Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Kartläggning av bindningsstället för en aptamer på ATP Använda Micro Thermophoresis

Published: January 7, 2017 doi: 10.3791/55070
Automatic Translation
1, 1
12bind GmbH

Introduction

Interaktion mellan molekyler utgör grunden för naturen. Därför forskare inom många områden av grundforskning och tillämpad forskning försöker förstå de grundläggande principerna för molekylära interaktioner av olika slag. Micro Thermophoresis (MST) gör det möjligt för forskare att utföra snabba, exakta och kostnadseffektiva, och kvalitetskontrollerad karakterisering av molekylära interaktioner i lösning, med ett fritt val av buffertar. Det finns redan mer än 1.000 publikationer med hjälp av MST, från 2016 ensam, som beskriver olika typer av analyser, inklusive biblioteks filmvisningar, bindande händelse valideringar, konkurrensanalyser och experiment med flera bindningspartner 1-8. I allmänhet, MST tillåter studiet av de klassiska bindningsparametrar, såsom bindningsaffinitet (pM till mM), stökiometri, och termodynamik, av något slag av molekylär interaktion. En stor fördel med MST är förmågan att studera bindningshändelser oberoende av storleken av interaktionspartners. även chalnande interaktioner mellan små nukleinsyra aptamers (15-30 nt) och mål såsom små molekyler, läkemedel, antibiotika, eller metaboliter kan kvantifieras.

Nuvarande state-of-the-art teknik för att karakterisera aptamer-mål interaktioner är antingen lab-intensiv och mycket komplexa eller misslyckas med att kvantifiera aptamer-småmolekylära interaktioner 9,10. Surface Plasmon Resonance (SPR) -baserad analyser 11,12 och verkligen etikettfria kalorimetriska metoder, såsom Isotermiska Titrering Calorimetry (ITC) 13-15, isokratisk eluering 16, jämvikts fi ltration 17,18, in-line sondering 19, gel- skift analyser stopped- fl öde fl uorescence spektroskopi 20,21, fluorescensanisotropi (FA) 22,23, enda molekyl fl uorescence avbildning 24,25, och Bio-skikt interferometri (BLI) 26 är också antingen oprecisa eller oförenlig med aptamer-liten molekyl interaktioner. andra huvl frågor dessa metoder är låg känslighet, hög prov konsumtion, immobilisering, begränsningar masstransport på ytor, och / eller begränsningar buffert. Endast ett fåtal av dessa tekniker ger integrerade kontroller för aggregering och adsorption effekter.

MST utgör ett kraftfullt verktyg för forskare att övervinna denna begränsning för att studera samspelet mellan aptamers och små molekyler 27-29, liksom andra mål såsom proteiner 30-33. Tekniken bygger på förflyttning av molekyler genom temperaturgradienter. Detta riktad rörelse, kallad "thermophoresis" beror på storlek, laddning, och hydrering skal av molekylen 34,35. Bindningen av en ligand till molekylen kommer att direkt förändra åtminstone en av dessa parametrar, vilket resulterar i ett förändrat thermophoretic rörlighet. Ligander med små storlekar kan inte ha en betydande inverkan i termer av storlek förändring från den obundna till det bundna tillståndet, men de kan ha dr amatic effekter på vätske skal och / eller laddning. Förändringarna i thermophoretic rörelse av molekyler efter växelverkan med bindningspartnern möjliggör kvantifiering av grundläggande bindningsparametrar 2,7,34,36,37.

Såsom avbildas i figur 1 A, MST Anordningen består av en infraröd laser fokuseras på provet inom de glaskapillärer med användning av samma optik som för fluorescensdetektion. Den thermophoretic rörelsen av proteiner via den inre fl uorescence av tryptofaner 6 eller av en fluorescensmärkt interaktionspartner 3,8 kan övervakas medan lasern upprättas en temperaturgradient (AT för 2-6 ° C). Den resulterande temperaturskillnaden i rymden, AT, leder till utarmning eller ackumulering av molekyler i området för förhöjd temperatur, som kan kvantifieras genom det Soret koef fi räcklig (S T):

g "/>

c hett representerar koncentrationen i det uppvärmda området, och c kallt är koncentrationen i det inledande kall regionen.

Såsom visas i figur 1B, en typisk MST experimentresultat i en MST rörelseprofil (tidskurva), som består av olika faser, vilka kan separeras med deras respektive tidsskalor. Den initiala fluorescens mäts i de första 5 si frånvaro av temperaturgradienten att definiera exakt börjar fluorescens och för att kontrollera fotoblekning eller photoenhancement. Temperatur Jump (T-Jump) representerar fas där fluorescens ändringarna innan thermophoretic rörelse. Denna inledande minskning i fluorescens beror på värmeberoende förändringar av fl uorophore kvantutbyte. Den thermophoresis fas följer, i vilken fluorescens minskar (eller ökar) på grund av den thermophoretic rörelsen av molekylerna tills steady-state distributions uppnås.Kan observeras omvända TJump och samtidig tillbaka diffusion av fl uorescent molekyler som visas i figur 1B efter lasern är avstängd. För att få tillgång grundläggande bindningsparametrar används olika molära förhållanden av interaktionspartners analyseras och jämföras. Normalt är 16 olika förhållanden studerats i en MST experiment, medan den optiska synlig molekylen hålls konstant och matas med en ökande mängd av omärkt ligand. Samspelet mellan de två bindningspartners framkallar förändringar i thermophoresis, och därmed i den normaliserade fl uorescence, F norm, som beräknas enligt följande:

Ekvation

F varm och F kall representerar genomsnitt fl uorescence intensiteter vid de fi nierade punkter i MST spåren gång. Bindningsaffiniteter (K d eller EC 50-värden) kan beräknas genom curve montering (Figur 1C).

