Abstract
Teta actividade é gerado no sistema septohippocampal e podem ser gravados utilizando eléctrodos intrahipocampal profundas e implantável electroencefalografia (EEG) de radiotelemetria ou sistema de precintas abordagens. Farmacologicamente, hipocampo teta é heterogênea (ver teoria dualista) e podem ser diferenciadas em tipo I e tipo II theta. Estes subtipos de EEG individuais estão relacionadas com estados cognitivos e comportamentais específicas, tais como excitação, exploração, aprendizagem e memória, funções de integração maiores, etc Em doenças neurodegenerativas tais como a doença de Alzheimer, estrutural e alterações funcionais do sistema septohippocampal pode resultar em actividade teta prejudicada / oscilações. Uma análise quantitativa padrão do EEG do hipocampo inclui uma análise de frequência baseado Fast-Fourier-Transformation (FFT). No entanto, este procedimento não fornece detalhes sobre teta atividade em geral e altamente organizados oscilações teta em particular. A fim de obter DETAinformações iLED nas oscilações teta altamente organizados no hipocampo, desenvolvemos uma nova abordagem analítica. Esta abordagem permite a quantificação tempo e custo-efetivo da duração das oscilações teta altamente organizados e suas características de frequência.
Introduction
Theta atividade no cérebro está relacionada com diferentes estados cognitivos e funcionais, incluindo excitação, atenção, o movimento voluntário, o comportamento exploratório, o comportamento de atenção, aprendizagem e memória, a integração somatossensorial e movimento rápido dos olhos (REM) 1, 2. Principalmente, teta actividade rítmica como uma entidade pode ser gerada em diferentes regiões cerebrais e é altamente organizado e sincronizado como teta oscilações. Abaixo, vamos concentrar-se na análise e quantificação de teta atividade / oscilações que são gerados dentro do sistema septohippocampal 3, 4. Dentro do septo, gabaérgica, projecto glutamatérgicos e neurónios colinérgicos no hipocampo e contribuir para a iniciação e manutenção de teta comportamento oscilatório. Há uma discussão se a oscilações do hipocampo teta são iniciadas no septo, ou seja, 5, 6, 7.
Independentemente da sua origem, oscilações teta do hipocampo têm sido no foco de interesse durante anos, particularmente em modelos de camundongos transgênicos. Estes modelos permitem a implantação de eletrodos de EEG profundas e para a gravação de oscilações teta do hipocampo sob tarefas cognitivas e comportamentais específicas 8. oscilações do hipocampo teta são heterogéneos na natureza. Com base na assim chamada teoria dual de teta de oscilações, pode-se diferenciar entre sensível à atropina tipo II e atropina teta-teta insensível tipo I 9, 10, 11. Este último pode, tipicamente, ser induzida por M muscarínico 1 / M
Atualmente, software analítico disponível no mercado permite a análise rápida baseada em FFT frequência, por exemplo, a análise do poder (P, mV 2)ou a densidade do espectro de potência (PSD, mV 2 / Hz). Poder ou análise de densidade de espectro de potência (PSD) da faixa de freqüência teta só dá uma visão global da sua actividade. No entanto, a fim de obter uma visão detalhada sobre a atividade theta cognitivo e relacionados com o comportamento de, a análise das oscilações teta altamente organizados é obrigatória. A avaliação das oscilações teta altamente organizados é de importância central no domínio das doenças neurodegenerativas e neuropsiquiátricas. A maioria dos estudos de doenças experimentais são realizados em modelos de ratos transgénicos utilizando abordagens neurocirúrgicas altamente sofisticados para gravar superfície epidural e EEGs intracerebrais profundas. Essas técnicas incluem ambos os sistemas tirante 16 e configurações radiotelemetric 17, 18. oscilações teta pode ser gravado como oscilações teta espontâneas e afins-comportamentais em condições de gravação de longo prazo. Além disso, teta oscilações pode ser recorded após a indução farmacológica, mas também após a exposição dos animais a tarefas comportamentais ou cognitivas ou a estímulos sensoriais, como a cauda de beliscar.
Cedo se aproxima para caracterizar teta oscilações foram descritos por Csicsvari et ai. 19. Os autores concebido uma ferramenta semi-automatizada para análise teta de curto prazo (15 - 50 min), que não é adequado para gravações de EEG de longa data. O nosso método, descrito aqui, permite a análise do registo de EEG de longa duração> 48 h 20. Csicsvari et ai. 10 também se refere ao rácio de teta-delta, mas nenhum limite para a determinação de oscilações teta altamente organizado é fornecida. As definições de gama delta e teta coincidir com as nossas definições de faixas de freqüência. Como não é explicitamente mencionada, presumimos que um método baseado em FFT é usado por Csicsvari et al. para calcular o poder das faixas de frequências teta-delta. estenovamente difere claramente do nosso método, uma vez que calcular as amplitudes baseado no wavelet em um grande número de escalas de frequência (frequência Δ passos (f) = 0,05 Hz), resultando em muito mais elevado de precisão. A duração do epoch EEG individualmente analisada é semelhante à nossa definição.
