Abstract
תטא פעילות נוצרת במערכת septohippocampal וניתן להקליט באמצעות אלקטרודות intrahippocampal עמוקות electroencephalography המושתלת (EEG) גישות radiotelemetry או לקשור מערכת. פרמקולוגית, תטא בהיפוקמפוס היא הטרוגנית (ראה התיאוריה הדואליסטית) והוא יכול להיות מובחן לתוך מסוג I תטא סוג II. תת EEG הבודד אלה קשורים למדינות קוגניטיביים והתנהגותיים ספציפיות, כגון עוררת, חקר, למידה וזיכרון, פונקציות אינטגרטיבי גבוהות וכו במחלות ניווניות כמו אלצהיימר, מבני ושינויים תפקודיים של מערכת septohippocampal יכול לגרום לפעילות תטא לקוית / תנודות. ניתוח כמוני התקן של EEG בהיפוקמפוס כולל ניתוח תדיר מבוסס Fast-פורייה- טרנספורמציה (FFT). עם זאת, הליך זה אינו מספק פרטים על פעילות תטא ב תנודות תטא כלליות מאוד מאורגנות בפרט. על מנת לקבל detaמידע iled על תנודות תטא מאוד מאורגן בהיפוקמפוס, פיתחנו גישה אנליטית חדשה. גישה זו מאפשרת כימות הזמן- וחסכונית של משך תנודות תטא מאוד מאורגן ומאפיינים ותדירותם.
Introduction
תטא פעילות במוח קשורה מדינות קוגניטיביים ותפקודיות שונות, כולל עוררות, קשב, תנועה רצונית, התנהגות גישוש, התנהגות תשומת לב, למידה וזיכרון, אינטגרציה חושית, ואת תנועות עיניים מהירות (REM) לישון 1, 2. בעיקר, תטא פעילות כישות קצבית יכול להיווצר באזורים מוחין שונים והוא מאורגן מסונכרן כמו תטא תנודות. להלן נבקש להתמקד בניתוח וכימות של תטא פעילות / תנודות המופקות במערכת septohippocampal 3, 4. בתוך מחצה, GABAergic, glutamatergic, ונוירונים כולינרגית פרויקט להיפוקמפוס ולתרום ייזום ותחזוקה של תטא התנהגות תנודתית. יש דיון מתמשך על אם תנודות תטא בהיפוקמפוס מבצעים יזומים מחצה, כלומר, 5, 6, 7.
לא משנה מוצאם, תנודות תטא בהיפוקמפוס כבר במוקד העניין במשך שנים, במיוחד במודלים עכבר מהונדס. מודלים אלה מאפשרים להשתלה של אלקטרודות EEG עמוקה עבור ההקלטה של תנודות תטא בהיפוקמפוס תחת משימות ספציפיות קוגניטיביים והתנהגותיים 8. תנודות בהיפוקמפוס תטא הם הטרוגניים בטבע. בהתבסס על התיאוריה הדואליסטית כביכול של תטא תנודות, אפשר להבדיל בין סוג רגיש-אטרופין השנייה תטא אטרופין רישיות מסוג I תטא 9, 10, 11. האחרון יכול להיגרם בדרך כלל על ידי M מוסקריניים 1 / M
נכון לעכשיו, התוכנה האנליטית-זמינים מסחרית המאפשרת ניתוח תדירות FFT מבוסס מהר, למשל, ניתוח של כוח (P, mV 2)או צפיפות ספקטרום ההספק (PSD, mV 2 / Hz). כוח או צפיפות ספקטרום ההספק (PSD) ניתוח מתחום התדרים תטא רק נותן סקירה עולמית של פעילותה. עם זאת, על מנת לקבל תובנה מפורטת פעילות תטא קוגניטיביים הקשורים בהתנהגות, הניתוח של תנודות תטא מאוד מאורגנות הוא חובה. ההערכה של תנודות תטא מאוד מאורגן היא בעלת חשיבות מרכזית בתחום של מחלות ניווניות של מערכת העצבים נוירופסיכיאטריות. רוב מחקרי מחל ניסיוני מתבצעים במודלי עכבר מהונדסים תוך שימוש בגישות נוירו-מאוד-מתוחכמות להקליט משטח אפידורל ואת לתרשים אק"ג תוך-מוחי עמוק. טכניקות אלו כוללות שתי מערכות לקשור 16 ו setups radiotelemetric 17, 18. ניתן להקליט תנודות תטא כמו תנודות תטא ספונטניות בהתנהגויות הקשורות בתנאי הקלטה לטווח ארוכים. בנוסף, תטא תנודות יכולות להיות recorded הבא אינדוקציה תרופתית אלא גם בעקבות חשיפת בעלי חי משימות התנהגותיות או קוגניטיביות או לגירויים חושיים, כגון צביטת זנב.
מוקדם גישות לאפיין תטא תנודות תוארו על ידי Csicsvari et al. 19. המחברים מתכננים כלי חצי אוטומטי לניתוח תטא לטווח קצר (15 - 50 דקות) כי אינו מתאים קלטות EEG ארוך זמן. השיטה שלנו, המתוארת כאן, מאפשר ניתוח של הקלטה ארוך טווח EEG> 48 שעות 20. Csicsvari et al. 10 התייחס גם יחס תטא-דלתא, אבל אין סף לקביעת תנודות תטא מאוד מאורגן מסופק. ההגדרות המגוונות דלתא תטא להתאים הגדרות טווח תדרים שלנו. כמו כן, הוא לא הזכיר במפורש, אנו מניחים כי שיטת FFT מבוסס משמש Csicsvari et al. כדי לחשב את הכוח של התדרים-דלתא תטא. זֶהשוב שונה בבירור מן השיטה שלנו, מאז אנו מחשבים אמפליטודות מבוסס ידווה על מספר רב של סולמות תדר (תדירויות צעדי Δ (f) = 0.05 הרץ), וכתוצאה מכך הדיוק גבוה בהרבה. משך תקופת EEG בנפרד נתחה דומה הגדרתנו.