Totalt sett är MST ett kraftfullt verktyg för att studera molekylära interaktioner av något slag. Detta manuskript ger ett protokoll för att karakterisera utmanande samverkan mellan den lilla molekylen adenosintrifosfat (ATP, 0,5 kDa) och 25-nt kort ssDNA aptamer DH25.42 (7,9 kDa). Under loppet av manuskriptet, är bindningsstället för aptameren på ATP-molekylen mappas ner till adenin grupp av ATP.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Beredning av aptamer Working Stock

  1. Följ tillverkarens instruktioner och lös oligonukleotid (5-Cy5-CCTG GGGGAGTATTGCGGAGGAAGG-3, sekvens från 18 referens) i vatten, och nådde en 100-iM slutkoncentration.
  2. Förbered aptamer arbetslösning genom spädning av oligonukleotiden lager till 200 nM med bindningsbuffert (20 mM Tris, pH 7,6; 300 mM NaCl; 5 mM MgCl2; 0,01% Tween 20).
  3. Inkubera blandningen under 2 min vid 90 ° C, låt provet kallna omedelbart ned på is, och använda provet vid rumstemperatur.

2. Framställning av liganden utspädningsserie

  1. För varje ligand (adenosintrifosfat (ATP), adenosindifosfat (ADP), adenosinmonofosfat (AMP), adenin, guanosin trifosfat (GTP), cytidintrifosfat (CTP), deoxiadenosintrifosfat (dATP), och S-adenosylmetionin (SAM) ; 10 mM lager vardera), förbereda en 16-stegs serie dilutipå i 200 pl mikro reaktionsrör.
    OBS: Centrifugering av ligand lager till 5 min vid 14000 xg kan hjälpa till att ta bort aggregat. Låg volym, är låga bindnings reaktionsrör rekommenderas för att undvika adsorption av molekyler till rörväggarna.
  2. Börja med en maximal koncentration av minst 50 gånger högre än den beräknade affinitet och minska ligandkoncentrationen med 50% i varje spädningssteg.
    OBS: Koncentrationen hitta verktyg implementeras i styrprogram simulerar bindningsdata och hjälper till med att hitta rätt koncentrationsområdet för spädningsserie.
  3. Fyll 20 pl av liganden lager (10 mM) i röret 1. Tillsätt 10 | il av aptamer bindningsbuffert i mikro reaktionsrör 2 till 16.
  4. Överföring 10 pl av röret 1 till röret 2 och blanda ordentligt genom att pipettera upp och ned flera gånger. Överför 10 mikroliter till nästa röret och upprepa denna utspädning för de återstående rören.
  5. Kasta 10 pl överskott från den sista röret. Undvik BUffer utspädningseffekter. Bufferten i röret 1 och i rör 2-16 måste vara identiska.

3. Framställning av den slutliga reaktions Mix

  1. Förbered de enskilda bindningsreaktioner med en volym på 20 pl (10 pl aptamer arbetslösning + 10 pl av respektive liganden utspädning) för att minimera pipetteringsfel. En volym på endast fyra il är tillräck- fi ligt att fi ll kapillären.
  2. Tillsätt 10 | il av 200 nM aptamer arbetslösning till 10 ^ il av varje ligand utspädning och blanda ordentligt genom att pipettera upp och ned flera gånger.
  3. Inkubera proverna för 5 minuter vid rumstemperatur och fi ll proverna till standard kapillärer genom att doppa kapillärerna in i provet. Längre inkubationstider kan vara nödvändigt för vissa interaktioner; emellertid är 5 min tillräcklig för de flesta. Tryck kapillärerna endast på sidorna, inte på den mellersta delen, där den optiska mätningen kommer att vidtas.
  4. Placera kapillärerna på the kapillär facket och starta MST-enheten.

4. Starta MST Device

OBS: Enheten har två förinstallerade programvarupaket, det ' "programvara för den tekniska installationen av de experimentella betingelserna och kontroll' 'analys" programvara för tolkning av de framställda uppgifterna.

  1. Innan du placerar kapillär facket i MST-enheten, starta styrmjukvaran och justera den totala önskade temperaturen genom att välja '' möjliggör styrning manuell temperatur "i '' temperaturkontroll" rullgardinsmenyn. Justera temperaturen till 25 ° C på detta sätt.
    OBS: MST instrumenten kan vara temperaturreglerat 22-45 ° C.
  2. Vänta tills temperaturen att nå den förväntade nivån och sedan placera kapillära facket i MST-enheten.
  3. Ställ in LED kanal till '' red "för Cy5 färgämnen och justera LED makt att få en fl uorescence signal på 300 till 1000 fluorescensenheter vid MST-enheten med en standardgivare. 25% LED makt används i denna studie.
    OBS: 6000 till 18000 fluorescensenheter rekommenderas för MST med en högkänslig sensor.