Klausberger et ai. 21 também fazer uso de proporções de teta-delta para a análise de EEG de longo prazo. No entanto, existem três diferenças importantes, em comparação com a nossa abordagem: i) a duração epoch EEG é muito mais longo, ou seja, pelo menos, 6 s; ii) a razão de teta-delta é ajustado para 4, o qual é muito maior do que a nossa limiar, e está relacionada com a diferentes definições de faixa de frequências; e iii) a definição de potência é susceptível de ser baseada numa abordagem FFT, que carece de alta precisão, particularmente para janelas de tempo muito curto (2 s, ou seja, a 5 ciclos de oscilações com uma frequência de 2,5 Hz). Em tais casos, um procedimento baseado no wavelet é mais recomendável.Um estudo realizado por Caplan et al. 22 calculado apenas poder teta ignorando a razão de poder teta-delta. Assim, a aproximar Caplan 22 não é possível diferenciar entre processos cognitivos rico-teta acompanhados por um delta alto ou baixo.
No protocolo seguinte, apresentaremos a nossa abordagem baseada em wavelet analítica para analisar de forma confiável oscilações teta altamente organizados em gravações de EEG do hipocampo de ratos. Uma vez que este procedimento funciona automaticamente, que pode ser aplicado a grandes conjuntos de dados e medições EEG longo prazo.
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Protocol
Todos experimentação animal foi realizada de acordo com as orientações do Conselho local e institucional on Animal Care (Universidade de Bonn, BfArM, LANUV, Alemanha). Além disso, toda a experimentação animal foi realizada em conformidade com a legislação superior, por exemplo, a Directiva Comunidades Europeias de 24 de Novembro de 1986 (86/609 / CEE), ou a legislação regional ou nacional individual. esforço específico foi feito para minimizar o número de animais utilizados, bem como o seu sofrimento.
1. Habitação e EEG Condições de gravação de Animais
- Os ratos domésticos em filtro-top gaiolas ou usar gaiolas individualmente ventiladas.
- Transferir ratos do biotério para armários ventilados em salas especiais do laboratório que são apropriados para animais implantados e gravações de telemetria.
- Executar toda a experimentação animal, incluindo implante de eletrodos de EEG e as gravações posteriores, sob condições padronizadas (22 ° C dezratura, 12 h / 12 h claro-escuro ciclo, 50-60% de umidade relativa, atenuação de ruído, etc.) 18.
- Antes da implantação do transmissor de radiofrequência, animais de casas em grupos de 3-4 no tipo II gaiolas de policarbonato transparente, com comida e água ad libitum. Não isolar ratos individuais, pois isso pode causar estresse e interferir com a experimentação e os resultados posteriores.
- Não use as condições de habitação abertos, mas usar armários ventilados vez durante a experimentação e gravação.
2. Radiotelemetric EEG Eletrodo Implantação e EEG Recordings
- Anestesiar os ratos usando narcóticos de injecção, por exemplo, ketaminehydrochloride / xylazinehydrochloride (100/10 mg / kg, por via intraperitoneal, ip) ou de narcóticos de inalação, por exemplo, isoflurano 17, 18.
- Para anestesia isoflurano, posicione o mouse em uma indução cHamber com 4-5% de isoflurano e 0,8-1% de oxigénio ou de carbogénio (5% de CO 2 e 95% de O 2).
- Coloque uma máscara de silício no nariz / boca do animal para controlar a profundidade desejada da anestesia e para evitar a exposição experimentador isoflurano utilizando um sistema de remoção.
- Use anestésicos injectáveis, por exemplo, esketaminhydrochloride (100 mg / kg, ip) e xylazinehydrochloride (10 mg / kg, ip), se a anestesia por inalação não está disponível.
- Monitorar a profundidade da anestesia, verificando o reflexo da cauda pitada, pé reflexo pitada, e taxa de respiração. Note-se que a respiração artificial por entubação traqueal não é necessário em ratinhos.
- Implante o transmissor de radiofrequência numa bolsa subcutânea no dorso do animal.
- Remover os pêlos do corpo do couro cabeludo e pré-tratar o couro cabeludo raspado com dois desinfetantes, ou seja, 70% de etanol e uma esfoliação à base de iodo.
- Usando um bisturi, fazeruma incisão na linha média no couro cabeludo da testa até a região nucheal.
- A partir da incisão da nuca, preparar uma bolsa subcutânea de um lado do dorso do animal, efectuando uma dissecção romba usando tesouras cirúrgicas ou uma sonda cirúrgica.
- Inserir o transmissor dentro da bolsa subcutânea e depositar o excesso de comprimento do transmissor flexível leva na bolsa, bem. Preste especial atenção à prevenção da contaminação do local da cirurgia e implante transmissor. Corretamente isolar estéril de áreas não-estéreis, utilizando cortinas.
- Colocar o animal experimental sobre a estrutura estereotáxica, por exemplo, um dispositivo estereotáxico 3D computadorizado. Corrigir o crânio com uma braçadeira nariz e barras de ouvido.
- Pretreat o crânio com 0,3% de H 2 O 2 para remover adicionalmente o tecido a partir do crânio e para iluminar as suturas cranianas e craniometrics marcos, bregma e lambda.
- Faça furos nas coordenadas de escolha(Ver passo 2.6), utilizando uma broca neurocirúrgica de alta velocidade de um modo livre de pressão na velocidade máxima.
NOTA: perfuração livre de pressão evita o avanço repentino da cabeça de perfuração e danos ao córtex. Para uma craniotomia, uma broca de alta velocidade neurocirúrgico é recomendado. Escolha diâmetros padrão de perfuração de cabeça de 0,3 - 0,5 mm, dependendo do diâmetro do eléctrodo. - Cuidadosamente selecione o tipo de eletrodo, considerando a impedância, o diâmetro, revestimento, etc.
NOTA: tungsténio parileno-revestido ou aço inoxidável eléctrodos são as mais comuns. Os tipos de eléctrodos deverão ser escolhidos de acordo com os requisitos experimentais. Como uma manobra de preferência, esterilizar dicas de eletrodos antes da implantação usando 70% de etanol. Note-se que o revestimento do eléctrodo não permitir a esterilização por calor. - Para gravações CA1 EEG intra-hipocampal, faça um furo estereotáxicamente nas seguintes coordenadas: bregma, -2 mm; mediolateral, 1,5 mm (hemisfério direito); dorsoventral, 1,3 mm (targeregião t: Cornu Ammonis (CA1) camada piramidal). Para o eletrodo de referência, faça um furo acima do córtex cerebelar nos seguintes coordenadas estereotáxica: bregma, -6,2 mm, médio-lateral, 0 mm; dorsoventral, 0 mm.
NOTA: O eletrodo cerebelar serve como um eléctrodo pseudoreference, como o cerebelo é uma região do cérebro bastante silencioso. As coordenadas estereotáxicas foram derivados a partir de um atlas de cérebro de rato padrão. - Antes da inserção dos eléctrodos, encurtar-los para o comprimento requerido. Mecanicamente, cortar a parte extracraniana do eletrodo para a hélice de aço inoxidável do transmissor.
NOTA: solda deve ser evitada, pois esta pode introduzir ruído substancial no sistema. - Anexar o eléctrodo para o braço vertical do dispositivo estereotáxico e inserir o eléctrodo de acordo com as coordenadas estereotáxicas acima mencionados.
- Fixar os eletrodos com cimento de ionômero de vidro e aguarde até que o cimento esteja completamente endurecido.
- Feche o couro cabeludoutilizando sobre-e-mais de suturas com não absorvível 5-0 ou 6-0 material de sutura.
- Para a gestão da dor pós-operatória, administrar carprofeno (5 mg / kg, por via subcutânea, SC), uma vez por dia durante 4 dias consecutivos pós-implantação. Note-se que carprofeno deve ser injectado antes da incisão inicial (passo 2.2.2).
- Permitir que os animais recuperassem durante 10 - 14 dias de pós-implantação antes das gravações e / ou experiências de injecção são iniciados.
3. Recordings espontâneos de Theta oscilações e farmacológico Indução
- Ativar o transmissor de radiofreqüência usando a chave magnética. Colocar o animal com sua gaiola na placa receptor. Realizar gravações de EEG do hipocampo a longo prazo, pelo menos, 24-48 h.