Klausberger et al. 21 גם לעשות שימוש יחסי דלתא-תטא לניתוח הקלטות ארוך טווח EEG. עם זאת, ישנם שלושה הבדלים עיקריים לעומת הגישה שלנו: i) משך תקופת EEG הוא הרבה יותר, כלומר, לפחות 6 שעות; ii) יחס תטא-דלתא מוגדר 4, וזה הרבה יותר גבוה מאשר סף ביתנו, והיא קשורה להגדרות טווח תדרים שונות; ו- III) הגדרת הכח צפויה להתבסס על גישת FFT, אשר חסר דיוק גבוה, במיוחד עבור חלונות זמן קצרה מאוד (2 s, כלומר, 5 מחזורים עבור תנודות בתדירות של 2.5 הרץ). במקרים כאלה, הליך מבוסס ידווה הוא מומלץ יותר.מחקר שנערך על ידי קפלן ואח '. 22 אך ורק מחושב הכוח תטא תוך התעלמות יחס כוח דלתא-תטא. לפיכך, קפלן להתקרב 22 לא יכולים להבדיל בין תהליכים תטא עשירית קוגניטיבי מלווים דלתא גבוהה או נמוכה.
בפרוטוקול הבא, נוכל להציג גישה אדוה מבוססי האנליטית שלנו לנתח באופן מהימן תנודות תטא מאוד מאורגן בהקלטות EEG בהיפוקמפוס מעכברים. מאז הליך זה עובד באופן אוטומטי, זה יכול להיות מיושם על ערכות נתונים גדולות ומדידות ארוך טווח EEG.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל הניסויים בבעלי-חיים בוצעה על פי הנחיות המועצה המקומית ומוסדיים על טיפול בבעלי חיים (מאוניברסיטת בון, BfArM, LANUV, גרמניה). בנוסף, כל הניסויים בבעלי-החיים בוצעו בהתאם לחקיקה מעולה, למשל, הוראת מועצת הקהילות האירופיות מיום 24 בנובמבר 1986 (86/609 / EEC), או חקיקה מחוזית וארצי פרט. מאמץ מיוחד נעשה כדי למזער את מספר בעלי החיים המשמשים, כמו גם סבלם.
1. תנאי הקלטת שיכון EEG בעלי חיים
- עכברי בית בכלובים מסננים העליונים או להשתמש בכלובים בנפרד מאוורר.
- עבר עכברי ממתקן חית ארונות מאווררים בחדרי מעבדה מיוחדים המתאימים לבעלי חיים מושתלים והקלטות telemetric.
- בצע את כל הניסויים בבעלי-חיים, כולל השתלת אלקטרודה EEG ו ההקלטות הבאות, בתנאים סטנדרטיים (22 ° C TEMperature, 12 שעות / 12 שעות מחזור אור-חושך, לחות יחסית 50-60%, הנחתת רעש, וכו ') 18.
- לפני השתלת משדר גלי רדיו, בחיות בית בקבוצות של 3 - 4 בכלובים פוליקרבונט ברורים מהסוג II, עם כרצונך מזון ומים. אין לבודד עכברים בודדים, כמו זה יכול לגרום ללחץ ולהפריע ניסויים ותוצאות שלאחר מכן.
- אין להשתמש תנאי דיור פתוחים, אבל להשתמש ארונות מאווררים במקום במהלך ניסויים והקלטה.
2. השרשת אלקטרודה Radiotelemetric EEG וקלטות EEG
- להרדים את העכברים באמצעות סמים בהזרקה, למשל, ketaminehydrochloride / xylazinehydrochloride (100/10 מ"ג / ק"ג, intraperitoneally, IP) או סמים משאיפת, למשל, isoflurane 17, 18.
- עבור הרדמה isoflurane, מקם את העכבר לתוך ג אינדוקציהhamber עם 4-5% isoflurane ו 0.8-1% חמצן או carbogen (5% CO 2 ו -95% O 2).
- מניחים facemask סיליקון על האף / הפה של החיה לשלוט לעומק הרצוי של הרדמה להימנע מחשיפה הנסיין isoflurane באמצעות מערכת הדחה.
- השתמש הרדמה בזריקות, למשל, esketaminhydrochloride (100 מ"ג / ק"ג, IP) ואת xylazinehydrochloride (10 מ"ג / ק"ג, IP), אם הרדמה משאיפת אינו זמין.
- צג את עומק ההרדמה על ידי בדיקת רפלקס קמצוץ הזנב, רפלקס קמצוץ ברגל, קצב הנשימה. שים לב להנשמה מלאכותית באמצעות אינטובציה לקנה הנשימה אין צורך בעכברים.
- השתל המשדר גלי רדיו לתוך כיס תת עורית על הגב של החיה.
- הסרת שיער הגוף מן הקרקפת pretreat הקרקפת המגולחת עם שני חומרי חיטוי, כלומר, 70% אתנול ו לשפשף יוד המבוססת.
- באמצעות אזמל, לעשותנעשה חיתוך קו האמצע על הקרקפת מן המצח באזור nucheal.
- החל מ החתך העורפי, להכין כיס תת-עורי בצד אחד של החלק האחורי של החיה על ידי ביצוע דיסקציה קהה באמצעות מספרי כירורגיות או בדיקה כירורגית.
