Abstract
Theta-Aktivität wird im septohippocampalen System erzeugt und kann mit tiefen intrahippocampal Elektroden und implantierbare Elektroenzephalographie (EEG) oder Radiotelemetrie Haltegurtsystem Ansätze werden aufgezeichnet. Pharmakologisch, Hippokampus-Theta ist heterogen (siehe dualistische Theorie) und kann in Typ I und Typ II Theta unterschieden werden. Diese einzelnen EEG-Subtypen sind im Zusammenhang mit spezifischen kognitiven und Verhaltenszustände, wie Erregung, Exploration, Lernen und Gedächtnis, höhere integrative Funktionen usw. bei neurodegenerativen Erkrankungen wie Alzheimer, strukturelle und funktionelle Veränderungen des septohippocampalen System kann zu einer Beeinträchtigung der Theta-Aktivität führen / Schwingungen. Eine Standard quantitative Analyse des hippocampal EEG umfasst eine Fast-Fourier-Transformation (FFT) basierenden Frequenzanalyse. Allerdings ist dieses Verfahren keine Details liefern über Theta-Aktivität im Allgemeinen und hochorganisierten Theta-Oszillationen im Besonderen. Um Deta zu erhalteniled Informationen über hochorganisierten theta Schwingungen im Hippocampus, haben wir einen neuen analytischen Ansatzes entwickelt. Dieser Ansatz ermöglicht eine zeit- und kosteneffektive Quantifizierung der Dauer der hochorganisierten theta Schwingungen und deren Frequenzcharakteristik.
Introduction
Theta - Aktivität im Gehirn zu unterschiedlichen kognitiven und funktionalen Zustände im Zusammenhang, einschließlich Erregung, Aufmerksamkeit, willkürliche Bewegung, Erkundungsverhalten, Aufmerksamkeit Verhalten, Lernen und Gedächtnis, somatosensorischen Integration und schnelle Augenbewegungen (REM) Schlaf 1, 2. Grundsätzlich kann Theta-Aktivität als eine rhythmische Einheit in verschiedenen Hirnregionen erzeugt werden und ist sehr gut organisiert und synchronisiert als Theta-Oszillationen. Im Folgenden werden wir uns auf die Analyse und Quantifizierung von Theta - Aktivität / Schwingungen konzentrieren , die 3, innerhalb des septohippocampalen System erzeugt werden 4. Innerhalb des Septum, GABAergic, glutamatergen und cholinergen Neuronen Projekt zum Hippocampus und tragen zur Initiierung und Aufrechterhaltung von Theta Schwingungsverhalten. Es gibt eine anhaltende Diskussion darüber , ob Hippokampus - Theta - Oszillationen im Septum initiiert werden, das heißt, 5, 6, 7.
Unabhängig von ihrer Herkunft, der Hippocampus-Theta-Oszillationen sind seit Jahren im Fokus des Interesses gewesen, vor allem in transgenen Mausmodellen. Diese Modelle erlauben für die Implantation von tiefen EEG - Elektroden und für die Aufzeichnung von Hippocampus - Theta - Oszillationen unter spezifischen kognitiven und Verhaltens Aufgaben 8. Hippokampus-Theta-Oszillationen sind heterogen in der Natur. Auf der Grundlage der so genannten dualistische Theorie der Theta - Oszillationen kann man zwischen Atropin empfindlichen Typ - II - Theta und Atropin unempfindliche Typ - I - Theta 9, 10, 11 unterscheiden. Letzteres kann typischerweise durch muskarinische M 1 / M induziert werden
Derzeit im Handel erhältliche Analysesoftware ermöglicht schnelle FFT-basierte Frequenzanalyse, beispielsweise Analyse der Leistung (P, mV 2)oder Leistungsspektrumsdichte (PSD, mV 2 / Hz). Leistung oder Leistungsspektrumsdichte (PSD) Analyse des Bereichs Theta-Frequenz gibt nur einen globalen Überblick über seine Tätigkeit. Um jedoch einen detaillierten Einblick in die kognitive und verhaltensbezogene Theta-Aktivität zu erhalten, die Analyse von hochorganisierten Theta-Oszillationen ist obligatorisch. Die Beurteilung der hochorganisierten Theta Schwingungen ist von zentraler Bedeutung im Bereich der neurodegenerativen und neuropsychiatrischen Erkrankungen. Die meisten experimentellen Krankheit Studien in transgenen Mausmodellen durchgeführt hochentwickelte neuro Ansätze zu epidurale Oberfläche und tiefe intrazerebrale EEGs aufzuzeichnen. Diese Techniken umfassen sowohl Haltegurt Systeme 16 und radiotelemetric Setups 17, 18. Theta Schwingungen können so spontan und verhaltensbezogenen Theta Schwingungen unter Langzeitaufnahmebedingungen aufgezeichnet werden. Theta-Oszillationen Zusätzlich werden Recorded folgende pharmakologische Induktion, sondern auch nach der Exposition von Tieren zu Verhaltens- oder kognitive Aufgaben oder auf sensorische Reize, wie Schwanz einklemmen.