5. Kapillär Scan

  1. Genomför en kapillär scan för att kontrollera olika kvalitetsaspekter av provet genom att välja kapillär position på programmet "kontroll" och klicka på "start cap scan" innan MST mätningen.
  2. Inspektera kapillär scan för fluorescensförstärkningen / släckning och klibbar effekter (U-formad eller tillplattade toppar) i programvaran.
    OBS: Mer information om att upptäcka och hantering av fluorescens och sticker effekter kan hittas i diskussionen.

6. MST Mätning

OBS: Innan MST mätning, se till att utesluta fastnar effekter, förbättring / släcknings effekter, ellerpipetteringsfel, och se till att det kapillära skanningen visar att fl uorescence signalen är suf fi ligt. För mer information, se diskussionen.

  1. Tilldela ligandkoncentrationer från utspädnings serie till respektive kapillär position i "programvara" kontroll "Betrakta utspädnings steget att blanda aptamer och liganden. (1: 1).
  2. Ange den högsta koncentrationen av ligand (5 mM) för kapillär # 1, väljer du rätt utspädning typ (här, 1: 1), klicka på den högsta koncentration, och använda dra-funktionen för att automatiskt tilldela de återstående koncentrationerna i kapillärer # 2- 16. Den lägsta koncentrationen är 152,6 nM.
  3. Ange koncentrationen av fl uorescent aptamer (här, 100 nM) i respektive avsnitt av styrmjukvaran.
  4. Använd standardinställningar, som detekterar fl uorescence i 5 sekunder, spela in MST under 30 sekunder, och registrera fluorescens för ytterligare fem sekunder efter inaktivering av laser t o övervaka tillbaka diffusion av molekyler.
  5. Justera lasereffekten till 20% i respektive avsnitt av styrmjukvaran.
    OBS: För att få den bästa signal-brusförhållande och för att undvika ospecifika effekter, är en lasereffekt av 20-40% rekommenderas. I särskilda fall kan en högre lasereffekt krävs för att få en god separation av obundna och bundna molekyler.
  6. Spara experimentet efter att ha valt destinationsmappen och starta MST mätningen genom att trycka på "" Start MST mätning knappen ".
    OBS! .ntp Fil skapas i målmappen. Med hjälp av denna inställning, varar en mätning 10-15 min.
  7. Upprepa den experimentella proceduren minst två gånger för en mer noggrann bestämning av EC 50 värde.
    OBS: För att testa teknisk reproducerbarhet, kan samma kapillärer skannas flera gånger (tekniska upprepningar).

7. MST Data Analysis

nt "> OBS! analysprogram möjliggör analys av uppgifter om fl y under mätningen analysprogram plottar MST tids spår och förändringar i den normaliserade fl uorescence (F norm) kontra ligandkoncentrationen 37..

  1. Starta MST analysprogram (MO.Affinity Analysis) och ladda .ntp filen från destinationsmappen. Välj "MST" som typ analysen i datavalsmeny.
    OBS: Vid ligandberoende fluorescenseffekter, kan den initiala fluorescens väljas för analys.
  2. Tillsätt respektive teknisk eller biologisk run (s) till en ny analys genom att dra-och-släpp eller genom att trycka på "+" knappen under respektive experimentkörning.
  3. Tryck på informationsknappen under respektive försökskörning för att få information om egenskaperna hos experimentet MST spår, kapillär scan, kapillär form, initial fluorescens, och blekningshastighet.
    OBS: Dessa rådata kan alså kontrolleras i senare steg av analysen.
  4. Inspektera MST spår för aggregering och nederbörd effekter, syns som stötar och spikar.
    OBS: För mer information om att upptäcka och hantering av aggregering effekter, läsa diskussionen.
  5. Inspektera kapillär skanningen och kapillär form overlay för adsorption effekter, synligt som tillplattade eller U-formade toppar. Inspektera kapillär skanningen och den första fluorescens för fluorescenseffekter. Inspektera blekningshastigheten för fotoblekning effekter.
  6. Växla till dos-responsläge och ändra analysen inställningen till "expert" läget genom att trycka på respektive knapp. Välj "T-Jump" som MST utvärderingsstrategi.
  7. Välj "Hill" modell för kurva fi mma. De bindande parametrar kommer automatiskt att beräknas. Normalisera data genom att välja respektive typ av normalisering "jämför resultat" menyn. exporteradata antingen som en .xls eller .pdf.
    OBS: I tabellen nedan bindnings graf sammanfattar beräknade bindningsparametrar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

I denna studie var MST tillämpas för att karakterisera bindningsstället av DH25.42 DNA aptamer 18 på ATP. I motsats till andra studier som kännetecknar interaktionen av ATP eller ATP-mimicking små molekyler med proteiner slumpvis märkta med en eller flera fluoroforer 38-40, innefattar denna studie en märkt version av 7,9 kDa ssDNA aptamer med en Cy5 molekyl på 5'-änden . Olika ATP-derivat och besläktade molekyler, som alla skiljer sig från ATP i olika positioner, användes för att kartbindningsstället på ATP-molekylen. Utspädningsserie (i 16 steg, vilket minskar ligandkoncentrationen med 50% vardera) av de olika ligander framställdes och blandades med en konstant mängd av Cy5-märkt aptamer. Prover analyserades i standard kapillärer vid 25% LED och 20% lasereffekt. Rörelseprofiler (MST tid spår) registrerades och fluorescensenheter, härledda från T-Jump fasen avsattes mot liganden concentration (jämför Figur 1C). Kurvan montering utfördes med tillämpning av Hill ekvationen, vilket resulterar i EC 50 -värden. I 5 oberoende biologiska upprepningar (4 olika operatörer, 2 olika aptamer aktier, 2 olika ATP stockar), visar ATP-aptamer interaktion en negativ bindande amplitud av 6 till 13 enheter och ett genomsnittligt EC50 värde av 52,3 ± 5,0 pM (Figur 2A ). Felstaplar i bindningsdiagram och "±" som presenteras i de affinitetsdata representerar standardavvikelsen för 5 biologiska upprepningar (5 oberoende mätningar i en annan kapillär). Tidigare rapporterade affiniteter för interaktionen av DH25.42 aptamer med [2,8,5'- 3 H] -adenosin och ATP-agaros var jämförbara. Interaktionen av radioaktivt märkt adenosin med aptameren kvantifierades genom en centrifugal filteranalys, och en affinitet (Kd) av 6 ± 3 | iM bestämdes. Isokratisk eluering experiment med ATP IMMOBILized till agaros resulterat i en affinitet (Kd) av 13 ^ M 18,41.