- הכנס את המשדר לתוך הכיס תת עורית ו להפקיד את אורך העודף של המשדר הגמיש מוביל לתוך הכיס גם כן. שים לב מיוחד למניעת זיהום של האתר כירורגית שתל משדר. כראוי לבודד סטרילי מאזורים לא סטריליים באמצעות וילונות.
- מניח את החיה ניסיון על מסגרת stereotaxic, למשל, מכשיר stereotaxic 3D ממוחשב. תקן את הגולגולת באמצעות מהדק אף וברי אוזן.
- Pretreat הגולגולת עם 0.3% H 2 O 2 להסרת רקמה נוספת מהגולגולת וכדי להאיר את התפרים הגולגולת וציוני דרך craniometrics, גבחת ו למבדה.
- לקדוח חורים על הקואורדינטות של בחירה(ראה שלב 2.6) באמצעות מקדח נוירוכירורגיים במהירות גבוהה במצב לחץ חינם ב מהירות מקסימלית.
הערה: קידוח ללא לחץ ימנע את הפריצה הפתאומית של מקדחת הראש פגיע בקליפת המוח. עבור craniotomy, מקדחה במהירות גבוהה נוירוכירורגיים מומלץ. בחר בקטרים תרגיל-ראש סטנדרטיים של 0.3 - 0.5 מ"מ, תלוי בקוטר האלקטרודה. - בחר בקפידה את סוג אלקטרודה, בהתחשב עכבה, קוטר, ציפוי, וכו '
הערה: אלקטרודות טונגסטן Parylene מצופה או פלדת אל-חלד הם הנפוצים ביותר. סוגי האלקטרודה צריכים להיבחר על פי דרישות ניסוי. כתכסיס מנע, לעקר טיפים אלקטרודה לפני ההשתלה באמצעות 70% אתנול. ראוי לציין, כי ציפוי האלקטרודה אינו מאפשר עיקור בחום. - עבור הקלטות intrahippocampal CA1 EEG, לקדוח חור stereotaxically בבית הקואורדינטות הבאות: גבחת, -2 מ"מ; mediolateral, 1.5 מ"מ (אונה ימנית); dorsoventral, 1.3 מ"מ (targeבאזור t: קורנו ammonis (CA1) שכבת פירמידה). עבור אלקטרודה השוואתית, לקדוח חור מעל קליפת המוח הקטן בבית קואורדינטות stereotaxic הבאים: גבחת, -6.2 מ"מ, mediolateral, 0 מ"מ; dorsoventral, 0 מ"מ.
הערה: אלקטרודה המוח הקטן משמש אלקטרודה pseudoreference, כמו המוח הקטן הוא אזור במוח די שקט. קואורדינטות stereotaxic נגזרו אטלס מוח עכבר רגיל. - לפני החדרת האלקטרודות, לקצר אותם לאותו אורך הנדרש. מבחינה מכאנית קליפ חלק extracranial של האלקטרודה לסליל הנירוסטה של המשדר.
הערה: הלחמה יש להימנע, כמו זה יכול להציג רעש משמעותי גם במערכת. - צרף את האלקטרודה לזרוע האנכית של מכשיר stereotaxic והכנס את האלקטרודה פי קואורדינטות stereotaxic הנ"ל.
- תקן האלקטרודות באמצעות מלט ionomer זכוכית לחכות עד הבטון קשיח מלא.
- סגור את הקרקפתיתר ו-פני שימוש תפרים עם חומר תפר 5-0 או 6-0 שאינם נספגים.
- לניהול כאב לאחר הניתוח, לנהל carprofen (5 מ"ג / ק"ג, תת עורי, SC) פעם ביום במשך 4 ימים רצופים ההשתלה פוסט. שים לב carprofen צריך להיות מוזרק לפני החתך הראשוני (שלב 2.2.2).
- אפשר החיות להתאושש במשך 10 - 14 יום השתלה פוסט לפני ההקלטות ו / או ניסויי הזרקה מופעלות.
3. הקלטות ספונטניות של תנודות תטא ואינדוקציה תרופתית
- הפעל את המשדר גלי רדיו באמצעות מתג מגנטי. מניח את החיה עם בכלוב בבית שלה על הצלחת המקלט. לבצע הקלטות EEG בהיפוקמפוס לטווח ארוך לפחות h 24-48.
הערה: הניתוח משרעת EEG ומאפיינים תדירים EEG של הקלטות לטווח ארוך מספקת תובנה מפורטת לתוך תלות היממה של תנודות תטא, והקישור ביניהם התנהגותיים ספציפייםתנאים / משימות קוגניטיביות. תמיד לשלב הקלטות EEG עם ניטור וידאו של חיות הניסוי. - לזירוז תרופתי של תנודות תטא, לנהל מנה בודדת של urethane (800 מ"ג / IP ק"ג) או מנה אחת של אגוניסטים לקולטן מוסקריניים, למשל pilocarpine (10 מ"ג / ק"ג ip), arecoline (0.3 מ"ג / ק"ג ip) או oxotremorine (0.03 מ"ג / ק"ג ip). Pretreat עכברים עם N-methylscopolamine (0.5 מ"ג / ק"ג ip) כדי למנוע תגובות מוסקריניים הפריפריה. טרי לפזר כל התרופות בתמיסת 0.9% NaCl או רינגר.
הערה: במינונים גבוהים יותר של אגוניסטים לקולטן מוסקריניים עלול לגרום אינדוקציה תפיסת בחיות מעבדה. שקול גם כי המינונים שניתנו כאן מייצגים ציוני דרך שדורשים מחקרים מינון בתוקף לפני בקו העכבר תחת חקירה. הערת urethane כי הוא mutagen ומסרטן הדורש אמצעי זהירות מתאים לאחסון וטיפול. - להזריק אטרופין (50 מ"ג / ק"ג, IP) להבדיל סוג אטרופין רגיש IIמסוג אטרופין רישיות שאני תטא תנודות.
הערה: מינון אטרופין הוא שוב מינים ומתח תלוי ומחייב הערכת מינון-השפעה מוקדמת. נקודת הזמן האופטימלית של הזרקת אטרופין תלויה פרמקודינמיקה של אגוניסטים לקולטן מוסקריניים. לצורך זיהוי של תטא מסוג II, הזרקת אטרופין מומלץ 1 שעות לאחר הממשל urethane. - נסה להימנע היישום הבא של מספר תרופות, כמו מנהל תרופות מערכתי משנה דפוסי תעתיק ו translational העולמיים, המשפיעים קלטות EEG לאחר מכן. שים לב קצר טווח תטא תנודות יכולים גם להיגרם על ידי גירויים חושיים, כגון אחוריים או-צביטת כפה.
- חלץ / נציג הייצוא EEG ערכות נתונים של פאזיים מראש (הבסיס) ואת השלב לאחר ההזרקה מרישום EEG הכולל כקבצי asci או TXT, בהתחשב הפרמקוקינטיקה של תרופות מיושם ואת הדרישות של פרוטוקול הלמידה העצמית.
4.אימות של EEG אלקטרודה מיקום
- להרדים בעלי חיים על ידי הצבתם בתא דגירה ולהציג 100% פחמן דו-חמצני. השתמש קצב מילוי של 10-30% מנפח התא לדקה עם פחמן דו חמצני מתווסף האוויר הקיים בתא הדגירה; זה יביא הכרה מהירה עם מתח מינימלי לבעלי החיים.
- הסר את העכבר מהאולם פעם דום נשימה מתרחשת צבע עיניים דהוי נמשך במשך 2-3 דקות.
- חותכים את אלקטרודות נירוסטה explant המשדר גלי רדיו. לערוף את העכבר באמצעות מספריים או גיליוטינה ולהסיר את המוח מן neurocranium ידי מניפולציה עדינה עם מספריים מלקחיים כירורגיים.
- תקן את המוח paraformaldehyde 4% ב חיץ מלוחים פוספט (PBS) (pH 7.4) לילה. לקבלת cryoprotection, להעביר את המוח כדי גלוקוז 30% ולאחסן אותם ב 4 ° C עד לעיבוד נוסף.
הערה: Paraformaldehyde נחשב מסוכן על ידי 2012 OSHA Haz ARD תקן תקשורת (29 CFR 1910.1200). ינקטו אמצעי זהירות נדרשים: להשתמש בציוד מגן אישי, להבטיח אוורור מתאים, למנוע היווצרות אבק. בנוסף, הסר מקורות הצתה לנקוט אמצעי זהירות נגד מהתפרקות סטטית. Paraformaldehyde אסור לשחרר לסביבה. - הר המוח חילוץ על בעל רקמה של cryostat באמצעות דבק וחתך את המוח לתוך 40 - 75 מיקרומטר פרוסות העטרה. הר הפרוס על גבי שקופיות זכוכית להכתים אותם עם כחול Nissl באמצעות הליך היסטולוגית סטנדרטי; הליך זה יהיה לחזות את הערוץ הסנף המשקף את עמדת אלקטרודה הקודמת. שים לב אפשר גם לחתוך פרוסות עטרה ממוח הילידים באמצעות vibroslicer
- שלב רק אלה חיות העומדות בקריטריוני מיקום האלקטרודה נכונים EEG; עבור ה- CA1, קצה האלקטרודה העמוק צריך להיות מקומי בתוך שכבת פירמידת CA1.
> 5. קליטת נתונים
- CA1 שיא לתרשים אק"ג intrahippocampal עם קצב דגימה מתאים ללא אפריורי מסנן חתוך.
הערה: קצב הדגימה, שהוא משדר ספציפי, קובע את היקף תדירות העליון של ניתוח EEG. - לעבד את הנתונים שנרשמו עם תוכנת ניתוח. תכנית זמן-תדר מנתח וחישובים לנהלים מחוייט עבור השליטה הנאותה של שיטות ניתוח (איור 5) 20.
- חותכים את EEG נרשם למקטעים באורך של 1 ח כל אחת. השתמש מעבדי מחשב מהירים, מאז זמן חישוב הוא גבוה. בנוסף, לעשות שימוש תוכנה שיכולה למקבל מחשוב על גרעינים מרובים 20.
6. ניתוח נתוני EEG
- לנתח פלחי נתונים באמצעות אדוה מורכבים Morlet לחשב הן את תדירות ואת משרעת של תנודות.
הערה: אדוה זה (למשל, Ψ (x) = (b π)(- 1/2) exp (2 i π ג x) exp (x 2 / ב), שבו B הוא פרמטר רוחב הפס, ג התדר המרכזי, ואני היחיד הדמיוני) לעתים קרובות יושמה בספרות ללמוד EEG נתונים, כפי שהוא מבטיח רזולוציה אופטימלית בשני תדירות ההרכבה והזמן 23, 24. - השתמש בהגדרת תדר רוחב פס פרמטר והמרכז כי במיוחד משקולות ההחלטה התדירה כדי להבחין בהבדלים התדירים במישור 0.1-הרץ ועדיין לא מזניחה החלטה מספיק זמן.
הערה: תהליכים עצביים בלהקת גמא הם קצר טווח 25, וזה יכול גם להחזיק נכון עבור תטא מקצבים. לפיכך, הגישה האנליטית חייבת לשקול פתרון זמני הולם. - לנתח את נתוני ה- EEG בתחום התדרים של 0.2 - 12 הרץ, עם גודל צעד של 0.1 הרץ, ובכך כולל הדלתא הטיפוסית,טווחי ת"א, ותדירות אלפא.
- הגדרת כלי אנליטי אוטומטי, מורכב עבור הפירוט של ארכיטקטורת תדר תטא, אשר יכול להחליף בדיקה ויזואלית רמת תטא תנודות; הליך זה נקרא שיטת הזיהוי תטא (TDM).
- לחשב את המנה של המשרעת המקסימלית בתחום התדרים תטא (3.5-8.5 הרץ) ואת המשרעת המקסימלית בתחום התדרים דלתא העליון (2-3.4 הרץ) עבור חלונות זמן של 2.5 שניות כל אחד.
הערה: הערך של מנה זו משמש כמדד להחליט אם תנודת תטא התרחשה. ההגדרה של טווח תדרי תטא יכול להשתנות בהתאם למערכת מעגלים / מדינת neuroanatomical התפקודית להיות מנותחות. - לסווג קטע כמו "עידן תנודתית תטא," אם היחס מחושב במהלך קטע זה הוא מעל 1.5.
הערה: הפעולה זו מבטיחה כי משרעת תטא המרבי היא לפחות 50% יותר מאשר משרעת בלהקת הדלתא העליונה במהלך 2.5-s EEG קשורמִגזָר. ראוי לציין, כי היחס אולי צריך הסתגלות בהתאם לקו ו / או מינים בשימוש. מרווח של 2.5 s מייצג משך מינימאלי עבור תנודת תטא, מונע לתגליות חיוביות שגויות של תקופות רועשות מסוימות, ושקרים בתוך ההגדרות המגוונות של פרסומים אחרים 19, 26. טווח תדר דלתא העליון משמש תדרים שליטים כי פעילות דלתא-רלוונטית מבחינה פיזיולוגית מופיעה במהלך תקופות בלתי תטא, למשל, בזמן שינה איטי-גל, אשר לחה מאוד במהלך פעילות תטא. - חזור על הליך זה עבור כל סעיף ח 1; סעיף ולכן, בכל מורכב 1,440 מגזרי EEG עם אורכים של 2.5 s כל אחד.
- סטטיסטית להעריך את הנתונים של תקופות תנודת תטא מזוהות.
- לחשב את הסטטיסטיקה של פעמים משך הזמן הכולל של תקופות תטא זוהה; קבוצות נפרדות או מוגדרות מראש; מחזורי, כגון אור / חושך; ופרמטרים אחרים.
הערה: Statistics עשוי לכלול מבחן t, ANOVA, או MANOVA, תלוי המשתנה, מספר קבוצות, התנאים וכו ' - חשב את הנתונים הסטטיסטיים של משרעת של התקופות תטא מזוהים, אך רק בתחום התדרים תטא (3.5 - 8.5 הרץ).
- להעריך את הנתונים הסטטיסטיים של התדר של התקופות תטא המזוהות, אך רק בתחום תדרי תטא (3.5 - 8.5 הרץ).
הערה: תדירות תטא של עידן תטא מוגדר כתדר השייכים משרעת תטא המרבי של עידן תטא.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
תטא הפעילות ניתן להקליט במגוון רחב של אזורים מערכת העצבים המרכזית (CNS). כאן, אנו מציגים ניתוח של תטא תנודות מן ההיפוקמפוס בעכברים. תנודות כאלה יכולים להתרחש במהלך מצבים התנהגותיים וקוגניטיביים שונים. מומלץ מאוד לנתח תטא תנודות תחת שני תנאים הספונטניים לטווח הארוך, משימה הקשורה לטווח קצר, ו פרמקולוגית-induced.
איור 1 מדגים הקלטה CA1 intrahippocampal נציג בתנאים מבוקרים. אם החיה אינה נמצאת ספונטנית "מדינת תטא," ה- EEG intrahippocampal מתאפיין בימים של גדול-סדיר-משרעת (LIA) פעילות. מינהל של אגוניסטים לקולטן מוסקריניים (למשל, arecoline, pilocarpine, או urethane) תוצאות תנודות תטא מאוד מאורגן שיכול להיחסם על ידי אטרופין (50 מ"ג / ק"ג, IP, איור 1).
בתוך-page = "1"> על מנת לכמת תנודות תטא מאוד מאורגנות עם רזולוצית הזמן המתאימה, כלי לגילוי תטא שמש לסווג תקופות EEG של 2.5 כמו גם שלילי-תטא או תטא-חיובי (איור 2). לפי סיווג זה, אפשר לכמת את משך הזמן הכולל של תנודות תטא בתנאים ספונטניים או משימות התנהגותיות וקוגניטיביות ספציפיים.
על מנת לנתח את קטע EEG 30 דקות (כמו עבור urethane תרופתי / אטרופין לנתיחה תטא), אנחנו הראשונים לבצע ניתוח תדירות אמת עבור טווח תדרים של 0.2-12 הרץ, אשר מציג את המשרעת (mV) בתוך color- אופנה מקודדת (איור 3 א). כפי הופך להיות ברור באיור 3, פעילות תטא גבוהה משרעת, אשר אושר על ידי בדיקה ויזואלית של EEG (חצים לבנים), מלווה משרעת נמוכה בתחום התדרים דלתא. לאחר מכן, אמפליטודות המרבי שלתטא (3.5-8.5 הרץ) ו דלתא (2-3.4 הרץ) תחומי תדרים הם זממו (איור 3 ב '). מחקרי מתאם שיטתיים חשפו כי היחס בין משרעת תטא מירבית משרעת דלתא מקסימום יעלו על 1.5, המציין תנודות תטא מאוד מאורגנים (איור 3 ג).
איור 4 מדגים כיצד urethane יכול לגרום תנודות תטא בהיפוקמפוס (עיגולים לבנים באיור 4 ב '). Urethane הוא סם רב יעד שעלול לגרום תטא סוג II בשל פעולתו agonistic על קולטנים מוסקריניים. בעקבות הזרקת אטרופין (איור 4 III), תנודות תטא סוג II אלה (תנודות תטא רגיש-אטרופין) יבוטלו. חשוב לקחת בחשבון כי אגוניסטים לקולטן מוסקריניים, בנוסף אטרופין, יש תכונות pharmacokinetic פרט המשפיעות על מאפייני זמן התרחשות תטא ומצור תטא. יצוין כי תטא מהסוג I רגיש-אטרופין נשאר unaffected ידי אנטגוניסטים לקולטן מוסקריניים.
סיכום של כלי איתור וכימות תטא כולו מתואר באיור 5. התוצאה היא החישוב של משרעת, תדירות, ואת הסכום / ובממוצע תטא. בניגוד טכניקות שתואר מעלה, זה עושה שימוש בגישה תדווה מבוססת עם דיוק גבוה. הכלי האנליטי המתואר כאן יש מספר תחומי היישום. תנודות תטא נוצרות במערכת septohippocampal ו נפגעות לעתים קרובות על ידי תהליכים ניווניות, למשל, במחלת האלצהיימר. במודלים של עכברים רבים של מחלת אלצהיימר תוארו שמשתנים הומולוגיה, איזומורפיזם, ויכולת חיזוי. חלק מן המודלים האלה דווחו להציג ירידת תטא פעילות, ואילו אחרים הוצגו להציג גידול תטא פעילות, הסיבה אשר עדיין לא נקבעה. אנחנו בהצלחה להחיל את t זיהוי תטא OOL המתואר כאן לאפיין אדריכלות תנודתית תטא שינו במודל 5XFAD של מחלת אלצהיימר 8. עם זאת, זה יכול להיות מיושם גם במחקר אפילפסיה ומחלות נוירו-פסיכיאטריות.
איור 1: תנודות תטא ב C57Bl / 6 עכברים. הקלטת CA1 intrahippocampal Radiotelemetric בתנאים ספונטניים (I) הזרקת urethane הבא (800 מ"ג / קילו, IP, II). בעקבות הזרקת urethane, תנודות תטא מאוד מאורגן להיות גלוי, אשר יכול להיחסם על ידי אטרופין (50 מ"ג / ק"ג, IP). נתון זה יש הבדל בין התייחסות 20, באישורו. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
גיל = "1"> 
איור 2: ניתוח מבוסס ידווה של הקלטה העמוקה CA1 EEG מתוך עכבר C57Bl / 6. (A ו- B) שתי תקופות EEG 2.5-s מתוארים, מסווגים חזותיים כלא תטא ומגזרי תטא, בהתאמה. (C ו- D) זמן-תדר ניתוח מגזרי EEG CA1 המוצג A ו- B בטווח של 0.2-12 הרץ, עם משרעת להיות בצבעים. הניתוח בתדירות הזמן בדו מפגין אדריכלות תטא סדיר, תנודות לגבי תדרים וזמן, בעוד קטע עם תנודות תטא מסונכרנות מאוד מאופיין תטא משרעת קבוע, שאינו משתנה גבוהה של תדר כמעט קבוע של 6 רץ. יחס תטא מירבית משרעת דלתא מרבית הוא 1.25 ב- C ו- 4.67 ברה, לסיווג בבירור
איור 3: כלי גילוי תטא מבוססי אדוה. (א) ניתוח זמן-תדר של קטע EEG 30 דקות (לא מוצג) כי נרשם לאחר נטילת urethane. Morlet המורכב ידוו מבוססי הניתוח בוצע בטווח של 0.2-12 הרץ, עם משרעת (mV) להיות בצבעים. (ב) תמונה זו מציגה את המשרעת המקסימלית של תדרי תטא (3.5-8.5 הרץ, ירוקים) ולהקת הדלתא העליונה (2-3.4 הרץ, אדום) במקטע EEG 30 דקות. (ג) נתון זה ממחיש את היחס בין משרעת תטא המרבי(ירוק B) לבין המשרעת הדלתא המרבית (אדום ב '). שים לב תנודות תטא פערים מסונכרנים לתאם עם יחסי suprathreshold ב C. נתון זה היה reprinted מ ההפניה 20, באישורו. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 4: אדוה מבוססי ניתוח-induced פרמקולוגית, מאוד מאורגן תטא תנודות. 30 דק 'נציג קטעים EEG (לא מוצג) מנותחים בתחום התדרים של 0-12 הרץ עם משרעת (mV) להיות בצבעים. זריקת urethane ב 800 מ"ג / קילו, IP, הביאה את המופע המקוטע של תנודות תטא מאוד מאורגנות, עם תדר שולט של כ -6 הרץ (עיגולים לבנים). בעקבות בהזרקת ropine ב 50 מ"ג / ק"ג, IP, תנודות תטא אלה בוטל. נתון זה היה reprinted מ ההפניה 20, באישורו. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 5: תרשים זרימה הממחיש את כימות תנודות מאוד מאורגנות תטא הקלטות מן Murine CA1. תנודות תטא Type II ניתן לנתח באמצעות שלט הקלטה (שלב), זריקת-פוסט (למשל, urethane, arecoline, או pilocarpine) שלב, ושלב שלאחר אטרופין (A1). 30 קטעים דקות EEG (A2) מכל שלב הם זמן בתדירות ניתח בטווח של 0.2-12 הרץ באמצעות אדוה מבוססי הגישה (B1 ו- B2). segmen הבא, תטאאיתור t הוא יזם (C1), נותן מבט מקרוב על המאפיינים בתדר זמן של מגוון תטא (3.5-8.5 הרץ, C2) ואת מגוון דלתא העליון (2-3.4 הרץ, C3) עבור תקופות EEG כי הם 2.5 של כל (C4 ו- C5). בהמשך לכך, משרעת מנותח על פני טווח תדר תטא ודלתא המתאר את ערכי מקסימום (C6 ו- C7). אם המשרעת המקסימלית של תטא / דלתא עולה על 1.5, במגזר 2.5 של EEG, מסווגים כנכסים בלתי עידן תנודה תטא מאוד מאורגן (C8), עם משרעת ותדירות מוגדרים (D1-D3). כלי גילוי תטא זו מאפשרת כימות של תטא אדריכלות תנודה (E1). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
תטא פעילות רלוונטית מרכזיים לנוירופיזיולוגיה מערכתית. ניתן לראות באזורי מוח שונים, במיוחד בהיפוקמפוס, שם היא קשורה מדינות התנהגותיים וקוגניטיביים ספציפיים. בנוסף, תטא בהיפוקמפוס יכול להיות מובחן פרמקולוגית לתוך סוג אטרופין רגיש תטא שאני סוג ב 'ו אטרופין רישיות. סוג אני נחשב כקשור תנועה, כגון הליכה או ריצה 27, 28, 29, 30, 31, ואילו סוג II ניתן לצפות במהלך מצב כוננות תנועה 27, 28, 29, 30. מדינות התראה-תנועה יכולות להיגרם על ידי גירויי טון או מישוש נדירים ואקראיים, למשל 32. תטא Type II גם קשור paסיבוב הגוף כולו ssive 14. במהלך שינה פרדוכסלית, הוא מקצבי תטא אטרופין רגיש עמיד אטרופין נוכחים 33. מצב מנוחה-התנועה מאופיין פעילות חריגה גדולה (LIA) 27.
באופן כללי, תנודות תטא ניתן להקליט בתנאים ספונטניים, אלא גם בעקבות אינדוקציה תרופתית (למשל, באמצעות היישום של אגוניסטים לקולטן מוסקריניים, כגון urethane, pilocarpine, arecoline, oxotremorine, וכו '). שים לב, pharmacodynamically, urethane היא תרופה רב יעד שיכול לשפר תטא סוג II אלא גם לעכב תטא שאני סוג. לעומת זאת, pilocarpine, arecoline, ו oxotremorine לגרום באופן סלקטיבי סוג II תטא. בהתאם הפרמקוקינטיקה של אגוניסטים מוסקריניים בשימוש, זה לוקח כמות משתנה של זמן עד תטא תנודות להתרחש. Type II ניתן לחסום ביעילות על ידי אטרופין. אנושות, מטלותחכמים אגוניסטים ואת יריבים מוסקריניים כדי לעודד ו תנודות תטא סוג II לחסום הם מינים ומתח תלוי. לכן, זה בהחלט הכרחי על מנת לבצע מחקרים ותוצאת המינון לפענח את המינון האופטימלי עבור האינדוקציה של תנודות תטא ועבור החסימה שלהם לשאלה מדעית ספציפית. קצר טווח תטא תנודות יכולים להיגרם גם על ידי גירויים חושיים, כגון אחוריים או-צביטת כפה.
ישנן גישות שונות כדי לאפיין את הפעילות תטא בכלל. FFT מבוסס גישות, וכתוצאה מכך רציפים או רציפים (תדירות להקה קשורה) צפיפות ספקטרום הספק (PSD) ניתוח / מגרשים או ניתוח כוח עבור תדרי פרט, הם גישות סטנדרטיות המספקות מידע רב ערך על מאפיינים תדירים.
עם זאת, כדי להשיג תובנה מורכבת יותר לתוך אדריכלות תטא, גישות נוספות נראה שיהיה צורך. בפרט, אחד שאולי יעניין האיבר השונהמדינות izational של תטא והתדרים שלהם, אשר לא ניתן להעריך באופן ישיר ומדויק על פי הנהלים הנ"ל. לעומת זאת, שיטת אנליטית הרומן המובאת כאן מבוסס תדווה מסוגל להעריך מאוד מאורגנת, תנודות תטא לטווח קצר. הם אינם עולים בקנה אחד לשלטון תטא סטנדרטי, אשר גם רואה התקפית, פעילות תטא רציפה. הדגש הוא לעורר מאפייני זמן-תדר מסוימים בנתוני EEG טיפוסיים תקופות תטא. לפיכך, השיטה החדשה מונעת סיווגים חיוביים שגויים של תטא תקופות. ההליך אוטומטית מבטיח את הערכה של ערכות נתוני EEG לטווח ארוכה ולכן כולל השוואות סטטיסטיות אמינות מחזוריות פיסיולוגי (אור / חושך מחזור או מקצב יממה) במהלך מחקרים ארוך טווח.
פרוטוקול זה הוא בעל חשיבות מיוחדת בניתוח נתוני ה- EEG המתקבל במודלים של בעלי חיים של מחלות ניווניות, במיוחד characterization אדריכלות תטא פערים המאורגן septohippocampal ומערכות עצביות אחרות. קומפלקס וניתוח תטא דיוק גבוה עשוי לעזור לקבוע טביעות אצבעות EEG שיכול לשמש כסמנים ביולוגיים EEG בעתיד.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Carprofen (Rimadyl VET - Injektionslösung) | Pfizer | PZN 0110208208 | 20ml |
| binocular surgical magnification microscope | Zeiss Stemi 2000 | 0000001003877, 4355400000000, 0000001063306, 4170530000000, 4170959255000, 4551820000000, 4170959040000, 4170959050000 | |
| Dexpanthenole (Bepanthen Wund- und Heilsalbe) | Bayer | PZN: 1578818 | |
| drapes (sterile) | Hartmann | PZN 0366787 | |
| 70% ethanol | Carl Roth | 9065.5 | |
| 0.3% / 3% hydrogene peroxide solution | Sigma | 95321 | 30% stock solution |
| gloves (sterile) | Unigloves | 1570 | |
| dental glas ionomer cement | KentDental /NORDENTA | 957 321 | |
| heat-based surgical instrument sterilizer | F.S.T. | 18000-50 | |
| high-speed dental drill | Adeor | SI-1708 | |
| Inhalation narcotic system (isoflurane) | Harvard Apparatus GmbH | 34-1352, 10-1340, 34-0422, 34-1041, 34-0401, 34-1067, 72-3044, 34-0426, 34-0387, 34-0415, 69-0230 | |
| Isoflurane | Baxter 250 ml | PZN 6497131 | |
| Ketamine | Pfizer | PZN 07506004 | |
| Lactated Ringer's solution (sterile) | Braun | L7502 | |
| Nissl staining solution | Armin Baack | BAA31712159 | |
| pads (sterile) | ReWa Krankenhausbedarf | 2003/01 | |
| Steel and tungsten electrodes parylene coated | FHC Inc., USA | UEWLGESEANND | |
| stereotaxic frame | Neurostar | 51730M | ordered at Stoelting |
| (Stereo Drive-New Motorized Stereotaxic) | |||
| tapes (sterile) | BSN medical GmbH & Co. KG | 626225 | |
| TA10ETA-F20 | DSI | 270-0042-001X | Radiofrequency transmitter 3.9 g, 1.9 cc, input voltage range ± 2.5 mV, channel bandwidth (B) 1 - 200 Hz, nominal sampling rate (f) 1,000 Hz (f = 5B) temperature operating range 34 - 41 °C warranted battery life 4 months |
| TL11M2-F20EET | DSI | 270-0124-001X | Radiofrequency transmitter 3.9 g, 1.9 cc, input voltage range ± 1.25 mV, channel bandwidth (B) 1 - 50 Hz, nominal sampling rate (f) 250 Hz (f = 5B) temperature operating range 34 - 41 °C warranted battery life 1.5 months |
| Vibroslicer 5000 MZ | Electron Microscopy Sciences | 5000-005 | |
| Xylazine (Rompun) | Bayer | PZN: 1320422 | |
| Matlab | Mathworks Inc. | programming, computing and visualization software | |
| SPSS | IBM | statistical analysis software |
References
- Vanderwolf, C. H. Hippocampal electrical activity and voluntary movement in the rat. Electroencephalogr Clin Neurophysiol. 26, 407-418 (1969).
- Kahana, M. J., Seelig, D., Madsen, J. R. Theta returns. Curr Opin Neurobiol. 11, 739-744 (2001).
- Varga, V., et al. The presence of pacemaker HCN channels identifies theta rhythmic GABAergic neurons in the medial septum. J Physiol. 586, 3893-3915 (2008).
- Takano, Y., Hanada, Y. The driving system for hippocampal theta in the brainstem: an examination by single neuron recording in urethane-anesthetized rats. Neurosci Lett. 455, 65-69 (2009).
- Goutagny, R., Manseau, F., Jackson, J., Danik, M., Williams, S. In vitro activation of the medial septum-diagonal band complex generates atropine-sensitive and atropine-resistant hippocampal theta rhythm: an investigation using a complete septohippocampal preparation. Hippocampus. 18, 531-535 (2008).
- Manseau, F., Goutagny, R., Danik, M., Williams, S. The hippocamposeptal pathway generates rhythmic firing of GABAergic neurons in the medial septum and diagonal bands: an investigation using a complete septohippocampal preparation in vitro. J Neurosci. 28, 4096-4107 (2008).
- Hangya, B., Borhegyi, Z., Szilagyi, N., Freund, T. F., Varga, V. GABAergic neurons of the medial septum lead the hippocampal network during theta activity. J Neurosci. 29, 8094-8102 (2009).
- Siwek, M. E., et al. Altered theta oscillations and aberrant cortical excitatory activity in the 5XFAD model of Alzheimer's disease. Neural Plast. 2015, 781731 (2015).
- Buzsaki, G. Theta oscillations in the hippocampus. Neuron. 33, 325-340 (2002).
- Buzsaki, G., et al. Hippocampal network patterns of activity in the mouse. Neuroscience. 116, 201-211 (2003).
- Buzsaki, G., Moser, E. I. Memory navigation and theta rhythm in the hippocampal-entorhinal system. Nat Neurosci. 16, 130-138 (2013).
- Shin, J. Theta rhythm heterogeneity in humans. Clin Neurophysiol. 121, 456-457 (2010).
- Shin, J., et al. Phospholipase C beta 4 in the medial septum controls cholinergic theta oscillations and anxiety behaviors. J Neurosci. 29, 15375-15385 (2009).
- