essenziale per mantenere il buffer costante in ogni capillare. Strategie per gestire gli effetti di aggregazione sono presentati in un successivo paragrafo.
cambiamenti sistemici di fluorescenza con Increacantare concentrazione ligando spesso indicare ligando dipendente effetti di spegnimento / valorizzazione. Il "Test SD" viene effettuata al fine di discriminare cambiamenti legame indotto fluorescenza da perdita di fluorescenza aspecifica; Questo test controlla intensità di fluorescenza in condizioni denaturanti. In caso di effetti fluorescenza ligando-dipendente, le intensità di fluorescenza, in condizioni di denaturazione devono essere identici, indipendente dalla concentrazione di titolante. Se la differenza di intensità di fluorescenza è ancora presente in queste condizioni, il materiale era o perso a causa di adsorbimento non specifico alle pareti del tubo o per aggregazione e successiva centrifugazione.
Per eseguire il test SD, 10 pl del primo e 10 ml di ultima fase di diluizione ligando sono tutte accuratamente trasferiti in una nuova provetta contenente 10 ml di una 2x SD Mix (4% SDS e 40 mM DTT). I campioni sono miscelati e le molecole sono denaturati per 5 minuti a 95 ° C. after riempiendo i campioni nei capillari, le intensità di fluorescenza vengono misurati. Se viene rilevato un effetto di fluorescenza ligando-dipendente, i dati possono essere analizzati direttamente le informazioni di associazione dedotto dalle variazioni di intensità di fluorescenza.
Rilevazione degli effetti di aggregazione e la risoluzione dei problemi:
Irregolare, irregolari tracce tempo MST indicano aggregazione e / o precipitazione effetti (Figura 3B, pannello superiore). Materiale del campione non aggregati mostra un profilo pulito e liscio thermophoretic movimento (Figura 3B, pannello inferiore). La centrifugazione del campione di materiale prima dell'uso (5-10 min a 14.000 xg), l'aggiunta di detergenti (0,005-0,1% Tween-20, 0,01-0,1% Pluronic F-127, o simili), l'uso di BSA ( > 0,5 mg / ml), o la modifica delle condizioni di tampone (pH e forza ionica) sono raccomandati per minimizzare gli effetti di aggregazione e di ottimizzare la qualità dei dati. Al fine di ottenere dati di alta qualità,è essenziale per minimizzare gli effetti di aggregazione.
Analisi dei dati e curve fitting:
Un profilo di movimento thermophoretic è diviso in diverse fasi, ispezionabili separatamente o contemporaneamente. Il T-Jump descrive l'improvviso cambiamento del rendimento di fluorescenza su variazione di temperatura, che rappresenta una caratteristica intrinseca di fluorofori. Diretto obbligatorio in immediate vicinanze del fluoroforo o conformazione modifiche in fase di legame altamente influenzano il T-Jump. Il termoforesi lento si riferisce al movimento delle molecole nel campo di temperatura, offrendo informazioni sulla struttura globale del complesso formato. Il tipo predefinito di analisi dei dati utilizza l'impostazione "termoforesi + T-Jump", sfruttando entrambi i fenomeni per determinare i parametri vincolanti. Nel caso in cui le due fasi hanno direzioni opposte, si raccomanda di analizzare le fasi separatamente. Si prega di notare che il tempo gli effetti e le diverse specie di MolecORME potrebbe portare a differenze di affinità della termoforesi e T-Jump. Un altro tipo di opzione analisi è l'impostazione manuale, che permette la ricerca di regioni specifiche del profilo di movimento. I disturbi dovuti all'aggregazione o convezione possono essere esclusi in questo modo. Al fine di migliorare la qualità dei dati, i cursori possono essere impostati prima dei segnali di aggregazione. Esaminando l'inizio termoforesi comunemente produce dati con meno rumore, dal momento che la convezione è un processo che richiede tempo-dipendente. Questa impostazione manuale precoce è altamente raccomandato per esperimenti con potenza laser ad alta (80%). Su scegliendo l'impostazione analisi dei dati, due modelli di montaggio integrati nel software di analisi possono essere applicati per adattarsi alla curva vincolante. La funzione di misura per la K D dalla legge di azione di massa è adatto per 1: 1 modalità di legame o per il legame più siti che hanno la stessa affinità. La concentrazione indipendente costante di dissociazione K d descrive l'equilibrio tra la bouND e stato libero; pertanto, l'affinità di un sito di legame per un ligando viene misurato. Il CE 50 valore di concentrazione-dipendente derivato dall'equazione Hill rappresenta la dose efficace di un ligando al quale metà delle molecole marcate sono nello stato legato. L'adattamento Hill dovrebbe essere applicata a modelli polivalenti vincolanti, soprattutto se sono cooperativa.
I controlli di qualità integrati rappresentano un grande vantaggio di MST su tecnologie come SPR o ITC. Questi controlli consentono per l'ottimizzazione facile e veloce la configurazione tecnica per garantire una qualità ottimale dei dati. Oltre alle misure di tempo-efficiente (K D in 15 min) e la messa a punto senza immobilizzazione, MST offre la libera scelta di buffer, consentendo la valutazione delle interazioni molecolari, anche nei lisati e sieri 5,42,43. A causa del fatto che termoforesi molecolare dipende dalle dimensioni, carica, e shell idratazione delle molecole, non ci sono limitazioninella dimensione dei partner di interazione misurati durante misurazioni MST. La gamma dinamica af fi nità, da PM a mM, unitamente al basso consumo di campione, completa i punti di forza della tecnologia MST. Vale la pena ricordare che MST genera dati precisi sui parametri di base vincolanti, come affinità di legame, stechiometria, e la termodinamica. Tuttavia, MST non consente la misurazione di k on e off k tassi. Inoltre, si deve considerare che, per maggior parte degli esperimenti MST, una modifica fluorescenza deve essere aggiunto uno dei partner di interazione. I dati generati sono in buon accordo con state-of-the-art tecnologie, come SPR e ITC 32,43-46. Tuttavia, questi dati sono qualità controllata, gli esperimenti sono più veloci e consumano meno materiale. Nel complesso, MST rappresenta un potente ortogonali tecnologia per le tecnologie state-of-the-art, con alcuni vantaggi aggiuntivi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
CE e TS sono dipendenti di 2bind GmbH, che fornisce servizi di analisi biofisici. spese di pubblicazione di questo video-articolo sono pagati dal 2bind GmbH.
Acknowledgments
Gli autori non hanno riconoscimenti.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aptamer binding buffer | 20 mM Tris pH 7.6; 300 mM NaCl; 5 mM MgCl2; 0.01% Tween-20 | ||
| Fluorescently labeled ATP aptamer | IDT, Leuven, Belgium | sequence: DH25.42 50-Cy5-CCTGGGGGAGT- ATTGCGGAGGAAGG-3 |
|
| ATP | Sigma Aldrich, Germany | A2383 | 10 mM stock solutions stored at - 20 °C |
| ADP | Sigma Aldrich, Germany | A2754 | 10 mM stock solutions stored at - 20 °C |
| AMP | Sigma Aldrich, Germany | A2252 | 10 mM stock solutions stored at - 20 °C |
| Adenine | Sigma Aldrich, Germany | A8626 | 10 mM stock solutions stored at - 20 °C |
| SAM | Sigma Aldrich, Germany | A7007 | 10 mM stock solutions stored at - 20 °C |
| dATP | Sigma Aldrich, Germany | 11934511001 | 10 mM stock solutions stored at - 20 °C |
| CTP | Sigma Aldrich, Germany | C1506 | 10 mM stock solutions stored at - 20 °C |
| GTP | Sigma Aldrich, Germany | G8877 | 10 mM stock solutions stored at - 20 °C |
| Monolith NT.115 | NanoTemper Technologies, Munich, Germany | MO-G008 | Blue/Red Channel MST device with standard detector, Monolith NT115 pico is MST device with high sensitivity detector |
| Monolith NT.115 capillaries Standard | NanoTemper Technologies, Munich, Germany | MO-K002 | |
| Eppendorf PCR tubes | Eppendorf, Germany | 30124537 | |
| Monolith control software. 2.1.33, pre-installed on the device | NanoTemper Technologies, Munich, Germany | ||
| MO.affinity analysis v2.1.1 | NanoTemper Technologies, Munich, Germany | ||
| Kaleidagraph 4.5.2 | Synergy Software |
References
- Linke, P., et al. An Automated Microscale Thermophoresis Screening Approach for Fragment-Based Lead Discovery. J Biomol Screen. 21 (4), 414-421 (2015).
- Jerabek-Willemsen, M., et al. MicroScale Thermophoresis: Interaction analysis and beyond. Journal of Molecular Structure. 1077, 101-113 (2014).
- Zillner, K., et al. Microscale thermophoresis as a sensitive method to quantify protein: nucleic acid interactions in solution. Methods Mol Biol. 815, 241-252 (2012).
- Zhang, W., Duhr, S., Baaske, P., Laue, E. Microscale thermophoresis for the assessment of nuclear protein-binding affinities. Methods Mol Biol. 1094, 269-276 (2014).
- Wienken, C. J., Baaske, P., Rothbauer, U., Braun, D., Duhr, S. Protein-binding assays in biological liquids using microscale thermophoresis. Nat Commun. 1, 100 (2010).
- Seidel, S. A., et al. Label-free microscale thermophoresis discriminates sites and affinity of protein-ligand binding. Angew Chem Int Ed Engl. 51 (42), 10656-10659 (2012).
- Seidel, S. A., et al. Microscale thermophoresis quantifies biomolecular interactions under previously challenging conditions. Methods. 59 (3), 301-315 (2013).
- Schubert, T., et al. Df31 protein and snoRNAs maintain accessible higher-order structures of chromatin. Mol Cell. 48 (3), 434-444 (2012).
- McKeague, M., Derosa, M. C. Challenges and opportunities for small molecule aptamer development. J Nucleic Acids. 2012, 748913 (2012).
- Ruscito, A., DeRosa, M. C. Small-Molecule Binding Aptamers: Selection Strategies, Characterization, and Applications. Front Chem. 4, 14 (2016).
- Chang, A. L., McKeague, M., Liang, J. C., Smolke, C. D. Kinetic and equilibrium binding characterization of aptamers to small molecules using a label-free, sensitive, and scalable platform. Anal Chem. 86 (7), 3273-3278 (2014).
- Chang, A. L., McKeague, M., Smolke, C. D. Facile characterization of aptamer kinetic and equilibrium binding properties using surface plasmon resonance. Methods Enzymol. 549, 451-466 (2014).
- Jing, M., Bowser, M. T. Methods for measuring aptamer-protein equilibria: a review. Anal Chim Acta. 686 (1-2), 9-18 (2011).
- Sokoloski, J. E., Dombrowski, S. E., Bevilacqua, P. C. Thermodynamics of ligand binding to a heterogeneous RNA population in the malachite green aptamer. Biochemistry. 51 (1), 565-572 (2012).
- Burnouf, D., et al. kinITC: a new method for obtaining joint thermodynamic and kinetic data by isothermal titration calorimetry. J Am Chem Soc. 134 (1), 559-565 (2012).
- Mannironi, C., Scerch, C., Fruscoloni, P., Tocchini-Valentini, G. P. Molecular recognition of amino acids by RNA aptamers: the evolution into an L-tyrosine binder of a dopamine-binding RNA motif. RNA. 6 (4), 520-527 (2000).
- Jenison, R. D., Gill, S. C., Pardi, A., Polisky, B. High-resolution molecular discrimination by RNA. Science. 263 (5152), 1425-1429 (1994).
- Huizenga, D. E., Szostak, J. W. A DNA aptamer that binds adenosine and ATP. Biochemistry. 34 (2), 656-665 (1995).
- Lee, E. R., Baker, J. L., Weinberg, Z., Sudarsan, N., Breaker, R. R. An allosteric self-splicing ribozyme triggered by a bacterial second messenger. Science. 329 (5993), 845-848 (2010).
- Wickiser, J. K., Cheah, M. T., Breaker, R. R., Crothers, D. M. The kinetics of ligand binding by an adenine-sensing riboswitch. Biochemistry. 44 (40), 13404-13414 (2005).
- Jucker, F. M., Phillips, R. M., McCallum, S. A., Pardi, A. Role of a heterogeneous free state in the formation of a specific RNA-theophylline complex. Biochemistry. 42 (9), 2560-2567 (2003).
- Zhao, Q., Lv, Q., Wang, H. Aptamer fluorescence anisotropy sensors for adenosine triphosphate by comprehensive screening tetramethylrhodamine labeled nucleotides. Biosens Bioelectron. 70, 188-193 (2015).
- Zhang, D., et al. A sensitive fluorescence anisotropy method for detection of lead (II) ion by a G-quadruplex-inducible DNA aptamer. Anal Chim Acta. 812, 161-167 (2014).