NOTA: A análise de EEG amplitude e características de freqüência do EEG de gravações a longo prazo proporciona uma visão detalhada sobre a dependência circadiano de oscilações teta e sua associação com específica comportamental econdições cognitivas / tarefas. Sempre combinar gravações de EEG com monitoramento de vídeo dos animais experimentais. - Para a indução farmacológica de teta oscilações, administrar uma dose única de uretano (800 mg / kg ip) ou uma única dose de um agonista de receptores muscarinicos, por exemplo, pilocarpina (10 mg / kg ip), a arecolina (0,3 mg / kg ip) ou oxotremorina (0,03 mg / kg ip). Pré-tratamento de ratos com N-metilescopolamina (0,5 mg / kg ip) para evitar reacções muscarínicos periféricos. Recém dissolver todas as drogas em solução de NaCl ou Ringer 0,9%.
NOTA: Superior dosagens de agonistas dos receptores muscarínicos pode resultar na indução de convulsões em animais experimentais. Considere também que as dosagens aqui apresentadas representam marcos que exigem anteriores estudos dose-efeito na linha do mouse sob investigação. Note-se que uretano é mutagênico e carcinogênico que exige precauções adequadas no armazenamento e manuseio. - Injectar atropina (50 mg / kg, IP) para diferenciar sensível ao tipo II atropinade tipo atropina-insensitive I theta oscilações.
NOTA: A dose de atropina é novamente de espécies e dependentes de tensão e requer uma avaliação dose-efeito antes. O ponto de tempo óptimo de injecção atropina depende a farmacodinâmica de agonistas dos receptores muscarínicos. Para identificação do tipo II theta, a injeção de atropina é recomendado 1 h após a administração de uretano. - Tente evitar a aplicação posterior de várias drogas, como a administração da droga sistêmica altera transcrição e tradução padrões globais que influenciam EEG subsequentes. Note-se que de curta duração teta oscilações também pode ser induzida por estímulos sensoriais, tais como Cauda ou paw-beliscar.
- Extrair / conjuntos de dados representante de exportação de EEG do pré-fase (basal) e a fase pós-injeção do total de gravação EEG como arquivos ASCI ou TXT, considerando-se a farmacocinética dos medicamentos aplicados e as exigências do protocolo de estudo individual.
4.Validação de EEG Colocação de eletrodos
- Euthanize animais, colocando-os em uma câmara de incubação e introduzir 100% de dióxido de carbono. Usar uma taxa de preenchimento de 10-30% do volume da câmara por min com dióxido de carbono adicionado ao ar existente na câmara de incubação; isso vai resultar em inconsciência rápida, com o mínimo de stress para os animais.
- Remover o rato a partir da câmara, uma vez parada respiratória e uma cor dos olhos desapareceu persiste por 2-3 min.
- Corte os eletrodos de aço inoxidável e explante do transmissor de radiofrequência. Decapitar o mouse usando uma tesoura ou uma guilhotina e remover o cérebro do neurocranium por manipulação gentil com uma tesoura cirúrgica e uma pinça.
- Fixar os cérebros em 4% de paraformaldeído em tampão fosfato salino (PBS) (pH 7,4) durante a noite. Para crioprotecção, transferir os cérebros de glucose de 30% e armazená-las a 4 ° C até posterior processamento.
NOTA: O paraformaldeído é considerado perigoso pela OSHA Haz 2012ard Communication Standard (29 CFR 1910.1200). Tome as precauções necessárias: usar equipamento de protecção individual, assegurar uma ventilação adequada, e evitar a formação de poeira. Além disso, eliminar as fontes de ignição e tomar medidas de precaução contra descargas estáticas. Paraformaldeído não deve ser deitado para o meio ambiente. - Montar o cérebro extraído no suporte do tecido de um criostato, utilizando um adesivo e cortar os cérebros em 40 - 75 um fatias coronais. Montar as fatias em lâminas de vidro e manchá-las com Nissl azul usando o procedimento histológico padrão; este procedimento irá visualizar o canal ramo que reflete a posição do eletrodo anterior. Note-se que também é possível cortar fatias coronais do cérebro nativo usando um vibroslicer
- Incorporar apenas os animais que satisfazem os critérios corretos de colocação de eléctrodos de EEG; para a região CA1, a ponta do eléctrodo de fundo deve ser localizada no interior da camada piramidal CA1.
- Grave CA1 EEG intra-hipocampal com uma taxa de amostragem adequada sem a priori de corte do filtro.
Nota: A taxa de amostragem, que é específico do transmissor, determina o limite de frequência superior de análise de EEG. - Processar os dados gravados com um software de análise. Programa de tempo-frequência análises e cálculos com procedimentos feitos sob medida para o controle adequado de métodos de análise (Figura 5) 20.
- Corte o EEG registrado em seções com um comprimento de 1 h cada um. Utilize processadores de computador rápido, uma vez que o tempo de computação é alta. Além disso, fazer uso de um software que pode paralelizar computação em múltiplos kernels 20.
6. Análise de Dados de EEG
- Analisar segmentos de dados usando um complexo de Morlet Wavelet para calcular tanto a frequência ea amplitude das oscilações.
NOTA: Este wavelet (por exemplo, Ψ (x) = (π b)(- 1/2) exp (2 i π c x) exp (-x 2 / b), onde b é o parâmetro de largura de banda, c a frequência central, e eu a unidade imaginária) tem sido muitas vezes aplicada na literatura para estudar EEG de dados, uma vez que garante melhor resolução em freqüência e tempo de 23, 24. - Use uma definição de frequência parâmetro largura de banda e centro que particularmente os pesos, a resolução de frequência para distinguir as diferenças de frequência no nível de 0,1 Hz, enquanto ainda não negligenciar uma resolução de tempo suficiente.
NOTA: processos neuronais na banda gama são de curta duração 25, e isso também pode valer para teta ritmos. Assim, a abordagem analítica deve considerar resolução temporal adequada. - Analisar os dados de EEG na gama de 0,2 frequência - 12 Hz, com um passo de tamanho de 0,1 Hz, incluindo, assim, a delta típico, ota, e de frequência alfa faixas.
- Configurar uma ferramenta analítica automatizado, complexo para a elaboração da arquitetura de freqüência theta, que pode substituir uma inspeção visual padrão de teta oscilações; este procedimento é chamado de método de detecção teta (TDM).
- Calcular o quociente da amplitude máxima na faixa de freqüência teta (3,5-8,5 Hz) e a amplitude máxima na faixa de freqüência delta superior (2-3,4 Hz) para as janelas de tempo de 2,5 s cada.
NOTA: O valor desse quociente serve como uma medida para decidir se uma oscilação teta ocorreu. A definição da gama de frequências de teta pode variar dependendo do estado funcional e neuroanatômico circuitos / sistema a ser analisado. - Classificar um segmento como "época oscilatório teta", se o rácio calculado durante este segmento é superior a 1,5.
Nota: Isto garante que a amplitude máxima teta é, pelo menos, 50% maior do que a amplitude na banda superior de delta durante o 2,5-relacionada s EEGsegmento. Note-se que a proporção pode precisar de adaptação, dependendo da linha e / ou espécies usadas. Um intervalo de 2,5 s representa uma duração mínima de uma oscilação theta, impede que as detecções de falsos positivos de certas épocas ruidosos, e encontra-se dentro das definições série de outras publicações 19, 26. A faixa de freqüência delta superior serve como uma banda de frequência de controle porque a atividade delta fisiologicamente relevante aparece durante épocas não-teta, por exemplo, durante o sono de ondas lentas, que é altamente humedecido durante a atividade theta. - Repita esse procedimento para cada seção 1 h; Portanto, cada seção é composta de 1.440 segmentos de EEG com comprimentos de 2,5 s cada.
- Estatisticamente avaliar os dados das épocas de oscilação teta identificados.
- Computar as estatísticas dos tempos totais de duração das detectados teta épocas; grupos distintos ou pré-definidos; ciclos, como o claro / escuro; e outros parâmetros.
NOTA: Statios paus podem incluir t-teste, ANOVA, ou MANOVA, dependendo da variável, o número de grupos, as condições, etc. - Calcular as estatísticas da amplitude das épocas teta detectados, mas apenas na faixa de frequências teta (3,5-8,5 Hz).
- Avaliar as estatísticas da frequência das épocas teta detectados, mas apenas na faixa de freqüência teta (3,5-8,5 Hz).
NOTA: A frequência teta de uma época teta é definido como a frequência que pertencem à amplitude máxima teta de uma época teta.
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Representative Results
Teta actividade podem ser gravados em uma ampla gama de regiões do sistema nervoso central (SNC). Aqui, apresentamos uma análise da teta oscilações do hipocampo murino. Tais oscilações podem ocorrer em diferentes estados comportamentais e cognitivas. É altamente recomendável para analisar teta oscilações em ambas as de longo prazo, relacionado com a tarefa de curto prazo e as condições induzidas farmacologicamente espontâneas.
A Figura 1 ilustra uma gravação intra-hipocampal CA1 representativa sob condições de controlo. Se o animal não está em uma espontânea "estado theta", o EEG intra-hipocampal é frequentemente caracterizada por grande irregular de amplitude atividade (LIA). A administração de agonistas dos receptores muscarínicos (por exemplo, arecolina, pilocarpina, ou uretano) resulta em oscilações teta altamente organizados que podem ser bloqueadas por atropina (50 mg / kg, ip, Figura 1).
(Figura 2). Com base nessa classificação, é possível quantificar a duração total de oscilações teta sob condições espontâneas ou tarefas cognitivas e comportamentais específicas.
A fim de analisar um segmento de EEG de 30 min (como por uretano farmacológico / atropina teta dissecção), que em primeiro lugar efectuar uma análise de tempo-frequência para uma gama de frequências de 0,2-12 Hz, o que mostra a amplitude (mV) de um cor- forma codificada (Figura 3 A). Como se torna evidente na Figura 3 A, actividade teta de alta amplitude, que é confirmado por uma inspecção visual do EEG (setas brancas), é acompanhada por uma amplitude de baixa frequência na gama delta. Em seguida, as amplitudes máximas dateta (3,5-8,5 Hz) e delta (2-3,4 Hz) faixas de frequência são plotados (Figura 3 B). Estudos de correlação sistemática revelou que a razão entre a amplitude máxima de amplitude máxima teta delta, superior a 1,5, indicando oscilações teta altamente organizados (Figura 3 C).
A Figura 4 demonstra como uretano pode induzir oscilações do hipocampo teta (círculos a branco na figura 4 II). Uretano é uma droga multi-alvo que pode desencadear tipo II theta, devido a sua acção agonista sobre os receptores muscarínicos. Após uma injecção de atropina (Figura 4 III), estes tipo II oscilações teta (oscilações teta sensível à atropina) são abolidos. É importante considerar que os agonistas dos receptores muscarínicos, além de atropina, têm propriedades farmacocinéticas individuais que afectam as características de tempo de ocorrência teta e bloqueio teta. Deve notar-se que a atropina-insensível tipo I teta permanece unaffected por antagonistas dos receptores muscarinicos.
Um resumo de toda a ferramenta de detecção e quantificação de teta está descrito na Figura 5. Isso resulta no cálculo da amplitude, frequência e soma / média teta duração. Em contraste com as técnicas anteriormente descritas, que faz uso de uma abordagem baseada em wavelet com alta precisão. A ferramenta analítica descrita aqui tem vários campos de aplicação. Oscilações teta são gerados no sistema septohippocampal e são muitas vezes prejudicada por processos neurodegenerativos, por exemplo, na doença de Alzheimer. Numerosos modelos de rato da doença de Alzheimer têm sido descrito que variam em homologia, isomorfismo, e previsibilidade. Alguns destes modelos foram descritos como exibem uma redução na actividade theta, enquanto que outros mostraram para exibir um aumento na actividade theta, a razão para a qual ainda não foi determinado. Foram aplicados com sucesso a detecção teta tool descrito aqui para caracterizar a arquitetura teta oscilatório alterada no modelo 5XFAD da doença 8 de Alzheimer. No entanto, pode também ser aplicada na pesquisa epilepsia e doenças neuropsiquiátricas.
Figura 1: Theta Oscilações em ratinhos C57BL / 6. Radiotelemetric gravação CA1 intrahipocampal sob condições espontâneas (I) e a seguir à injecção de uretano (800 mg / kg, ip, II). Após a injecção de uretano, oscilações teta altamente organizadas tornar-se visível, o que pode ser bloqueada por atropina (50 mg / kg, ip). Este valor foi modificado a partir de referência 20, com permissão. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: A análise baseada em Wavelet de um EEG de gravação profunda CA1 de um C57BL / 6 mouse. (A e B) duas épocas de 2.5 s EEG são descritos, visualmente classificadas como não-teta-teta e segmentos, respectivamente. (C e D) Análise dos segmentos CA1 EEG exibidos em A e B na faixa de 0,2-12 Hz, com a amplitude sendo codificados por cores Time-frequência. A análise tempo-frequência em C exibe arquitectura irregular teta, flutuante relativos à frequência e tempo, enquanto que um segmento com oscilações teta altamente sincronizadas é caracterizada por um não-teta flutuante normal, alta amplitude de uma frequência praticamente constante de 6 Hz. A proporção máxima de teta a amplitude máxima é delta 1,25 em C e D em 4,67, classificar claramente
Figura 3: uma ferramenta de detecção Theta baseado em Wavelet. (A) análise de um segmento de 30 minutos Tempo de EEG de frequência (não mostrado) que tenha sido gravado após a administração de uretano. A análise baseada em wavelet Morlet complexo foi realizada na gama de 0,2-12 Hz, com a amplitude (mV) ser codificados por cores. (B) Esta imagem mostra a amplitude máxima da faixa de frequências theta (3,5-8,5 Hz, verde) e a banda delta superior (2-3,4 Hz, vermelho) para o segmento de EEG de 30 min. (C) Esta figura ilustra a relação entre a amplitude máxima teta(verde no B) ea amplitude delta máximo (vermelho em B). Note-se que as oscilações teta altamente sincronizadas correlacionam-se com rácios suprathreshold em C. Este valor foi reproduzido a partir de referência 20, com permissão. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Análise baseada em Wavelet de oscilações Theta farmacologicamente induzida, altamente organizados. segmentos representativos de 30 min de EEG (não mostrados) são analisadas na faixa de frequências de 0-12 Hz com a amplitude (mV) ser codificados por cores. A injeção de uretano a 800 mg / kg, ip, resultou na ocorrência fragmentada de oscilações teta altamente organizados, com uma frequência predominante de cerca de 6 Hz (círculos brancos). Na sequência de um ainjeção ropine a 50 mg / kg, ip, essas oscilações teta são abolidas. Este valor foi reproduzido a partir de referência 20, com permissão. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Fluxo de diagrama que ilustra a quantificação dos Altamente organizado Theta Oscilações gravado a partir do Murino CA1. Tipo II oscilações teta podem ser analisadas utilizando um (por exemplo, uretano, arecolina, ou pilocarpina) fase, o controlo de gravação (fase), um pós-injecção e uma fase de pós-atropina (A1). 30 min segmentos de EEG (A2) a partir de cada fase são tempo-frequência analisada na gama 0,2-12 Hz usando uma abordagem baseada em wavelet (B1 e B2). Próxima, segmen tetadetecção de t é iniciada (C1), dando um olhar mais atento às características de tempo de frequência de gama theta (3,5-8,5 Hz, C2) e a gama delta superior (2-3,4 Hz, C3) para épocas de EEG que são 2,5 s cada (C4 e C5). Subsequentemente, a amplitude é analisada ao longo da gama de frequências teta e delta que descreve os valores máximos (C6 e C7). Se a amplitude máxima de teta / delta for superior a 1,5, a 2,5 s segmento de EEG é classificada como uma época de oscilação teta altamente organizada (C8), com uma amplitude definida e frequência (D1-D3). Esta ferramenta permite a detecção de teta para a quantificação da teta arquitectura oscilação (E1). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Theta atividade é de relevância central em neurofisiologia sistêmica. Pode ser observado em várias regiões do cérebro, particularmente no hipocampo, onde ela está relacionada com os estados comportamentais e cognitivas específicas. Além disso, teta do hipocampo pode ser farmacologicamente diferenciadas em sensível à atropina tipo II e tipo I teta atropina-insensível. Tipo I é pensado para ser relacionado a locomoção, tais como caminhar ou correr 27, 28, 29, 30, 31, enquanto o tipo II pode ser observado durante o estado de alerta-imobilidade 27, 28, 29, 30. Estados Alerta-imobilidade pode ser induzida por tom ou táteis estímulos infrequentes e aleatórios, por exemplo 32. Tipo II teta também está relacionado com PAssive rotação de corpo inteiro 14. Durante o sono paradoxal, ambos os ritmos teta sensível à atropina e atropina-resistentes estão presentes 33. O estado de repouso imobilidade é caracterizada por uma grande actividade irregular (LIA) 27.
De uma maneira geral, oscilações de teta pode ser registada sob condições espontâneas, mas também após a indução farmacológica (por exemplo, através da aplicação de agonistas de receptores muscarínicos, tais como uretano, pilocarpina, arecolina, oxotremorina, etc). Note-se que, farmacodinamicamente, uretano é uma droga multi-alvo que pode melhorar teta tipo II mas também inibem tipo I teta. Em contraste, pilocarpina, arecolina e oxotremorina induz seletivamente tipo theta II. Dependendo das farmacocinética dos agonistas muscarínicos usados, é preciso uma quantidade variável de tempo até ocorrer teta oscilações. Tipo II pode ser bloqueada de forma eficaz por atropina. Criticamente, a fazersábios de agonistas e antagonistas muscarínicos para induzir e tipo de bloco II oscilações teta são de espécies e dependentes de tensão. Assim, é absolutamente essencial para a realização de estudos de dose-efeito para desvendar a dose óptima para a indução de oscilações teta e para a sua obstrução por uma questão científica específica. De curta duração teta oscilações, também pode ser induzida por estímulos sensoriais, tais como Cauda ou pata-beliscadura.
Existem diferentes abordagens para caracterizar teta atividade em geral. abordagens baseadas em FFT, resultando em contínuas ou descontínuas (relacionadas com a banda de frequência) densidade de espectro de potência (PSD) de análise / parcelas ou em uma análise de energia para várias bandas de frequências, são abordagens padrão que fornecem informações valiosas sobre as características de frequência.
No entanto, para alcançar uma visão mais complexa na arquitetura theta, as abordagens adicionais parecem ser necessárias. Em particular, pode-se estar interessado nos diferentes órgãosestados izational de teta e as suas frequências, que não pode ser directamente avaliado e com precisão por meio dos processos acima mencionados. Em contraste, a nova técnica de análise aqui apresentada é baseada em wavelet e capaz de avaliar altamente organizados, oscilações teta de curto prazo. Eles não correspondem ao poder teta padrão, que também considera paroxística, atividade teta descontínua. O foco é obter características específicas do tempo de frequência nos dados de EEG que são típicas para teta épocas. Assim, o novo método impede que as classificações falso-positivos da teta épocas. O procedimento automatizado garante a avaliação dos conjuntos de dados de longa duração e, portanto, inclui EEG comparações estatísticas de ciclos fisiológicos (ciclo de luz / escuro ou ritmicidade circadiana) durante os estudos de longo prazo.
Este protocolo é de importância especial na análise de dados de EEG obtido a partir de modelos animais de doenças neurodegenerativas, em particular no caracterização da arquitetura teta altamente organizado no septohippocampal e outros sistemas neurais. análise teta complexas e de alta precisão pode ajudar a determinar as impressões digitais de EEG que podem servir como biomarcadores de EEG no futuro.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Carprofen (Rimadyl VET - Injektionslösung) | Pfizer | PZN 0110208208 | 20ml |
| binocular surgical magnification microscope | Zeiss Stemi 2000 | 0000001003877, 4355400000000, 0000001063306, 4170530000000, 4170959255000, 4551820000000, 4170959040000, 4170959050000 | |
| Dexpanthenole (Bepanthen Wund- und Heilsalbe) | Bayer | PZN: 1578818 | |
| drapes (sterile) | Hartmann | PZN 0366787 | |
| 70% ethanol | Carl Roth | 9065.5 | |
| 0.3% / 3% hydrogene peroxide solution | Sigma | 95321 | 30% stock solution |
| gloves (sterile) | Unigloves | 1570 | |
| dental glas ionomer cement | KentDental /NORDENTA | 957 321 | |
| heat-based surgical instrument sterilizer | F.S.T. | 18000-50 | |
| high-speed dental drill | Adeor | SI-1708 | |
| Inhalation narcotic system (isoflurane) | Harvard Apparatus GmbH | 34-1352, 10-1340, 34-0422, 34-1041, 34-0401, 34-1067, 72-3044, 34-0426, 34-0387, 34-0415, 69-0230 | |
| Isoflurane | Baxter 250 ml | PZN 6497131 | |
| Ketamine | Pfizer | PZN 07506004 | |
| Lactated Ringer's solution (sterile) | Braun | L7502 | |
| Nissl staining solution | Armin Baack | BAA31712159 | |
| pads (sterile) | ReWa Krankenhausbedarf | 2003/01 | |
| Steel and tungsten electrodes parylene coated | FHC Inc., USA | UEWLGESEANND | |
| stereotaxic frame | Neurostar | 51730M | ordered at Stoelting |
| (Stereo Drive-New Motorized Stereotaxic) | |||
| tapes (sterile) | BSN medical GmbH & Co. KG | 626225 | |
| TA10ETA-F20 | DSI | 270-0042-001X | Radiofrequency transmitter 3.9 g, 1.9 cc, input voltage range ± 2.5 mV, channel bandwidth (B) 1 - 200 Hz, nominal sampling rate (f) 1,000 Hz (f = 5B) temperature operating range 34 - 41 °C warranted battery life 4 months |
| TL11M2-F20EET | DSI | 270-0124-001X | Radiofrequency transmitter 3.9 g, 1.9 cc, input voltage range ± 1.25 mV, channel bandwidth (B) 1 - 50 Hz, nominal sampling rate (f) 250 Hz (f = 5B) temperature operating range 34 - 41 °C warranted battery life 1.5 months |
| Vibroslicer 5000 MZ | Electron Microscopy Sciences | 5000-005 | |
| Xylazine (Rompun) | Bayer | PZN: 1320422 | |
| Matlab | Mathworks Inc. | programming, computing and visualization software | |
| SPSS | IBM | statistical analysis software |
References
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