Introduction
分子間の相互作用は自然の基礎です。したがって、基礎および応用研究の多くの分野の科学者は、異なる種類の分子相互作用の基本的な原理を理解してみてください。マイクロ熱泳動（MST）は、バッファを自由に選択して、高速、正確な、コスト効率の高い、溶液中の分子間相互作用の品質管理特性評価を行うために、科学者を可能にします。 MSTを使用して、1,000以上の出版物は、ライブラリースクリーニング、結合事象の検証、競合アッセイ、および複数の結合パートナー1-8を用いた実験を含めた分析の種類を記述する、単独で2016年から、すでにあります。一般的に、MSTは、このような分子間相互作用の任意の種類の結合親和性（mmまでPM）、化学量論、および熱力学、のような古典的な結合パラメータ、の研究を可能にします。 MSTの大きな利点は、相互作用パートナーの大きさの独立した結合事象を研究する能力です。でもCHALlengingの小核酸アプタマーとの相互作用（15-30塩基）等の小分子、薬物、抗生物質、または代謝産物などの標的を定量することができます。
アプタマー-ターゲット相互作用を特徴づけるために、現在の最先端の技術は、実験室強く、非常に複雑されているか、またはアプタマー-小分子相互作用9,10を定量化することができません。表面プラズモン共鳴（SPR）はゲル状、19をプロービングにライン、アッセイ11,12と、本当にそのような等温滴定熱量測定（ITC）13-15、定組成溶離16、平衡ろ過17,18としてラベルフリー熱量測定アプローチを、ベースシフトアッセイ、stopped-流FL uorescence分光法20,21、蛍光異方性（FA）22,23、単一分子FL uorescenceイメージング24,25、およびバイオ層干渉（BLI）は26も不正確またはアプタマー、小分子と非互換ですか、相互作用。その他principaこれらのメソッドのリットルの問題は、低感度、高サンプル消費、固定化、表面の質量輸送の制限、および/またはバッファの制限です。これらの技術の唯一のいくつかは、凝集、吸着効果のための統合制御を提供します。
MSTは、アプタマーおよび小分子27-29、ならびにそのようなタンパク質30-33のような他の標的との間の相互作用を研究するために、この制限を克服するために、科学者のための強力なツールを表します。技術は、温度勾配を介して分子の動きに依存しています。呼ばれるこの有向運動、「熱泳動は、「サイズ、電荷、および分子34,35の水和殻に依存します。分子へのリガンドの結合を直接変更熱泳動移動度が得られ、これらのパラメータのうちの少なくとも1つを変化させます。小さなサイズを有するリガンドは、結合した状態に結合していないからサイズ変更の面で大きな影響がないかもしれませんが、彼らがdrを持つことができます水和殻および/または電荷にamatic効果。結合パートナーとの相互作用後の分子の熱泳動運動の変化は、基本的な結合パラメータ2,7,34,36,37の定量化を可能にします。
図1Aに示されているように、MSTデバイスは、蛍光検出の場合と同じ光学系を用いて、ガラスキャピラリー内のサンプル上に集束赤外線レーザーで構成されています。レーザは温度勾配（2-6℃のΔT）を確立しながら、トリプトファン6または蛍光標識された相互作用パートナー3,8のの固有のFL uorescenceを介してタンパク質の熱泳動的動きを監視することができます。空間、ΔTで生じる温度差はソーレーによって定量することができる高温の領域での枯渇または分子の蓄積につながるCOEF Fiのcient（S T）。
G "/>
C ホット加熱された領域内の濃度を表し、及びcの寒さは、初期の寒冷地での濃度です。
図1B、それぞれの時間スケールによって分離することができる別の相からなるMSTの移動プロファイル（時間トレース）における典型的なMSTの実験結果に示すように初期蛍光を正確出発蛍光を定義し、光退色またはphotoenhancementをチェックするために温度勾配が存在しない場合に最初の5秒で測定されます。温度ジャンプ（T-ジャンプ）において蛍光変化熱泳動移動前の段階を示しています。この蛍光の初期の減少は、量子収率uorophore FLの熱的変化に依存しています。定常状態分布に達するまで、熱泳動相が原因分子の熱泳動的動きのために、蛍光が減少（または増加）に従います。レーザがオフにされた後、図1（b）に示すように、逆TJUMPと蛍光増分子の同時逆拡散を観察することができます。基本的な結合パラメータにアクセスするために、相互作用パートナーの異なるモル比を分析し、比較します。光学可視分子が一定に保たれると非標識リガンドの増加量が供給され、一方、典型的には、16の異なる比率は、一つMST実験で研究されています。 2つの結合パートナーとの相互作用は、熱泳動の変化を誘導し、したがって、正規化されたFL uorescenceで、次のように計算されるF ノルム 、：
冷たい ホット ＆F Fは、MSTトレースのデFiのNEDの時点でFL uorescence強度を平均化表します。結合親和性（K dまたはEC 50値）CURVによって計算することができます。電子フィッティング（ 図1C）。
全体的に、MSTは、いかなる種類の分子相互作用を研究するための強力なツールです。および25-ntの短い一本鎖DNAアプタマーDH25.42（7.9キロダルトン）;この原稿は、小分子アデノシン三リン酸（0.5 kDaのATP）との間で挑戦的な相互作用を特徴づけるためのプロトコルを提供しています。原稿の間に、ATP分子上のアプタマーの結合部位は、ATPのアデニングループにダウンマッピングされます。
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Protocol
アプタマー作業ストックの調製
- 製造元の指示に従って、水にオリゴヌクレオチド（5-Cy5でCCTG GGGGAGTATTGCGGAGGAAGG-3、参照18からの配列）を溶解、100μMの最終濃度に達します。
- 結合緩衝液で200 nmまでのオリゴヌクレオチドストックを希釈することにより、アプタマー作業溶液を準備します（20 mMトリス、pHが7.6; 300mMのNaCl; 5mMのMgCl 2、0.01％のTween20）。
- 90℃で2分間混合物をインキュベート、サンプルはすぐに氷上で冷却し、室温でサンプルを使ってみましょう。
リガンド希釈シリーズの調製
- 各リガンド（アデノシン三リン酸（ATP）、アデノシン二リン酸（ADP）、アデノシン一リン酸（AMP）、アデニン、グアノシン三リン酸（GTP）、シチジン三リン酸（CTP）、デオキシアデノシン三リン酸（dATPを）、及びS-アデノシルメチオニン（SAM）のために; 10 mMストックずつ）、16ステップシリアルdilutiを準備200μlのマイクロ反応チューブ内に。
注：14,000×gで5分間のリガンド株式の遠心分離は、凝集物を除去するのに役立つことがあります。低容量は、低結合反応チューブは、チューブ壁に分子の吸着を避けることをお勧めします。 - 推定親和性より少なくとも50倍の最大濃度で開始し、各希釈段階で50％リガンド濃度を低下させます。
注：制御ソフトウェアに実装濃度ファインダーツールは、結合データをシミュレートし、希釈系列のための右の濃度範囲を見つけるのに役立ちます。 - マイクロ反応管に16から2をアプタマー結合緩衝液10μlを加え、チューブ1のリガンドストック（10 mM）の20μlのを入力します。
- 転送10管2に管1μlのピペッティングにより、数回上下適切に混ぜます。次のチューブに10μLを移し、残りのチューブのために、この希釈を繰り返します。
- 最後のチューブから10μlの過剰を捨てます。任意のbは避けてくださいufferの希釈効果。チューブ1およびチューブ2月16日のバッファは同一でなければなりません。
最終反応ミックスの調製
- ピペッティングの誤差を最小化するために個々の結合20μlの容量との反応（アプタマー使用液+それぞれのリガンド希釈液10μlを10μl）を準備します。わずか4μLの容量は、キャピラリーLL FiにSUFのfi cientです。
- 各リガンド希釈液10μlに200 nmのアプタマーワーキング溶液10μlを加え、ピペッティングにより、数回上下適切に混ぜます。
- 試料中に毛細血管を浸漬することにより、標準的なキャピラリーにサンプルLL室温とFiので5分間サンプルをインキュベートします。より長いインキュベーション時間は、いくつかの相互作用を必要とすることができます。しかし、5分が最も適しています。 NOT光学測定が行われる中央部、上、側面のみに毛細血管をタッチします。
- 目の上に毛細血管を配置電子キャピラリートレイとMSTデバイスを起動します。
4. MSTデバイスの起動
注：生成されたデータを解釈するためのソフトウェアデバイスに2つのプリインストールされたソフトウェア・パッケージを提供し、 '' " '分析制御実験条件の技術的なセットアップ用のソフトウェア'"。
- MSTデバイスに毛細管トレイを配置する前に、制御ソフトウェアを起動し、ドロップダウンメニュー ' "'温度制御で「手動温度制御を可能にする ''を選択することによって、全体的な所望の温度を調整します。このように、25℃に温度を調整します。
注：MST機器は、温度制御された22〜45°Cからすることができます。 - 温度が期待されるレベルに到達した後、MSTデバイスに毛細管トレイを配置するのを待ちます。
- Cy5の色素のための " ''赤にLEDチャネルを設定し、FL uorescencを得るためにLEDの電力を調整します標準センサーとMSTデバイスで300〜1000蛍光単位の電子信号。 25％のパワーLEDをこの研究で使用されています。
注：6000 18000蛍光単位は、高感度センサーとMSTのために推奨されています。
5.キャピラリースキャン
- 「コントロール」のソフトウェア上のキャピラリの位置を選択し、「開始キャップスキャン」をクリックすることで、試料の異なる品質面をチェックするために、毛細管スキャンを行います MSTの測定を開始する前に。
- ソフトウェアで（U字型またはピークを平坦化）蛍光増強/消光とこだわりの効果のためのキャピラリースキャンを点検します。
注：その他の蛍光の検出および取り扱いに関する詳細やこだわりの影響が議論に記載されています。
6. MST測定
注：MSTの測定を開始する前に、こだわりの影響を除外することを確認し、充実/クエンチング効果、またはピペッティングエラー、毛細管スキャンがフロリダ州uorescence信号がSUFのfi cientであることを示していることを確認してください。詳細については、説明を参照してください。
- ''コントロール」ソフトウェアで、それぞれのキャピラリ位置に希釈系列からのリガンドの濃度を割り当てアプタマーとリガンド（1：1）を混合する希釈工程を考えてみましょう。
- キャピラリ＃1のリガンドの最高濃度（5 mm）を入力し、正しい希釈タイプを選択します（ここでは、1：1）、最大濃度をクリックすると、自動的に毛細血管の＃2位の残りの濃度を割り当てるには、ドラッグ機能を使用16。最低濃度は152.6 nmです。
- 制御ソフトウェアの各セクションで（ここでは、100 nM）を蛍光増アプタマーの濃度を入力します。
- 、5秒間のFL uorescenceを検出し、デフォルト設定を使用して30秒間MSTを記録し、レーザーtの不活性化後にさらに5秒間蛍光を記録します O分子の逆拡散を監視します。
- 制御ソフトウェアの各セクションの20％のレーザー出力を調整します。
注：最高の信号対雑音比を受信し、非特異的効果を回避するために、20〜40％のレーザー出力が推奨されます。特定の場合において、より高いレーザー出力を結合していない及び結合した分子の良好な分離を得るために必要とされ得ます。 - コピー先のフォルダを選択した後、実験を保存して、 ''スタートMST測定」ボタンを押すことで、MSTの計測を開始します。
注：.ntpファイルは、保存先のフォルダに生成されます。この設定を使用して、一回の測定は、10〜15分間持続します。 - EC 50値のより正確な決意のために少なくとも2回の実験手順を繰り返します。
注：技術的再現性を試験するために、同一の毛細管が複数回（技術的反復）を走査することができます。
7. MSTデータ分析
NT ">注：解析ソフトウェアは測定中のFL yの上のデータの分析を可能にする分析ソフトウェアは、リガンド濃度37対MST時間トレースと正規化されたフロリダ州uorescence（F ノルム ）の変化をプロットします。。- MST解析ソフトウェア（MO.Affinity分析）を起動し、保存先のフォルダから.ntpファイルをロードします。データ選択メニューでの解析タイプとして「MST」を選択します。
注：リガンド依存性蛍光効果の場合は、初期蛍光分析のために選択することができます。 - ドラッグ・アンド・ドロップするか、それぞれの実験下の「+」ボタンを押して、新たな分析にそれぞれの技術的あるいは生物学ラン（複数可）を追加します。
- 実験では、MSTのトレース、キャピラリースキャン、キャピラリー形状、初期蛍光、および漂白速度の特性に関する情報を得るために、それぞれの実験以下の情報ボタンを押してください。
注：これらの生データ缶アルそう分析の後の手順で検査されます。 - 視覚バンプやスパイクなどの目に見える、凝集および沈殿効果のためのMSTトレースを検査します。
注：検出および凝集効果の取り扱いの詳細については、議論をお読みください。 - 視覚的に平坦化またはU字型のピークとして表示毛細管スキャンと吸着効果のためのキャピラリー形状オーバーレイを、点検してください。視覚毛細管スキャンおよび蛍光効果の初期蛍光を検査します。視覚効果を光退色するための漂白率を検査します。
- 用量 - 応答モードに切り替えて、それぞれのボタンを押して、「エキスパート」モードに解析の設定を変更します。 MSTの評価戦略として「T-ジャンプ」を選択します。
- 曲線Fiのための設定については、「ヒル」モデルを選択します。結合パラメータを自動的に計算されます。 「比較結果」メニュー内の正規化のそれぞれのタイプを選択してデータを正規化します。エクスポート.XLSまたはPDFファイルなどのデータのいずれか。
注：バインディンググラフ下の表には、計算された結合パラメータをまとめたもの。
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Representative Results
この研究では、MSTは、ATPのDH25.42 DNAアプタマー18の結合部位を特徴付けるために適用されました。ランダム38-40一つ以上の蛍光体で標識タンパク質と小分子をATPの相互作用を特徴付けるまたはATP模倣他の研究とは対照的に、本研究では、5 '末端上の1つのCy5分子と7.9 kDaの一本鎖DNAアプタマーのラベル付きバージョンが含まれています。異なるATP誘導体および関連分子、様々な位置にATP異なるすべては、ATP分子上の結合部位をマッピングするために使用しました。異なるリガンドの（50％ずつリガンド濃度を減少させる16段階で）希釈系列を調製し、Cy5標識アプタマーの一定量と混合しました。サンプルを、25％のLEDと20％のレーザー出力において標準キャピラリーで分析しました。移動プロファイル（MST時間トレース）を記録し、T-ジャンプ相に由来する蛍光単位は、リガンドconcentrに対してプロットしました。エーション（ 図1Cを比較）。カーブフィッティングは、EC 50値が得られ、ヒルの方程式を適用することを行いました。 5つの独立した生物学的反復（4異なるオペレータ、2つの異なるアプタマー株式、2つの異なるATP株式）において、ATP-アプタマー相互作用は、6〜13単位の負の結合振幅および52.3±5.0μMの平均EC 50値を示している（ 図2A ）。親和性データで提示結合グラフと「±」のエラーバーは、5生物学的反復（異なるキャピラリー中5独立した測定値）の標準偏差を表します。 [2,8,5'- 3 H] -アデノシンおよびATPアガロースとDH25.42アプタマーとの相互作用のために、以前に報告された親和性は同等でした。アプタマーで放射性標識アデノシンの相互作用は遠心フィルターアッセイにより定量化し、そして6±3μMの親和性（K d）は測定されました。 ATP immobilとのアイソクラティック溶出実験13μM18,41の親和性（K d）がもたらしたアガロースに化さ。
優れたサイド・バイ・サイド比較のために、データは、以下の式を用いて（、FB結合画分）、複合体分子の画分に標準化することができます。 
値（c）は濃度cについて測定MST値であり、 自由に結合していない状態（最低濃度）のためのMST値であり、および複合体は完全にバインドされた状態（ 図2B）のためのMST値です。 図2Cに示すように、この正規化は、1つのグラフに異なるリガンドの結果を比較することが理想的です。 NUでATP異なる検出AFのfi ADP（生物学的重複で63.6±5.9μM）、AMPのnities（生物学的重複で91.6±9.1μM）、およびSAM（生物学的重複で44.4±3.2μM）、リン酸基のmberは、この位置は全くまたはアプタマー（ 図2CおよびD）の結合挙動にFL uenceで唯一のマイナーを持っていることを意味するものではありません。 dATPもわずかに減少親和（生物学的重複で64.4±6.1μM）とアプタマーにより結合させたとしてATPのリボースのC2炭素にOH基はまた、主要な結合部位であることから除外することができました。ピリミジン基CTPにATPのプリングループを変更すると、相互作用のため、このグループの重要性を実証し、アプタマーの非結合をもたらしました。アプタマーは、結合部位はATP分子のこの部分でなければならないことを示し、141.7±9.4μM（生物学的重複中）の親和性でアデニンに結合しています。プリン分子GTPとATPは、ATP上のアプタマーの主な結合部位を表し、図2（d）に示される緑の斜線部分が異なります。別の研究では、異なるATP誘導体と非定量的溶出実験を使用しましたこのMSTの研究18に匹敵する結果を示したATPアガロースからの放射性標識アプタマーを溶出。
図1：マイクロ熱泳動 。 （A）MST技術の技術的なセットアップを示します。光学系により光学的に可視の分子の蛍光シグナルを検出し、ガラスキャピラリーの中心に焦点を当てます。 IRレーザーは、光学系の観察窓に温度勾配を確立するために利用されます。温度勾配中の分子の蛍光の変化を、溶液中の分子の熱泳動的動きを監視するために利用することができる（B）MST時間トレース移動プロFi接続ル。レーザーがオフの間、最初の蛍光を5秒間測定します。レーザーに切り替えると、温度勾配が生じます。即時T-ジャンプpの後蛍光増染料は、熱誘導の際の信号の収率を減少する長谷は、熱泳動移動が行われ、30秒間観察されます。レーザがオフにされた後、分子が戻って拡散します。典型的なMST実験の（C）の結果：（左）蛍光分子の同じ濃度と非標識リガンドの濃度が増加を含む16のキャピラリ。 MST時間トレースが記録され、その初期蛍光に正規化されています。 （右）正規化されたフロリダ州uorescence。 ホット 、コールドとF Fとの間の差は、リガンドの濃度に対してプロットされています。このような結合親和などのパラメータを、このデータバインディング利回りのカーブフィット。エルゼビア、方法28からの許可を得て再印刷します。ライセンス番号3890230800113. この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図2：MST データ解析。 （A）ベースラインがMST Tjumpの信号から導出さΔF ノルム （‰）、uorescence正規化されたFLを修正し、（μMで）ATP濃度に対してプロットされています。ヒルの方程式（EC 50）は、カーブフィッティングのために適用しました。エラーバーは、5つの生物学的反復からの標準偏差を表します。 （B）それぞれのデータセットを結合画分に対して正規化されたAで示されるデータの画分に結合したプロット、およびこれらの正規化されたデータの平均値を、結合のグラフに示されています。エラーバーは、5生物学的反復の標準偏差を示します。 （C）画分に結合したグラフは、アプタマーへの異なるリガンドの定量的な比較（ヒルフィット）を示しています。エラーバーは標準deviaを表します2つの生物学的反復の化。 （D）アプタマーに異なるリガンドのAFのfi nities（EC 50）を結合。緑の斜線部分は、ATPのアデニン基上のアプタマーの結合部位を示しています。この図は、エルゼビア、方法28から変更されます。以前の研究からのライセンス番号3890230800113.データセットが再分析し、この研究の中に展開されます。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図3：MST 実験のためのアッセイの最適化。 （A）タンパク質吸着及び付着効果は毛細管スキャンで検出することができます。このような平坦化またはU字形のピークとして不規則なピーク形状は、ガラス表面への試料物質の付着を示します。 C言語毛細管タイプ（標準、プレミアム、または疎水性）をぶら下げすることは、通常のピーク形状が得られ、分子の吸着を防ぐことができます。凝集体は、バンプとスパイクとして存在を検出することができるので、（B）MST時間トレースはまた、品質管理として機能します。実験条件は、（例えば、プルロニックF-127または様々なpH値または塩濃度などの界面活性剤を含む、例えば、）分子の溶解性を改善することによって最適化することができます。遠心分離は、より大きな凝集物を除去するのを助けることができます。最適なデータ品質を確保するために、MST時間トレースは、与えられた例のようになります。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
品質コントロール：
非特異的表面への試料物質の付着/吸着、ならびに凝集効果、親和性データの質に劇的な影響を与えます。しかし、わずか数最先端の技術は、これらの影響を監視し、回避するために、正確かつ迅速なオプションを提供しています。 MSTは、技術的なセットアップの段階的な最適化を可能にする、検出し、これらの問題を克服するのに役立つ統合された品質管理を提供しています。凝集/沈殿効果（ステップ7.7）に移動プロファイルで監視することができ、一方、粘着蛍光効果に関する重要な情報は、毛細管スキャンキャピラリー形状（5.2および7.5ステップ）から抽出することができます。これらのコントロールは、データ品質の一定の改善のために有効にして、プロトコルにおける重要なステップを表します。
吸着効果とトラブルシューティングの検出：
キャピラリースキャンは、主にINIとして行われますTiAlのステップは、その上に蛍光をスキャンすることによって、トレイ保持部上の毛管の位置を決定します。各ピークは、MSTの計測の開始点を示す一毛細管を表します。ピーク形状の目視検査は、MST実験を開始する前に行われるべき本質的な品質管理をガラス表面への分子の吸着の決意を可能にします。キャピラリー形状のオーバーレイは、キャピラリー（ 図3A、上パネル）の内側のガラス表面への分子の吸着/付着を示す、あるいはU-形に似ているピークの平坦化、でこぼこのピーク形状を容易に検出することができます。異なったコーティングされたキャピラリータイプ（標準、プレミアム、および疎水性）毛細血管に溶解性と分子の最小限の吸着を確実にするために役立ちます。毛細血管は前結合実験への適合性をテストする必要があります。このようなトゥイーン（0.005から0.1パーセント）またはプルロニックF127（0.01から0.1パーセント）ミリアンペアとして洗剤yはまた、非特異的吸着効果を防ぎます。実験のこの段階での最適化は、高いデータ品質（下パネル図3Aを比較する）のために不可欠です。
蛍光効果とトラブルシューティングの検出：
スキャンされた毛細血管のピーク高さの変化は、サンプルの特性に関する情報の別の層を提供しています。キャピラリー蛍光のランダムな違いは、一方で、他方では、急激に蛍光を増加させることができる走査領域で大きなサンプル凝集体に由来、ピペット操作エラーに起因するかよいです。高い分注精度は、希釈効果を回避するために必須です。上下にピペッティングすることにより、すべてのソリューションを混在させると、さらに精度を向上させます。また、各キャピラリーにおける一貫性のバッファを維持することが不可欠です。凝集効果に対処するための戦略は、後の段落に示されています。
increaと蛍光の全身の変更リガンド濃度を歌うことが多いリガンド依存性消光/増強効果を示しています。 「SDテストは「非特異的蛍光の損失からの結合によって誘導される蛍光の変化を識別するために行われます。このテストは、変性条件下で蛍光強度を監視します。リガンド依存性の蛍光効果の場合には、変性条件下での蛍光強度は、滴定液の濃度とは無関係に同一である必要があります。蛍光強度の差は、これらの条件下で依然として存在している場合、材料は、いずれの管壁に、またはによる凝集およびその後の遠心分離による非特異的吸着のために失われました。
SDテストを行うためには、最初と最後のリガンドの希釈段階の10μlの10μlの各慎重に2×SDミックス（4％SDSおよび40mMのDTT）の10μLを含む新しいチューブに移しています。サンプルが混合された分子は、95℃で5分間変性されます。 AFTERキャピラリにサンプルを充填し、蛍光強度を測定します。リガンド依存性蛍光効果が検出された場合、データは、蛍光強度の変化から推定される結合情報によって直接分析することができます。
凝集効果とトラブルシューティングの検出：
バンピー、不均一なMST時間トレースは、凝集および/または沈殿の効果（ 図3B、上のパネル）を示します。非凝集サンプル材料は、クリーンで滑らかな熱泳動移動プロファイル（ 図3B、下のパネル）が表示されます。 （14,000×gで5〜10分）を使用する前に、試料材料、界面活性剤の添加（0.005〜0.1％のTween-20を、0.01〜0.1％プルロニックF-127、または同様のもの）、BSAの使用（の遠心分離> 0.5 mg / mlで）、または緩衝液条件（pHおよびイオン強度）の変化は、凝集効果を最小限にするために、データの品質を最適化するために推奨されています。高品質なデータを得るために、それ凝集効果を最小限にすることが不可欠です。
データ分析とカーブフィッティング：
熱泳動移動プロファイルは別々に、または同時に検査することができる別の段階に分割されます。 T-ジャンプは、蛍光体の本質的な特性を表す、温度変化時の蛍光収率の急激な変化を説明しています。高度に結合した際の蛍光体または立体配座の変化の近い周囲の直接結合は、T-ジャンプに影響を与えます。遅い熱泳動は、形成された複合体の全体構造についての情報を提供し、温度場における分子の動きを指します。データ解析のデフォルトタイプは、結合パラメータを決定するために、両方の現象を利用し、 "熱泳動+ Tジャンプ」設定を使用します。二相が反対方向を持っている場合には、別途のフェーズを分析することをお勧めします。その時、エフェクトやmolecの異なる種に注意してくださいジュールは、熱泳動とT-ジャンプの親和性の違いにつながる可能性があります。解析オプションの別のタイプは、移動プロファイルの特定の領域の調査を可能にする手動設定です。凝集または対流による妨害は、このように除外することができます。データの品質を向上させるために、カーソルは、集約信号の前に設定されてもよいです。対流は、時間依存性プロセスであるため、早期に熱泳動を調べると、一般的に、ノイズの少ないデータを生成します。この初期の手動設定は、非常に高いレーザパワー（80％）での実験のために推奨されます。データ解析の設定を選択する際に、解析ソフトウェアに統合された2つのフィッティングモデルは、結合曲線に適合するように適用することができます。 1の結合様式や同じ親和性を有する複数の結合部位のために：質量作用の法則からK dのフィット関数は1に適しています。濃度に依存しない解離定数K dは坊間の平衡を記述するNDと結合していない状態。従って、リガンドに対する結合部位の親和性を測定します。ヒルの式に由来する濃度依存性のEC 50値は、結合状態にある標識分子の半分が、リガンドの有効量を表します。ヒルフィットは、それらが協調している場合は特に、結合モデルを多価に適用されるべきです。
統合品質管理は、SPRやITCなどの技術を介してMSTの一つの大きな利点を表しています。これらのコントロールは、最適なデータ品質を確保するための技術的なセットアップの迅速かつ容易な最適化を可能にします。時間効率の測定（15分のK d）および固定化フリーのセットアップに加えて、MSTはあっても溶解物および血清5,42,43に、分子間相互作用の評価を可能にして、バッファの自由な選択を提供しています。分子の熱泳動は、サイズ、電荷、および分子の水和殻に依存するという事実に起因し、制限はありませんMSTの測定中に測定された相互作用パートナーのサイズインチ一緒に低いサンプル消費の時から午後mmの動的な親和範囲は、、MST技術の強みを完了します。 MSTが、このような結合親和性、化学量論、および熱力学などの基本的な結合パラメータ、上の正確なデータを生成していることを言及する価値があります。しかし、MSTは、 上の kの測定を可能にし、料金をk offはしません。また、一方が最もMST実験のために、蛍光性の改変は、相互作用パートナーのいずれかに追加する必要があり、それを考慮しなければなりません。生成されたデータは、SPRとITC 32,43-46など最先端の技術、とよく一致しています。しかしながら、これらのデータは、実験は、より高速であり、それらはより少ない材料を消費し、品質管理されています。全体的に、MSTは、いくつかの追加の利点を持つ最先端の技術への強力な技術の直交を表します。
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Disclosures
CEおよびTSは、生物物理学的分析サービスを提供し2bind社の従業員です。このビデオの記事のための出版手数料は2bind社によって支払われています。
Acknowledgments
著者は何の確認応答がありません。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aptamer binding buffer | 20 mM Tris pH 7.6; 300 mM NaCl; 5 mM MgCl2; 0.01% Tween-20 | ||
| Fluorescently labeled ATP aptamer | IDT, Leuven, Belgium | sequence: DH25.42 50-Cy5-CCTGGGGGAGT- ATTGCGGAGGAAGG-3 |
|
| ATP | Sigma Aldrich, Germany | A2383 | 10 mM stock solutions stored at - 20 °C |
| ADP | Sigma Aldrich, Germany | A2754 | 10 mM stock solutions stored at - 20 °C |
| AMP | Sigma Aldrich, Germany | A2252 | 10 mM stock solutions stored at - 20 °C |
| Adenine | Sigma Aldrich, Germany | A8626 | 10 mM stock solutions stored at - 20 °C |
| SAM | Sigma Aldrich, Germany | A7007 | 10 mM stock solutions stored at - 20 °C |
| dATP | Sigma Aldrich, Germany | 11934511001 | 10 mM stock solutions stored at - 20 °C |
| CTP | Sigma Aldrich, Germany | C1506 | 10 mM stock solutions stored at - 20 °C |
| GTP | Sigma Aldrich, Germany | G8877 | 10 mM stock solutions stored at - 20 °C |
| Monolith NT.115 | NanoTemper Technologies, Munich, Germany | MO-G008 | Blue/Red Channel MST device with standard detector, Monolith NT115 pico is MST device with high sensitivity detector |
| Monolith NT.115 capillaries Standard | NanoTemper Technologies, Munich, Germany | MO-K002 | |
| Eppendorf PCR tubes | Eppendorf, Germany | 30124537 | |
| Monolith control software. 2.1.33, pre-installed on the device | NanoTemper Technologies, Munich, Germany | ||
| MO.affinity analysis v2.1.1 | NanoTemper Technologies, Munich, Germany | ||
| Kaleidagraph 4.5.2 | Synergy Software |
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