- Elenko, M. P., Szostak, J. W., van Oijen, A. M. Single-molecule imaging of an in vitro-evolved RNA aptamer reveals homogeneous ligand binding kinetics. J Am Chem Soc. 131 (29), 9866-9867 (2009).
- Elenko, M. P., Szostak, J. W., van Oijen, A. M. Single-molecule binding experiments on long time scales. Rev Sci Instrum. 81 (8), 083705 (2010).
- Zichel, R., Chearwae, W., Pandey, G. S., Golding, B., Sauna, Z. E. Aptamers as a sensitive tool to detect subtle modifications in therapeutic proteins. PLoS One. 7 (2), 31948 (2012).
- Baaske, P., Wienken, C. J., Reineck, P., Duhr, S., Braun, D. Optical thermophoresis for quantifying the buffer dependence of aptamer binding. Angew Chem Int Ed Engl. 49 (12), 2238-2241 (2010).
- Entzian, C., Schubert, T. Studying small molecule-aptamer interactions using MicroScale Thermophoresis (MST). Methods. 97, 27-34 (2016).
- Valenzano, S., et al. Screening and Identification of DNA Aptamers to Tyramine Using in Vitro Selection and High-Throughput Sequencing. ACS Comb Sci. 18 (6), 302-313 (2016).
- Jauset Rubio, M., et al. beta-Conglutin dual aptamers binding distinct aptatopes. Anal Bioanal Chem. 408 (3), 875-884 (2016).
- Breitsprecher, D., et al. Aptamer Binding Studies Using MicroScale Thermophoresis. Methods Mol Biol. 1380, 99-111 (2016).
- Stoltenburg, R., Schubert, T., Strehlitz, B. In vitro Selection and Interaction Studies of a DNA Aptamer Targeting Protein A. PLoS One. 10 (7), 0134403 (2015).
- Kinghorn, A. B., et al. Aptamer Affinity Maturation by Resampling and Microarray Selection. Anal Chem. 88 (14), 6981-6985 (2016).
- Duhr, S., Braun, D. Why molecules move along a temperature gradient. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (52), 19678-19682 (2006).
- Braun, D., Libchaber, A. Trapping of DNA by thermophoretic depletion and convection. Phys Rev Lett. 89 (18), 188103 (2002).
- Duhr, S., Arduini, S., Braun, D. Thermophoresis of DNA determined by microfluidic fluorescence. Eur Phys J E Soft Matter. 15 (3), 277-286 (2004).
- Jerabek-Willemsen, M., Wienken, C. J., Braun, D., Baaske, P., Duhr, S. Molecular interaction studies using microscale thermophoresis. Assay Drug Dev Technol. 9 (4), 342-353 (2011).
- He, K., Dragnea, V., Bauer, C. E. Adenylate Charge Regulates Sensor Kinase CheS3 To Control Cyst Formation in Rhodospirillum centenum. MBio. 6 (3), 00546 (2015).
- Brvar, M., et al. Structure-based discovery of substituted 4,5'-bithiazoles as novel DNA gyrase inhibitors. J Med Chem. 55 (14), 6413-6426 (2012).
- Pogorelcnik, B., et al. 4,6-Substituted-1,3,5-triazin-2(1H)-ones as monocyclic catalytic inhibitors of human DNA topoisomerase IIalpha targeting the ATP binding site. Bioorg Med Chem. 23 (15), 4218-4229 (2015).
- Jhaveri, S., Rajendran, M., Ellington, A. D. In vitro selection of signaling aptamers. Nat Biotechnol. 18 (12), 1293-1297 (2000).
- Khavrutskii, L., et al. Protein purification-free method of binding affinity determination by microscale thermophoresis. J Vis Exp. (78), (2013).
- Ramakrishnan, M., et al. Probing cocaine-antibody interactions in buffer and human serum. PLoS One. 7 (7), 40518 (2012).
- Chen, M., et al. Antiviral activity and interaction mechanisms study of novel glucopyranoside derivatives. Bioorg Med Chem Lett. 25 (18), 3840-3844 (2015).
- Wan, C., et al. Insights into the molecular recognition of the granuphilin C2A domain with PI(4,5)P2. Chem Phys Lipids. 186 (4,5), 61-67 (2015).
- Harazi, A., et al. The Interaction of UDP-N-Acetylglucosamine 2-Epimerase/N-Acetylmannosamine Kinase (GNE) and Alpha-Actinin 2 Is Altered in GNE Myopathy M743T Mutant. Mol Neurobiol. , (2016).