Frühe Ansätze Theta - Oszillationen wurden beschrieben von Csicsvari et al zu charakterisieren. 19. Die Autoren entwickelt, um eine halbautomatische Werkzeug für kurzfristige Theta-Analyse (15-50 min), die nicht geeignet für Langzeit-EEG-Aufzeichnungen ist. Unsere Methode, hier beschriebene, ermöglicht die Analyse der Langzeit EEG - Aufzeichnung> 48 h 20. Csicsvari et al. 10 auch an der theta-delta - Verhältnis bezeichnet, aber keine Schwelle für die Bestimmung von hochorganisierten theta Schwingungen vorgesehen. Die Delta und Theta-Bereich Definitionen unserer Frequenzbereich Definitionen entsprechen. Da es nicht ausdrücklich erwähnt wird, gehen wir davon aus, dass eine FFT-basierte Methode von Csicsvari et al verwendet wird. die Kraft der Theta-Delta-Frequenzbänder zu berechnen. Dieswieder unterscheidet sich deutlich von unserem Verfahren kann, da wir Wavelet-basierte Amplituden auf einer großen Anzahl von Frequenzskalen (Δ Frequenzschritte (f) = 0,05 Hz), was zu einer viel höheren Genauigkeit zu berechnen. Die Dauer der individuell analysiert EEG Epoche unserer Definition ähnlich.
Klausberger et al. 21 auch die Verwendung von theta-delta - Verhältnisse für die Analyse von Langzeit - EEG - Aufzeichnungen zu machen. Allerdings gibt es drei große Unterschiede im Vergleich zu unserem Ansatz: i) die EEG - Epoche Dauer ist viel länger, dh mindestens 6 s; ii) die theta-delta-Verhältnis auf 4 eingestellt ist, der viel höher als unsere Schwelle ist, und auf verschiedenen Frequenzbereichsdefinitionen bezieht; und iii) die Leistungsdefinition ist wahrscheinlich auf einer FFT Ansatz basieren, die hohe Präzision fehlt, insbesondere für sehr kurze Zeitfenster (2 s, dh 5 Zyklen für Schwingungen mit einer Frequenz von 2,5 Hz). In solchen Fällen wird eine Wavelet-basierte Verfahren ist empfehlenswert.Eine Studie von Caplan et al. 22 Theta - Leistung allein berechnet , während die Theta-Delta - Leistungsverhältnis zu ignorieren. So nähern sich die Caplan 22 nicht zwischen kognitiven Theta reichen Prozessen begleitet von einem hohen oder niedrigen Delta unterscheiden kann.
Im folgenden Protokoll werden wir unsere analytischen Wavelet-basierten Ansatz präsentieren hochorganisierten Theta-Oszillationen im Hippocampus-EEG-Aufzeichnungen von Mäusen, um zuverlässig zu analysieren. Da dieses Verfahren automatisch arbeitet, kann es zu großen Datenmengen und Langzeit EEG-Messungen angewendet werden.
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Protocol
Alle Tierversuche wurden nach den Richtlinien des lokalen und institutionellen Rates über Animal Care (Universität Bonn, BfArM, LANUV, Deutschland) durchgeführt. Darüber hinaus wurde alle Tierversuche in Übereinstimmung mit überlegener Gesetzgebung durchgeführt, zum Beispiel der Europäischen Gemeinschaften Richtlinie des Rates vom 24. November 1986 (86/609 / EWG), oder einzelne regionale oder nationale Gesetzgebung. Spezifische Anstrengungen wurden gemacht, die Anzahl der verwendeten Tiere sowie deren Leiden zu minimieren.
1. Tierhaltung und EEG Aufnahmebedingungen
- Hausmäuse in Filter-Top-Käfigen oder benutzen individuell belüftete Käfige.
- Übertragen Mäuse aus der Tierhaltung zu ventilierte Schränke in speziellen Laborräume, die für die implantierten Tiere und telemetrischer Aufnahmen geeignet sind.
- Führen alle Tierversuche, einschließlich EEG Elektrodenimplantation und die nachfolgenden Aufnahmen unter standardisierten Bedingungen (22 ° C temtur, 12 h / 12 h Hell-Dunkel - Zyklus, 50-60% relative Luftfeuchtigkeit, Geräuschdämpfung, etc.) 18.
- Vor dem Hochfrequenzsender Implantation Haustieren in Gruppen von 3 bis 4 in klar Typ - II - Polycarbonat Käfige mit Futter und Wasser ad libitum. Sie isolieren nicht einzelne Mäuse, da dies kann Stress verursachen und stören nachfolgende Experimente und Ergebnisse.
- Verwenden Sie keine offenen Wohnbedingungen, aber ventilierte Schränke verwenden, anstatt während des Experimentierens und Aufnahme.
2. radiotelemetric EEG Elektrodenimplantation und EEG-Aufzeichnungen
- Anesthetize die Mäuse Injektion Betäubungsmitteln unter Verwendung zB ketaminehydrochloride / xylazinehydrochloride (100/10 mg / kg, intraperitoneal, ip) oder Inhalations Narkotika, zB Isofluran 17, 18.
- Für Isofluran-Narkose, positionieren Sie die Maus in eine Induktion chamber mit 4-5% Isofluran und 0,8-1% Sauerstoff oder Carbogen (5% CO 2 und 95% O 2).
- Legen Sie eine Silizium facemask auf der Nase / Mund des Tieres die gewünschte Narkosetiefe zu kontrollieren und zu vermeiden Experimentator Exposition gegenüber Isofluran ein Spülsystem mit.
- Verwenden Sie injizierbare Anästhetika, zB esketaminhydrochloride (100 mg / kg, ip) und xylazinehydrochloride (10 mg / kg, ip), wenn Inhalationsanästhesie nicht verfügbar ist.
- Überwachen Sie die Tiefe der Anästhesie durch Prüfen der Schwanz Prise Reflex, Fuß Prise Reflex und Atemfrequenz. Beachten Sie, dass die künstliche Beatmung über Intubation bei Mäusen nicht notwendig ist.
- Implantieren den Hochfrequenzsender in eine subkutane Tasche auf dem Rücken des Tieres.
- Entfernen Sie die Körperhaare aus der Kopfhaut und vorzubehandeln die rasierte Kopfhaut mit zwei Desinfektionsmittel, dh 70% Ethanol und einer Jod-basierten Gestrüpp.
- mit einem Skalpell, machenein Mittellinienschnitt auf der Kopfhaut von der Stirn bis zum nucheal Region.
- Ausgehend von der Nacken- Einschnitt, bereiten eine subkutane Tasche auf der einen Seite von der Rückseite des Tieres durch eine stumpfe Dissektion mit chirurgische Scheren durchführen oder eine chirurgische Sonde.
- Setzen Sie den Sender in die subkutane Tasche einschieben und die Überlänge des flexiblen Sender in den Beutel als auch führt. Besonderes Augenmerk Kontaminierung der Operationsstelle und Sender Implantat verhindert wird. Richtig isolieren steril von nicht sterilen Bereichen mit Vorhängen.
- Legen Sie das Versuchstier auf dem Stereotaxierahmen, zum Beispiel einer computerisierten 3D Stereotaxierahmen Gerät. Befestigen Sie den Schädel ein Nasenklemme und Ohrstangen mit.
- Vorbehandeln den Schädel mit 0,3% H 2 O 2 weitere Gewebe aus dem Schädel zu entfernen und die Schädelnähte und craniometrics Sehenswürdigkeiten, Bregma und Lambda zu beleuchten.
- Die Bohrungen an den Koordinaten der Wahl(Siehe Schritt 2.6) mit einem High-Speed-neuro Bohrer in einem drucklosen Modus mit maximaler Geschwindigkeit.
HINWEIS: Druckfreies Bohren vermeidet den plötzlichen Durchbruch des Bohrkopfes und Schäden an der Rinde. Für eine Kraniotomie ist eine neuro High-Speed-Bohrer empfohlen. Wählen Sie Standard-Drillkopfdurchmesser von 0,3 - 0,5 mm einstellen, abhängig von der Elektrodendurchmesser. - Wählen Sie sorgfältig die Elektrodentyp, wenn man bedenkt die Impedanz, Durchmesser, Beschichtung etc.
HINWEIS: Parylen beschichteten Wolfram oder Edelstahl-Elektroden sind die häufigsten. Die Elektrodentypen sollten nach experimentellen Anforderungen gewählt werden. Als Präventiv Manöver, Elektrodenspitzen vor der Implantation unter Verwendung von 70% igem Ethanol sterilisieren. Beachten Sie, dass die Elektrodenbeschichtung nicht für Hitzesterilisation nicht gestattet. - Für intrahippocampal CA1 EEG-Aufzeichnungen, ein Loch bohren stereotaxically bei folgenden Koordinaten: Bregma, -2 mm; mediolateral, 1,5 mm (rechte Hemisphäre); dorsoventrale, 1,3 mm (target Region: Ammonshorn (CA1) Pyramidenschicht). Bregma, -6,2 mm, mediolateral, 0 mm;: Für die Referenzelektrode, an den folgenden Koordinaten stereotaxische ein Loch oberhalb der Kleinhirnrinde bohren dorsoventrale, 0 mm.
HINWEIS: Die zerebelläre Elektrode dient als Pseudo Elektrode, wie das Kleinhirn eine eher stille Hirnregion ist. Die Koordinaten stereotaxische wurden aus einer Standard-Maus-Gehirnatlas abgeleitet. - Vor dem Einführen der Elektroden, so dass sie auf die gewünschte Länge zu verkürzen. Mechanisch befestigen den extracranial Teil der Elektrode auf die Edelstahl-Helix des Senders.
HINWEIS: Löten sollte vermieden werden, da dies erhebliche Rauschen in das System einbringen können. - Bringen Sie die Elektrode mit dem vertikalen Arm der stereotaktischen Gerät und legen Sie die Elektrode nach den oben genannten Koordinaten stereotaxische.
- Befestigen Sie die Elektroden mit Glasionomerzement und warten, bis der Zement vollständig ausgehärtet ist.
- Schließen Sie die Kopfhautmit Over-and-über Nähte mit nicht resorbierbaren 5-0 oder 6-0 Nahtmaterial.
- Zur postoperativen Schmerzmanagement, verwalten Carprofen (5 mg / kg, subkutan, sc) einmal pro Tag für 4 aufeinanderfolgende Tage nach der Implantation. Beachten Sie, dass Carprofen sollte vor der ersten Einschnitt (Schritt 2.2.2) injiziert werden.
- Lassen Sie die Tiere für 10 zu erholen - 14 Tage nach der Implantation, bevor die Aufnahmen und / oder Injektionsexperimente gestartet werden.
3. Spontane Aufnahmen von Theta Oszillationen und Pharmakologische Induction
- Aktivieren Sie den Hochfrequenzsender den magnetischen Schalter. Legen Sie das Tier mit seinem Heimkäfig auf der Aufnahmeplatte. Führen Sie langfristige Hippocampus-EEG-Aufzeichnungen für mindestens 24 bis 48 h.
HINWEIS: Die Analyse der EEG-Amplitude und EEG-Frequenzeigenschaften von Langzeitaufzeichnungen bietet detaillierte Einblicke in die zirkadiane Abhängigkeit von Theta-Oszillationen und deren Assoziation mit spezifischen Verhaltens undkognitiven Bedingungen / Aufgaben. Immer verbinden EEG-Aufzeichnungen mit Videoüberwachung der Versuchstiere. - Für pharmakologische Induktion von Theta-Oszillationen, eine Einzeldosis von Urethan (800 mg / kg ip) oder einer Einzeldosis einer Muscarin-Rezeptoragonisten, beispielsweise Pilocarpin (10 mg / kg ip), Arecolin (0,3 mg / kg ip) oder Oxotremorin verwalten (0,03 mg / kg ip). Vorzubehandeln Mäuse mit N-Methylscopolamin (0,5 mg / kg ip) peripheren Muscarin Reaktionen zu vermeiden. auflösen Frisch alle Medikamente in 0,9% NaCl oder Ringer-Lösung.
HINWEIS: Höhere Dosierungen von Muscarin-Rezeptor-Agonisten könnte der Anfalls Induktion bei Versuchstieren führen. Sehen Sie sich auch, dass die Dosierungen hier darstellen Sehenswürdigkeiten gegeben, die vor Dosis-Wirkungs-Studien in der Mauslinie zu untersuch erfordern. Beachten Sie, dass Urethan ist ein Mutagen und Karzinogen, das entsprechende Vorsichtsmaßnahmen bei der Lagerung und Handhabung erfordert. - Injizieren Atropin (50 mg / kg, ip) Atropin empfindlichen Typ II zu differenzierenvon Atropin unempfindliche Typ Theta I Schwingungen.
HINWEIS: Die Atropin Dosierung ist wieder art- und spannungsabhängig und vorherige Bewertung Dosis-Wirkung erforderlich ist. Der optimale Zeitpunkt von Atropin Injektion hängt von den Pharmakodynamik von Muscarin-Rezeptor-Agonisten. Zur Identifizierung von Theta-II-Typ, Atropin Injektion wird 1 h nach Urethan Verabreichung empfohlen. - Versuchen Sie, die nachfolgende Anwendung verschiedener Medikamente zu vermeiden, da die systemische Verabreichung von Medikamenten globalen Transkriptions und Translationsmuster verändert, die nachfolgende EEG-Aufzeichnungen beeinflussen. Beachten Sie, dass kurzzeitige Theta-Schwingungen können auch durch sensorische Reize, wie Schwanz- oder Pfote-Kneifen induziert werden.
- Extract / Export-Vertreter EEG Datensätze der Vorphase (Baseline) und die Nacheinspritzung Phase aus dem gesamten EEG-Aufzeichnung als ASCI oder TXT-Dateien, um die Pharmakokinetik der Medikamente unter Berücksichtigung angewendet werden und den Anforderungen der einzelnen Studienprotokoll.
4.Validierung der EEG-Elektrodenplatzierung
- Euthanize Tiere, indem sie in einer Inkubationskabine platzieren und einführen 100% Kohlendioxid. Verwenden Sie eine Füllrate von 10 bis 30% des Kammervolumens pro min mit Kohlendioxid an die vorhandene Luft in der Inkubationskammer hinzugefügt; Dies wird den Tieren in schnelle Bewusstlosigkeit mit minimaler Belastung führen.
- Entfernen Sie die Maus aus der Kammer einmal Atemstillstand auftritt und eine verblasste Augenfarbe bleibt für 2-3 min.
- Schneiden Sie die Elektroden aus rostfreiem Stahl und den Hochfrequenzsender Explantation. Enthaupten die Maus einer Schere oder einem Guillotine und entfernen das Gehirn aus dem neurocranium durch sanfte Manipulation mit chirurgischen Schere und Pinzette.
- Befestigen Sie die Gehirne in 4% Paraformaldehyd in Phosphatpuffer-Salzlösung (PBS) (pH 7,4) über Nacht. Für Kryokonservierung, übertragen Sie die Gehirne von 30% Glukose und lagern Sie sie bei 4 ° C bis zur Weiterverarbeitung.
HINWEIS: Paraformaldehyd ist als gefährlich einzustufen durch die 2012 OSHA Hazard Communication Standard (29 CFR 1910.1200). Nehmen Sie die notwendigen Vorsichtsmaßnahmen: Persönliche Schutzausrüstung verwenden, eine angemessene Belüftung und Staubbildung zu vermeiden. Darüber hinaus entfernen Zündquellen und Maßnahmen gegen elektrostatische Aufladungen treffen. Paraformaldehyd sollte nicht in die Umwelt freigesetzt werden. - Montieren Sie das extrahierte Gehirn auf dem Gewebehalter eines Kryostaten unter Verwendung eines Klebstoffs und schneiden Sie die Gehirne in 40 bis 75 & mgr; m koronalen Scheiben schneiden. Montieren Sie die Scheiben auf Glasobjektträger und färben sie mit Nissl blau mit histologischen Standardverfahren; Dieses Verfahren wird den Zweigkanal zu visualisieren, die die vorherigen Elektrodenposition widerspiegelt. Beachten Sie, dass es auch möglich ist, koronalen Scheiben aus dem nativen Gehirn zu schneiden eine vibroslicer mit
- Integrieren Sie nur diejenigen Tiere, die richtige EEG Elektrodenplatzierung Kriterien erfüllen; für den CA1-Region sollte die Spitze der Tiefenelektrode im Inneren der CA1 pyramidal Schicht lokalisiert werden.
- Nehmen Sie CA1 intrahippocampal EEGs mit einer geeigneten Abtastrate ohne a priori-Filter-Cutoff.
HINWEIS: Die Abtastrate, die Sender-spezifisch ist, bestimmt die obere Frequenzgrenze des EEG-Analyse. - Verarbeiten Sie die aufgezeichneten Daten mit einer Analyse-Software. Programm Zeit-Frequenz - Analysen und Berechnungen mit maßgeschneiderten Verfahren für die angemessene Kontrolle der Analysenmethoden (Abbildung 5) 20.
- Schneiden Sie die aufgezeichneten EEG in Abschnitte mit einer Länge von jeweils 1 h. Verwenden Sie schnellen Computer-Prozessoren, da die Rechenzeit hoch ist. Darüber hinaus Verwendung von Software machen , die 20 - Computing auf mehrere Kernel parallelisieren können.
6. EEG Datenanalyse
- Analysieren Datensegmente eine komplexe Morlet Wavelet Verwendung sowohl die Frequenz und die Amplitude der Schwingungen zu berechnen.
ANMERKUNG: Diese Wavelet (zB Ψ (x) = (π b)(- 1/2) exp (2 i π c x) exp (-x 2 / b), wobei b die Bandbreite Parameter ist, c die Mittenfrequenz und i die imaginäre Einheit) wurde in der Literatur häufig angewendet worden EEG zu studieren Daten, wie gewährleistet sie optimale Auflösung sowohl in der Frequenz und der Zeit 23, 24. - Verwenden Sie eine Bandbreite Parameter und Mittenfrequenz-Einstellung, die besonders gewichtet die Frequenzauflösung der Frequenzunterschiede auf dem 0,1-Hz-Ebene zu unterscheiden, während immer noch keine ausreichende Zeitauflösung zu vernachlässigen.
HINWEIS: Neuronale Prozesse im Gamma - Band sind 25 von kurzer Dauer, und dies kann auch wahr halten für Theta - Rhythmen. Somit muss der analytische Ansatz ausreichende zeitliche Auflösung betrachten. - Analyse der EEG-Daten in dem Frequenzbereich von 0,2 bis 12 Hz, mit einer Schrittweite von 0,1 Hz, was die typische delta einschließlich derta und alpha Frequenzbereichen.
- Stellen Sie eine automatisierte, komplexe analytische Werkzeug für die Erstellung der Theta-Frequenz-Architektur auf, die eine Standard-visuelle Inspektion von Theta-Oszillationen ersetzen kann; Dieses Verfahren ist das Theta-Detektionsverfahren (TDM) bezeichnet.
- Berechnen des Quotienten aus der maximalen Amplitude in der Theta-Frequenzbereich (3,5 bis 8,5 Hz) und die maximale Amplitude in der oberen delta Frequenzbereich (2-3,4 Hz) für die Zeitfenster von 2,5 s jeweils.
HINWEIS: Der Wert dieses Quotienten dient als Maß, um zu entscheiden, ob ein Theta-Schwingung aufgetreten ist. Die Definition des Theta Frequenzbereich variieren können auf den Funktionszustand und neuroanatomische Schaltung / System in Abhängigkeit analysiert werden. - Klassifizieren ein Segment als "Theta Schwingungs Epoche", wenn das berechnete Verhältnis in diesem Segment mehr als 1,5 ist.
ANMERKUNG: Dies gewährleistet, dass die maximale Amplitude theta mindestens 50% höher als die Amplitude in dem oberen delta Band während des verwandten 2,5-s EEGSegment. Beachten Sie, dass das Verhältnis Anpassung benötigen je nach Linie und / oder verwendeten Arten. Ein Intervall von 2,5 s eine minimale Dauer für eine Theta - Schwingung verhindert falsch-positiven Erkennungen bestimmter laut Epochen, und liegt im Bereich Definitionen anderer Publikationen 19, 26. Die obere Delta-Frequenzbereich dient als Bandsteuerfrequenz weil physiologisch relevanten Delta-Aktivität während der Nicht-Theta-Epochen erscheint, beispielsweise während des Slow-Wave-Schlaf, die sehr während Theta-Aktivität gedämpft. - Wiederholen Sie diesen Vorgang für alle 1 h Schnitt; jeder Abschnitt besteht aus 1.440 EEG-Segmente mit einer Länge von 2,5 s also jeder.
- Statistisch ausgewertet Epochen die Daten der identifizierten Theta-Schwingung.
- Berechnen Sie die Statistik der Gesamtlaufzeiten der festgestellten Theta Epochen; unterschiedliche oder vordefinierte Gruppen; Zyklen, wie hell / dunkel; und andere Parameter.
HINWEIS: Statistics kann t-Test, ANOVA oder MANOVA, auf die Variable je nach der Anzahl der Gruppen, die Bedingungen, usw. - Berechne die Statistiken der Amplitude der detektierten theta Epochen, sondern nur in der Theta-Frequenzbereich (3,5 bis 8,5 Hz).
- Bewertung der Statistiken der Frequenz der detektierten theta Epochen, sondern nur in der Theta-Frequenzbereich (3,5 bis 8,5 Hz).
HINWEIS: Die theta Frequenz eines theta Epoche wird als die Frequenz zur theta Amplitude eines theta Epoche maximale Zugehörigkeit definiert.
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Representative Results
Theta-Aktivität kann in einem weiten Bereich des zentralen Nervensystems (ZNS) Regionen aufgezeichnet werden. Hier präsentieren wir eine Analyse der Theta-Oszillationen aus dem Maus-Hippocampus. Solche Schwingungen können in verschiedenen Verhaltens- und kognitive Zustände auftreten. Es ist sehr Theta-Schwingungen unter beiden spontan langfristige, aufgabenbezogene kurzfristige und pharmakologisch induzierten Bedingungen zu analysieren, zu empfehlen.
Abbildung 1 zeigt eine repräsentative intrahippocampal CA1 Aufzeichnung unter Kontrollbedingungen. Wenn das Tier nicht in einem spontan "Theta-Zustand", der intrahippocampal EEG wird oft von großen unregelmäßig Amplitude (LIA) Aktivität. Verabreichung von Muscarin - Rezeptor - Agonisten ( zum Beispiel Arecolin Pilocarpin oder Urethan) resultiert in hochorganisierten theta Schwingungen , die durch Atropin (50 mg / kg, ip, Abbildung 1) blockiert werden kann.
(Abbildung 2) verwendet wird . Auf der Grundlage dieser Klassifizierung ist es möglich, die Gesamtdauer der Theta-Oszillationen unter spontaner Bedingungen oder bestimmte Verhaltens- und kognitiven Aufgaben zu quantifizieren.
Um eine 30-min EEG Segment (wie für pharmakologische Urethan / Atropin theta dissection) zu analysieren, führen wir zunächst eine Zeit-Frequenz-Analyse für einen Frequenzbereich von 0,2 bis 12 Hz, die die Amplitude (mV) in einem farb- zeigt codiert (Abbildung 3 A). Wie in Abbildung 3 Aktivität A, hoher Amplitude theta offensichtlich wird, die durch eine Sichtprüfung des EEG (weiße Pfeile) bestätigt wird, wird durch eine niedrige Amplitude in der Delta - Frequenzbereich begleitet. Dann werden die maximalen Amplituden dertheta (3,5-8,5 Hz) und Delta (2-3,4 Hz) Frequenzbereiche aufgetragen sind (Abbildung 3 B). Systematic Korrelationsstudien zeigten , dass das Verhältnis der maximalen Amplitude theta maximale Amplitude delta größer als 1,5, was anzeigt , hochorganisierten theta Oszillationen (Abbildung 3 C).
Abbildung 4 zeigt , wie Urethan kann hippocampal theta Oszillationen (weiße Kreise in Figur 4 II) induzieren. Urethan ist ein Multi-Target-Medikament, das Typ II theta aufgrund ihrer agonistischen Wirkung auf Muscarin-Rezeptoren auslösen. Nach einer Atropin Injektion (Abbildung 4 III), diese Typ - II - Theta - Oszillationen (Atropin empfindlichen Theta Schwingungen) werden abgeschafft. Es ist wichtig, dass die Muscarin-Rezeptor-Agonisten zu prüfen, zusätzlich zu Atropin, individuellen pharmakokinetischen Eigenschaften aufweisen, die die zeitlichen Verläufe von Theta und Theta Auftreten Blockade beeinflussen. Es sei darauf hingewiesen, daß Atropin-insensitive Typ I theta bleibt unaffektiert von Muscarin-Rezeptor-Antagonisten.
Eine Zusammenfassung des gesamten theta Detektion und Quantifizierung Werkzeug ist in Abbildung 5 dargestellt. Es ergibt sich bei der Berechnung der Amplitude, Frequenz und sum / bedeuten Theta Dauer. Im Gegensatz zu bisher beschriebenen Techniken, macht es die Verwendung eines Wavelet-basierten Ansatz mit hoher Präzision. Das Analyse-Tool hier beschrieben wird, hat mehrere Anwendungsbereiche. Theta Schwingungen werden in dem septohippocampalen System generiert und werden häufig durch neurodegenerative Prozesse beeinträchtigt, beispielsweise bei Alzheimer-Krankheit. Zahlreiche Mausmodellen der Alzheimer-Krankheit wurden beschrieben, die in der Homologie, Isomorphie und Vorhersagbarkeit variieren. Einige dieser Modelle berichtet wurden eine Reduktion der Theta-Aktivität aufweisen, während andere waren eine Zunahme der Theta-Aktivität gezeigt angezeigt werden, ist der Grund für die noch bestimmt werden. Wir legten erfolgreich die Theta-Erkennung tool hier beschrieben zu charakterisieren veränderten theta Schwingungs Architektur im 5XFAD Modell der Alzheimer-Krankheit 8. Aber es könnte auch in Epilepsieforschung und neuropsychiatrischen Erkrankungen angewendet werden.
Abbildung 1: Theta Oscillations in C57BL / 6 - Mäusen. Radiotelemetric intrahippocampal CA1 Aufnahme unter spontaner Bedingungen (I) und im Anschluss an Urethan-Injektion (800 mg / kg, ip, II). Folgende Urethan Injektion werden hochorganisierten theta Schwingungen sichtbar, die durch Atropin blockiert werden kann (50 mg / kg, ip). Diese Zahl wurde von Referenz 20, mit freundlicher Genehmigung geändert. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2: Ein Wavelet-basierte Analyse einer Tiefe CA1 EEG - Aufnahme von einem C57Bl / 6 - Maus. (A und B) Zwei 2,5-s EEG Epochen dargestellt sind, visuell als nicht-Theta und Theta - Segmente sind. (C und D) Zeit-Frequenz - Analyse der Segmente CA1 EEG angezeigt in A und B im Bereich von 0,2 bis 12 Hz, wobei die Amplitude ist farbcodiert. Die Zeit-Frequenz - Analyse in C zeigt unregelmäßig, fluktuierenden theta Architektur hinsichtlich Frequenz und Zeit, während ein Segment mit hoch synchronisiert theta Oszillationen durch eine regelmäßige, nicht schwankende hohe Amplitude theta einer nahezu konstanten Frequenz von 6 Hz auszeichnet. Das Verhältnis von maximaler zu theta maximale Deltaamplitude in 1,25 C und 4,67 in D, eindeutig klassifizieren
Abbildung 3: Eine Wavelet-basierte Theta Detection Tool. (A) Zeitfrequenzanalyse einer 30 min EEG - Segment (nicht dargestellt), der folgende Urethan Verabreichung aufgezeichnet wurde. Der Komplex Morlet Wavelet-basierte Analyse wurde im Bereich von 0,2 bis 12 Hz, wobei die Amplitude (mV), die farbcodiert durchgeführt. (B) Dieses Bild zeigt die maximale Amplitude des Theta - Frequenzband (3,5 bis 8,5 Hz, grün) und dem oberen delta Band (2-3,4 Hz, rot) für den 30-min EEG - Segment. (C) Diese Figur veranschaulicht das Verhältnis der maximalen Amplitude theta(grün in B) und der maximalen Delta - Amplitude (rot in B). Beachten Sie, dass hochsynchrone Theta-Oszillationen korrelieren mit überschwellige Verhältnisse in C wurde aus Lit. 20, mit Genehmigung. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 4: Wavelet-basierte Analyse von Pharmakologisch induzierte, in hohem Grade organisierte Theta Oszillationen. Representative 30 min EEG Segmente (nicht gezeigt) sind in dem Frequenzbereich von 0-12 Hz, wobei die Amplitude (mV), die farbcodiert analysiert. Eine Urethan-Einspritzung bei 800 mg / kg, ip, resultierte in der fragmentierten Auftreten von hochorganisierten theta Schwingungen, mit einer vorherrschenden Frequenz von etwa 6 Hz (weiße Kreise). Im Anschluss an eine anropine Injektion mit 50 mg / kg, ip, diese theta Schwingungen werden abgeschafft. Diese Zahl wurde von Referenz 20, mit freundlicher Genehmigung abgedruckt. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 5: Flussdiagramm , das die Quantifizierung der Hoch organisierten Theta Oszillationen von der Murine CA1 aufgezeichnet. Typ - II - Theta - Oszillationen können mit einer Aufzeichnungssteuerung (Phase) analysiert werden, um eine Nacheinspritzung (zB Urethan, Arecolin oder Pilocarpin) Phase und eine post-Atropin Phase (A1). 30 min EEG - Segmente (A2) aus jeder Phase sind Zeit-Frequenz im Bereich von 0,2 bis 12 Hz analysiert eine Wavelet-basierten Ansatz (B1 und B2). Als nächstes Theta segment Erkennung initiiert (C1), einen genaueren Blick auf die Zeit-Frequenz - Eigenschaften des Theta - Bereich geben (3,5-8,5 Hz, C2) und dem oberen Dreieck Bereich (2-3,4 Hz, C3) für EEG - Epochen , die 2,5 s jeweils (C4 und C5). Anschließend wird die Amplitude über der Theta- und Delta - Frequenzbereich analysiert zeigt die Maximalwerte (C6 und C7). Wenn die maximale Amplitude von Theta / Delta 1,5 überschreitet, wird das 2,5 s EEG - Segment als eine Epoche der hochorganisierten Theta Oszillation (C8) klassifiziert, mit einer definierten Amplitude und Frequenz (D1-D3). Das Theta - Erkennungstool ermöglicht die Quantifizierung von Theta - Schwingung Architektur (E1). Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
Theta-Aktivität ist von zentraler Bedeutung bei der systemischen Neurophysiologie. Es kann in verschiedenen Gehirnregionen, insbesondere im Hippocampus beobachtet werden, wo es an spezifische Verhaltens- und kognitive Zustände in Zusammenhang steht. Zusätzlich kann hippocampal theta pharmakologisch in Atropin empfindlichen Typ II und theta Atropin-insensitive Typ I differenziert werden. Typ I wird gedacht , um die Fortbewegung verbunden zu sein, wie Gehen oder Laufen 27, 28, 29, 30, 31, während Typ II während der Alarm-Immobilität Zustand beobachtet werden kann , 27, 28, 29, 30. Alarm-Immobilität Zustände können durch seltene und zufällige Ton oder taktile Reize, zum Beispiel 32 induziert werden. Typ-II-Theta wird auch pa bezogenssive Ganzkörper - Rotation 14. Während paradoxe Schlaf, beide Atropin empfindliche und Atropin-resistent sind Theta - Rhythmen vorhanden 33. Die Ruhe Unbeweglichkeit Zustand wird durch große unregelmäßige Aktivität (LIA) 27 gekennzeichnet.
Im allgemeinen kann Theta Schwingungen unter Spontanbedingungen aufgezeichnet werden, sondern auch folgende pharmakologische Induktion (beispielsweise über die Anwendung von Muscarin - Rezeptor - Agonisten, wie beispielsweise Urethan, Pilocarpin, Arecolin, Oxotremorin, etc.). Man beachte, dass, pharmakodynamisch, Urethan- ist ein Multi-Target-Medikament, das Typ II theta verbessern kann, aber auch Typ I theta hemmen. Im Gegensatz dazu Pilocarpin, Arecolin und Oxotremorin selektiv Typ-II-Theta induzieren. Abhängig von der Pharmakokinetik der Agonisten Muscarin verwendet, dauert es eine variable Menge an Zeit, bis Theta Oszillationen auftreten. Typ II wirksam durch Atropin blockiert werden. Entscheidend ist, dass die DoWeisen von muskarinischen Agonisten und Antagonisten zu induzieren und Blocktyp II Theta-Oszillationen sind art- und spannungsabhängig. Daher ist es absolut notwendig, Dosis-Wirkungs-Studien durchzuführen, um die optimale Dosis für die Induktion von Theta-Oszillationen und für ihre Blockade für eine bestimmte wissenschaftliche Frage zu entwirren. Kurz dauerhafte Theta Schwingungen können auch durch Sinnesreize ausgelöst werden, wie Schwanz- oder Pfote-Quetschung.