För en bättre sida vid sida jämförelse, kan data normaliseras till den del av komplex molekyler (fraktion bunden FB) enligt följande formel:
Ekvation
där värdet (c) är den MST uppmätta värdet för koncentrationen c, fri är MST värde för den obundna tillståndet (lägst koncentration), och komplex är MST värdet för fullständigt bundet tillstånd (Figur 2B). Denna normalisering är idealisk för att jämföra resultaten av olika ligander i ett diagram, såsom visas i fig 2C. De detekterade af fi ligheter av ADP (63,6 ± 5,9 pM i biologiska dubbletter), AMP (91,6 ± 9,1 pM i biologiska dubbletter), och SAM (44,4 ± 3,2 pM i biologiska dubbletter), som skiljer sig från ATP i number av fosfatgrupper, innebär att denna position har ingen eller endast mindre inflytande på bindnings beteende aptamer (figur 2C och D). OH-gruppen vid C2-kolet i ribosen av ATP kan också uteslutas från att vara den huvudsakliga bindningsstället, som dATP också bunden av det aptamer med en något reducerad af oändligheten (64,4 ± 6,1 pM i biologiska dubbletter). Ändring av purin grupp av ATP till pyrimidinen gruppen CTP resulterade i icke-bindning av aptameren, vilket visar betydelsen av denna grupp för interaktionen. Den aptamer bunden till adenin med en affinitet av 141.7 ± 9,4 ^ M (i biologiska dubbletter), visar att bindningsstället måste vara i denna del av ATP-molekylen. De purin-molekyler GTP och ATP skiljer sig i det gröna skuggade området som visas i figur 2D, som representerar den huvudsakliga bindningsstället för aptameren på ATP. En annan studie användes icke-kvantitativa eluerings experiment med olika ATP derivat tilleluera en radiomärkt aptamer från ATP-agaros, som visade jämförbara resultat till denna MST studie 18.

figur 2
Figur 1: Micro Thermophoresis. (A) Den tekniska installationen av MST-tekniken visas. Optiken fokusera på mitten av glaskapillärer, därigenom detektera fluorescenssignalen av den optiskt synliga molekylen. En IR-laser används för att etablera en temperaturgradient i observationsfönstret av det optiska systemet. Förändringar i fluorescens kan användas för att övervaka thermophoretic rörelsen av molekylerna i lösning (B) MST tidskurva-rörelse fi l av molekyler i en temperaturgradient. Den initiala fluorescens mäts under 5 sekunder medan lasern är avstängd. Slå på lasern genererar en temperaturgradient. Efter den omedelbara T-Jump phase, i vilken fl uorescent färgämnet minskar dess signalutbyte vid värmeinduktion, tar thermophoretic rörelsen plats och observeras under 30 sek. Efter det att lasern har stängts av, molekylerna diffunderar tillbaka. (C) Resultat från en typisk MST experiment: (vänster) 16 kapillärer som innehåller samma koncentration av fluorescerande molekyl och en ökande koncentration av omärkt ligand; de MST tids spår registreras och normaliseras till sin ursprungliga fluorescens. (Höger) Den normaliserade fl uorescence; skillnaden mellan F kall och F varm plottas mot koncentrationen av liganden. En kurvanpassning av dessa uppgifter ger bindningsparametrar, såsom bindnings af oändligheten. Re-print med tillstånd från Elsevier, Methods 28; licensnummer 3890230800113. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