Es gibt verschiedene Ansätze Theta-Aktivität im allgemeinen zu charakterisieren. FFT-basierte Ansätze, die sich in kontinuierlicher oder diskontinuierlicher (Frequenzband bezogen) Leistungsspektrumsdichte (PSD) Analyse / Plots oder in einer Leistungsanalyse für die einzelnen Frequenzbänder sind Standardansätze, die wertvolle Informationen über die Frequenzeigenschaften.
Jedoch scheinen eine komplexere Einblick in Theta-Architektur zusätzliche Ansätze zu erzielen notwendig. Insbesondere könnte man in den verschiedenen Organ interessiert seinizational Zustände theta und deren Frequenzen, die direkt nicht bewertet und genau durch die zuvor genannten Verfahren. Im Gegensatz dazu stellte die neuartige Analysetechnik ist hier Wavelet-basierte und in der Lage hochorganisierten, kurzfristige Theta Schwingungen zu bewerten. Sie entsprechen nicht der Norm Theta Kraft, die auch anfallsweise, diskontinuierlich Theta-Aktivität hält. Der Fokus liegt dabei bestimmte Zeit-Frequenz-Charakteristika in der EEG-Daten zu entlocken, die für die Theta-Epochen typisch sind. Somit verhindert die neue Methode falsch-positiven Einstufungen von Theta-Epochen. Das automatisierte Verfahren garantiert die Bewertung der langanhaltende EEG-Datensätzen und enthält daher zuverlässige statistische Vergleiche von physiologischen Zyklen (Hell / Dunkel-Zyklus oder zirkadianen Rhythmik) während einer Langzeitstudien.
Dieses Protokoll ist von besonderer Bedeutung bei der Analyse von EEG-Daten aus Tiermodellen von neurodegenerativen Erkrankungen erhalten, insbesondere im CHARAKTERIsation von hochorganisierten Theta-Architektur in der septohippocampalen und andere neuronale Systeme. Komplexe und hochpräzise könnte Theta-Analyse helfen EEG Fingerabdrücke zu bestimmen, die als EEG-Biomarker in der Zukunft dienen kann.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Carprofen (Rimadyl VET - Injektionslösung) | Pfizer | PZN 0110208208 | 20ml |
| binocular surgical magnification microscope | Zeiss Stemi 2000 | 0000001003877, 4355400000000, 0000001063306, 4170530000000, 4170959255000, 4551820000000, 4170959040000, 4170959050000 | |
| Dexpanthenole (Bepanthen Wund- und Heilsalbe) | Bayer | PZN: 1578818 | |
| drapes (sterile) | Hartmann | PZN 0366787 | |
| 70% ethanol | Carl Roth | 9065.5 | |
| 0.3% / 3% hydrogene peroxide solution | Sigma | 95321 | 30% stock solution |
| gloves (sterile) | Unigloves | 1570 | |
| dental glas ionomer cement | KentDental /NORDENTA | 957 321 | |
| heat-based surgical instrument sterilizer | F.S.T. | 18000-50 | |
| high-speed dental drill | Adeor | SI-1708 | |
| Inhalation narcotic system (isoflurane) | Harvard Apparatus GmbH | 34-1352, 10-1340, 34-0422, 34-1041, 34-0401, 34-1067, 72-3044, 34-0426, 34-0387, 34-0415, 69-0230 | |
| Isoflurane | Baxter 250 ml | PZN 6497131 | |
| Ketamine | Pfizer | PZN 07506004 | |
| Lactated Ringer's solution (sterile) | Braun | L7502 | |
| Nissl staining solution | Armin Baack | BAA31712159 | |
| pads (sterile) | ReWa Krankenhausbedarf | 2003/01 | |
| Steel and tungsten electrodes parylene coated | FHC Inc., USA | UEWLGESEANND | |
| stereotaxic frame | Neurostar | 51730M | ordered at Stoelting |
| (Stereo Drive-New Motorized Stereotaxic) | |||
| tapes (sterile) | BSN medical GmbH & Co. KG | 626225 | |
| TA10ETA-F20 | DSI | 270-0042-001X | Radiofrequency transmitter 3.9 g, 1.9 cc, input voltage range ± 2.5 mV, channel bandwidth (B) 1 - 200 Hz, nominal sampling rate (f) 1,000 Hz (f = 5B) temperature operating range 34 - 41 °C warranted battery life 4 months |
| TL11M2-F20EET | DSI | 270-0124-001X | Radiofrequency transmitter 3.9 g, 1.9 cc, input voltage range ± 1.25 mV, channel bandwidth (B) 1 - 50 Hz, nominal sampling rate (f) 250 Hz (f = 5B) temperature operating range 34 - 41 °C warranted battery life 1.5 months |
| Vibroslicer 5000 MZ | Electron Microscopy Sciences | 5000-005 | |
| Xylazine (Rompun) | Bayer | PZN: 1320422 | |
| Matlab | Mathworks Inc. | programming, computing and visualization software | |
| SPSS | IBM | statistical analysis software |
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