figur 2
Figur 2: MST dataanalys. (A) Baslinjen korrigerade normaliserade fl uorescence AF norm (‰), som härrör från MST TJump signalen plottas mot ATP-koncentration (i ^ M). Hill ekvation (EC50) tillämpades för kurvanpassning. Felgränserna representerar standardavvikelse från fem biologiska upprepningar. (B) Fraktion bundna plot av data visade i A. De respektive datauppsättningar normaliserades till den fraktion som bunden, och genomsnittet av dessa normaliserade data presenteras i bindnings grafen. Felstaplarna visar standardavvikelsen för 5 biologiska upprepningar. (C) Den fraktion bundna diagram visar en kvantitativ jämförelse (Hill fit) av de olika ligander till aptamer. Felgränserna representerar standard Devianing av två biologiska upprepningar. (D) Bindande af fi ligheter (EG 50) av olika ligander till aptameren. Det gröna skuggade området indikerar bindningsstället för aptameren på adenin grupp av ATP. Denna siffra är modifierad från Elsevier, Methods 28; licensnummer 3890230800113. Data uppsättningar från den tidigare studien är analyseras om och utvidgas inom denna studie. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3
Figur 3: Analys optimering för MST experiment. (A) proteinadsorption och klibbar effekter kan upptäckas i kapillär scan. Oregelbundna topp former, såsom tillplattade eller U-formade toppar, visar stickningen av provmaterialet till glasytan. Chängande typ kapillär (standard, premium, eller hydrofoba) kan förhindra molekyl adsorption, vilket resulterar i en vanlig toppform. (B) MST tids spår tjänar också som en kvalitetskontroll, eftersom aggregat kan detekteras det som stötar och spikar. De experimentella betingelserna kan optimeras genom att förbättra lösligheten av molekylerna (t.ex., inklusive detergenter såsom Pluronic F-127 eller varierande pH-värden eller saltkoncentrationer). Centrifugering kan bidra till att undanröja större aggregat. För att säkerställa optimal datakvalitet, bör MST tids spår likna det givna exemplet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Kvalitetskontroller:

Ospecifik klibbning / adsorption av provmaterial till ytor, liksom aggregering effekter, har en dramatisk inverkan på kvaliteten av de affinitetsdata. Men bara några state-of-the-art teknik erbjuder noggranna och snabba möjligheter att övervaka och undvika dessa effekter. MST erbjuder integrerade kvalitetskontroller som upptäcker och bidrar till att övervinna dessa frågor, gör det möjligt att stegvis optimering av den tekniska installationen. Viktig information om stickning och fluorescens effekter kan extraheras från kapillär skanna och kapillär form (steg 5,2 och 7,5), medan aggregation / fällningseffekter (steg 7,7) kan övervakas i rörelseprofiler. Dessa kontroller möjliggör för ständig förbättring av uppgifternas kvalitet och representerar viktiga steg i protokollet.

Upptäckt av adsorption effekter och felsökning:

Den kapillära scan bedrivs huvudsakligen som en initial steget att bestämma positionen av kapillärerna på brickhållaren genom att skanna fluorescensen över den. Varje topp representerar en kapillär, som anger startpunkten för den MST mätning. Visuell inspektion av toppformen möjliggör bestämning av adsorption av molekyler till glasytan, vilket är en viktig kvalitetskontroll som bör utföras före start av MST experimentet. Kapillären form overlay möjliggör enkel detektering av tillplattade, gropiga toppformer, eller till och med av toppar som liknar en U-formen, vilket indikerar adsorptionen / klibbning av molekyler till den inre glasytan av kapillären (figur 3A, övre panelen). Olika belagda kapillära slag (standard, premium och hydrofoba) hjälper till att säkerställa lösligheten och minimal adsorption av molekyler till kapillärerna. Kapillärer bör testas för deras lämplighet innan bindningsexperimenten. Detergenter såsom Tween (0,005-0,1%) eller Pluronic F127 (0,01-0,1%) may förhindrar också ospecifika adsorption effekter. Optimering i detta skede av experimentet är väsentlig för hög datakvalitet (jämför figur 3A, lägre panelen).

Upptäckt av fluorescenseffekter och felsökning:

Variationer i topphöjden av de skannade kapillärerna erbjuda ytterligare ett lager av information om provegenskaper. Slumpmässiga skillnader i kapil fluorescens kan, å ena sidan, bero på pipetteringsfel eller, å andra sidan, kommer från stora prov aggregat i avsökningsområdet, vilket kan öka fluorescensen drastiskt. Hög pipettering noggrannhet är obligatoriskt att undvika utspädningseffekter. Blandning av samtliga lösningar genom att pipettera upp och ned ökar noggrannheten ytterligare. Dessutom är det viktigt att hålla bufferten konsekvent i varje kapillär. Strategier för att hantera aggregering effekter presenteras i en senare punkt.

Systemförändringar av fluorescens med ökat sjsjunga ligandkoncentrationen ofta indikerar ligandberoende släckning / förbättringseffekter. "SD Test" genomförs i syfte att diskriminera bindande-inducerad fluorescens ändras från ospecifik fluorescens förlust; detta test övervakar fluorescensintensiteter under denaturerande betingelser. Vid ligandberoende fluorescenseffekter bör fluorescensintensiteter under denaturer tillstånd vara identiska, oberoende av koncentrationen av titreringsmedel. Om skillnaden i fluorescensintensiteter är fortfarande närvarande under dessa förhållanden, var materialet antingen förlorade på grund av ospecifik adsorption till rörväggarna eller på grund av aggregering och efterföljande centrifugering.

För att utföra SD Test, 10 | il av den första och 10 | il av det sista liganden utspädningssteget är var och en överförs försiktigt till ett nytt rör innehållande 10 fil av en 2x SD Mix (4% SDS och 40 mM DTT). Proverna blandas och molekylerna denatureras i 5 min vid 95 ° C. after fyllning proverna till kapillärerna, är fluorescensintensiteterna mättes. Om en ligandberoende fluorescens effekt upptäcks, kan data analyseras direkt genom de bindande beskeden härledas från fluorescensintensitetsförändringar.

Upptäckt av aggregering effekter och felsökning:

Ojämn, ojämna MST tids spår indikerar aggregering och / eller fällningseffekter (Figur 3B, övre panelen). Icke-aggregerat provmaterial uppvisar en ren och slät thermophoretic rörelseprofil (figur 3B, lägre panelen). Centrifugering av provmaterialet före användning (5-10 min vid 14000 xg), tillsats av detergenter (0,005-0,1% Tween-20, 0,01 till 0,1% Pluronic F-127, eller liknande), användning av BSA ( > 0,5 mg / ml), eller förändring av buffertbetingelser (pH och jonstyrka) rekommenderas för att minimera aggregering effekter och för att optimera datakvaliteten. För att få data av hög kvalitet, detär avgörande för att minimera aggregering effekter.

Dataanalys och kurvanpassning:

En thermophoretic rörelse Profilen är indelad i olika faser, som kan inspekteras antingen separat eller samtidigt. T-Jump beskriver den plötsliga förändringen i fluorescens avkastning på temperaturförändringar, vilket motsvarar en inneboende egenskap hos fluoroforer. Direkt bindning i de nära omgivningarna av fluoroforen eller konformationsförändringar vid bindning starkt påverkar T-Jump. Den långsammare thermophoresis avser förflyttning av molekyler i temperaturfältet, som erbjuder information om den övergripande strukturen av det bildade komplexet. Standard typ av dataanalys använder inställningen "Thermophoresis + T-Jump", att utnyttja båda fenomenen att bestämma bindningsparametrar. I det fall de två faserna har motsatta riktningar, är det rekommenderat att analysera faserna separat. Observera att tidseffekter och olika arter av Molecduler kan leda till skillnader i affinitet av thermophoresis och T-Jump. En annan typ av alternativ analys är manuell inställning, vilket gör det möjligt att undersöka specifika regioner i rörelseprofil. Störningar på grund av aggregation eller konvektion kan uteslutas på detta sätt. För att förbättra datakvaliteten, kan markörer sättas före sammanläggning signaler. Undersöka den tidiga thermophoresis vanligen producerar data med mindre buller, eftersom konvektion är en tidsberoende process. Denna tidiga manuell inställning rekommenderas för experiment med hög lasereffekt (80%). På att välja inställningen dataanalys, kan två passande modeller integrerade i analysprogrammet tillämpas för att passa bindningskurva. Passformen funktion för Kd från lagen om massverkan är lämpad för 1: 1 bindningssätt eller flera bindningsställen som har samma affinitet. Koncentrationen oberoende dissociationskonstanten Kd beskriver jämvikten mellan bound och obundet tillstånd; sålunda, är affiniteten hos ett bindningsställe till en ligand mäts. Koncentrationen beroende EC50 värde som härrör från Hill ekvationen representerar den effektiva dosen av en ligand vid vilken hälften av de märkta molekylerna i den bundna tillstånd. Hill passning bör tillämpas på värda bindande modeller, särskilt om de är samarbetsvilliga.

De integrerade kvalitetskontroller utgör en stor fördel av MST över tekniker som SPR eller ITC. Dessa kontroller gör det möjligt att snabbt och enkelt optimering av den tekniska installationen för att säkerställa optimal datakvalitet. Förutom de tidseffektiva mätningar (Kd i 15 min) och immobilisering fria inställning, erbjuder MST det fria valet av buffertar, som medger bedömning av molekylära interaktioner, även i lysat och serum 5,42,43. Beroende på det faktum att molekylär thermophoresis beror på storlek, laddning, och hydratisering skal av molekyler, finns det inga begränsningari storleken av de uppmätta interaktions partners under MST mätningar. Den dynamiska af oändligheten intervall, från PM till mM, tillsammans med den låga provförbrukning, avslutar styrkan i MST-teknik. Det är värt att nämna att MST genererar exakta uppgifter om grundläggande bindande parametrar, såsom affinitet, stökiometri och termodynamik. Emellertid MST tillåter inte för mätning av k på och koff priser. Dessutom måste man tänka på att de flesta MST experiment, måste en fluorescerande ändring läggas till en av interaktionspartner. Den genererade data i god överensstämmelse med state-of-the-art teknik, såsom SPR och ITC 32,43-46. Men dessa uppgifter är kvalitetskontrollerade, experimenten är snabbare, och de förbrukar mindre material. Sammantaget MST representerar en kraftfull teknik vinkelrät mot state-of-the-art-teknik, med några ytterligare fördelar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

CE och TS är anställda av 2bind GmbH, som tillhandahåller biofysiska analystjänster. Publiceringsersättningar för video-artikeln betalas av 2bind GmbH.

Acknowledgments

Författarna har inga bekräftelser.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Aptamer binding buffer 20 mM Tris pH 7.6; 300 mM NaCl; 5 mM MgCl2; 0.01% Tween-20
Fluorescently labeled ATP aptamer IDT, Leuven, Belgium sequence: DH25.42 50-Cy5-CCTGGGGGAGT-
ATTGCGGAGGAAGG-3
ATP Sigma Aldrich, Germany  A2383 10 mM stock solutions stored at - 20 °C
ADP Sigma Aldrich, Germany  A2754 10 mM stock solutions stored at - 20 °C
AMP Sigma Aldrich, Germany  A2252 10 mM stock solutions stored at - 20 °C
Adenine Sigma Aldrich, Germany  A8626 10 mM stock solutions stored at - 20 °C
SAM Sigma Aldrich, Germany  A7007 10 mM stock solutions stored at - 20 °C
dATP Sigma Aldrich, Germany  11934511001 10 mM stock solutions stored at - 20 °C
CTP Sigma Aldrich, Germany  C1506 10 mM stock solutions stored at - 20 °C
GTP Sigma Aldrich, Germany  G8877 10 mM stock solutions stored at - 20 °C
Monolith NT.115  NanoTemper Technologies, Munich, Germany MO-G008 Blue/Red Channel
MST device with standard detector, Monolith NT115 pico is MST device with high sensitivity detector
Monolith NT.115 capillaries Standard NanoTemper Technologies, Munich, Germany MO-K002
Eppendorf PCR tubes Eppendorf, Germany 30124537
Monolith control software. 2.1.33, pre-installed on the device NanoTemper Technologies, Munich, Germany
MO.affinity analysis v2.1.1 NanoTemper Technologies, Munich, Germany
Kaleidagraph 4.5.2 Synergy Software

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Linke, P., et al. An Automated Microscale Thermophoresis Screening Approach for Fragment-Based Lead Discovery. J Biomol Screen. 21 (4), 414-421 (2015).
  2. Jerabek-Willemsen, M., et al. MicroScale Thermophoresis: Interaction analysis and beyond. Journal of Molecular Structure. 1077, 101-113 (2014).
  3. Zillner, K., et al. Microscale thermophoresis as a sensitive method to quantify protein: nucleic acid interactions in solution. Methods Mol Biol. 815, 241-252 (2012).
  4. Zhang, W., Duhr, S., Baaske, P., Laue, E. Microscale thermophoresis for the assessment of nuclear protein-binding affinities. Methods Mol Biol. 1094, 269-276 (2014).
  5. Wienken, C. J., Baaske, P., Rothbauer, U., Braun, D., Duhr, S. Protein-binding assays in biological liquids using microscale thermophoresis. Nat Commun. 1, 100 (2010).
  6. Seidel, S. A., et al. Label-free microscale thermophoresis discriminates sites and affinity of protein-ligand binding. Angew Chem Int Ed Engl. 51 (42), 10656-10659 (2012).
  7. Seidel, S. A., et al. Microscale thermophoresis quantifies biomolecular interactions under previously challenging conditions. Methods. 59 (3), 301-315 (2013).
  8. Schubert, T., et al. Df31 protein and snoRNAs maintain accessible higher-order structures of chromatin. Mol Cell. 48 (3), 434-444 (2012).
  9. McKeague, M., Derosa, M. C. Challenges and opportunities for small molecule aptamer development. J Nucleic Acids. 2012, 748913 (2012).
  10. Ruscito, A., DeRosa, M. C. Small-Molecule Binding Aptamers: Selection Strategies, Characterization, and Applications. Front Chem. 4, 14 (2016).
  11. Chang, A. L., McKeague, M., Liang, J. C., Smolke, C. D. Kinetic and equilibrium binding characterization of aptamers to small molecules using a label-free, sensitive, and scalable platform. Anal Chem. 86 (7), 3273-3278 (2014).
  12. Chang, A. L., McKeague, M., Smolke, C. D. Facile characterization of aptamer kinetic and equilibrium binding properties using surface plasmon resonance. Methods Enzymol. 549, 451-466 (2014).
  13. Jing, M., Bowser, M. T. Methods for measuring aptamer-protein equilibria: a review. Anal Chim Acta. 686 (1-2), 9-18 (2011).
  14. Sokoloski, J. E., Dombrowski, S. E., Bevilacqua, P. C. Thermodynamics of ligand binding to a heterogeneous RNA population in the malachite green aptamer. Biochemistry. 51 (1), 565-572 (2012).
  15. Burnouf, D., et al. kinITC: a new method for obtaining joint thermodynamic and kinetic data by isothermal titration calorimetry. J Am Chem Soc. 134 (1), 559-565 (2012).
  16. Mannironi, C., Scerch, C., Fruscoloni, P., Tocchini-Valentini, G. P. Molecular recognition of amino acids by RNA aptamers: the evolution into an L-tyrosine binder of a dopamine-binding RNA motif. RNA. 6 (4), 520-527 (2000).
  17. Jenison, R. D., Gill, S. C., Pardi, A., Polisky, B. High-resolution molecular discrimination by RNA. Science. 263 (5152), 1425-1429 (1994).
  18. Huizenga, D. E., Szostak, J. W. A DNA aptamer that binds adenosine and ATP. Biochemistry. 34 (2), 656-665 (1995).
  19. Lee, E. R., Baker, J. L., Weinberg, Z., Sudarsan, N., Breaker, R. R. An allosteric self-splicing ribozyme triggered by a bacterial second messenger. Science. 329 (5993), 845-848 (2010).
  20. Wickiser, J. K., Cheah, M. T., Breaker, R. R., Crothers, D. M. The kinetics of ligand binding by an adenine-sensing riboswitch. Biochemistry. 44 (40), 13404-13414 (2005).
  21. Jucker, F. M., Phillips, R. M., McCallum, S. A., Pardi, A. Role of a heterogeneous free state in the formation of a specific RNA-theophylline complex. Biochemistry. 42 (9), 2560-2567 (2003).
  22. Zhao, Q., Lv, Q., Wang, H. Aptamer fluorescence anisotropy sensors for adenosine triphosphate by comprehensive screening tetramethylrhodamine labeled nucleotides. Biosens Bioelectron. 70, 188-193 (2015).
  23. Zhang, D., et al. A sensitive fluorescence anisotropy method for detection of lead (II) ion by a G-quadruplex-inducible DNA aptamer. Anal Chim Acta. 812, 161-167 (2014).
  24. Elenko, M. P., Szostak, J. W., van Oijen, A. M. Single-molecule imaging of an in vitro-evolved RNA aptamer reveals homogeneous ligand binding kinetics. J Am Chem Soc. 131 (29), 9866-9867 (2009).
  25. Elenko, M. P., Szostak, J. W., van Oijen, A. M. Single-molecule binding experiments on long time scales. Rev Sci Instrum. 81 (8), 083705 (2010).
  26. Zichel, R., Chearwae, W., Pandey, G. S., Golding, B., Sauna, Z. E. Aptamers as a sensitive tool to detect subtle modifications in therapeutic proteins. PLoS One. 7 (2), 31948 (2012).
  27. Baaske, P., Wienken, C. J., Reineck, P., Duhr, S., Braun, D. Optical thermophoresis for quantifying the buffer dependence of aptamer binding. Angew Chem Int Ed Engl. 49 (12), 2238-2241 (2010).
  28. Entzian, C., Schubert, T. Studying small molecule-aptamer interactions using MicroScale Thermophoresis (MST). Methods. 97, 27-34 (2016).
  29. Valenzano, S., et al. Screening and Identification of DNA Aptamers to Tyramine Using in Vitro Selection and High-Throughput Sequencing. ACS Comb Sci. 18 (6), 302-313 (2016).
  30. Jauset Rubio, M., et al. beta-Conglutin dual aptamers binding distinct aptatopes. Anal Bioanal Chem. 408 (3), 875-884 (2016).
  31. Breitsprecher, D., et al. Aptamer Binding Studies Using MicroScale Thermophoresis. Methods Mol Biol. 1380, 99-111 (2016).
  32. Stoltenburg, R., Schubert, T., Strehlitz, B. In vitro Selection and Interaction Studies of a DNA Aptamer Targeting Protein A. PLoS One. 10 (7), 0134403 (2015).
  33. Kinghorn, A. B., et al. Aptamer Affinity Maturation by Resampling and Microarray Selection. Anal Chem. 88 (14), 6981-6985 (2016).
  34. Duhr, S., Braun, D. Why molecules move along a temperature gradient. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (52), 19678-19682 (2006).
  35. Braun, D., Libchaber, A. Trapping of DNA by thermophoretic depletion and convection. Phys Rev Lett. 89 (18), 188103 (2002).
  36. Duhr, S., Arduini, S., Braun, D. Thermophoresis of DNA determined by microfluidic fluorescence. Eur Phys J E Soft Matter. 15 (3), 277-286 (2004).
  37. Jerabek-Willemsen, M., Wienken, C. J., Braun, D., Baaske, P., Duhr, S. Molecular interaction studies using microscale thermophoresis. Assay Drug Dev Technol. 9 (4), 342-353 (2011).
  38. He, K., Dragnea, V., Bauer, C. E. Adenylate Charge Regulates Sensor Kinase CheS3 To Control Cyst Formation in Rhodospirillum centenum. MBio. 6 (3), 00546 (2015).
  39. Brvar, M., et al. Structure-based discovery of substituted 4,5'-bithiazoles as novel DNA gyrase inhibitors. J Med Chem. 55 (14), 6413-6426 (2012).
  40. Pogorelcnik, B., et al. 4,6-Substituted-1,3,5-triazin-2(1H)-ones as monocyclic catalytic inhibitors of human DNA topoisomerase IIalpha targeting the ATP binding site. Bioorg Med Chem. 23 (15), 4218-4229 (2015).
  41. Jhaveri, S., Rajendran, M., Ellington, A. D. In vitro selection of signaling aptamers. Nat Biotechnol. 18 (12), 1293-1297 (2000).
  42. Khavrutskii, L., et al. Protein purification-free method of binding affinity determination by microscale thermophoresis. J Vis Exp. (78), (2013).
  43. Ramakrishnan, M., et al. Probing cocaine-antibody interactions in buffer and human serum. PLoS One. 7 (7), 40518 (2012).
  44. Chen, M., et al. Antiviral activity and interaction mechanisms study of novel glucopyranoside derivatives. Bioorg Med Chem Lett. 25 (18), 3840-3844 (2015).
  45. Wan, C., et al. Insights into the molecular recognition of the granuphilin C2A domain with PI(4,5)P2. Chem Phys Lipids. 186 (4,5), 61-67 (2015).
  46. Harazi, A., et al. The Interaction of UDP-N-Acetylglucosamine 2-Epimerase/N-Acetylmannosamine Kinase (GNE) and Alpha-Actinin 2 Is Altered in GNE Myopathy M743T Mutant. Mol Neurobiol. , (2016).

Tags

Biokemi liten molekyl-aptamer interaktion bindande parametrar Micro Thermophoresis bindningsaffiniteten stökiometri termodynamik nukleinsyror bindningsställe kartläggning
Kartläggning av bindningsstället för en aptamer på ATP Använda Micro Thermophoresis
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Entzian, C., Schubert, T. Mapping… More

Entzian, C., Schubert, T. Mapping the Binding Site of an Aptamer on ATP Using MicroScale Thermophoresis. J. Vis. Exp. (119), e55070, doi:10.3791/55070 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter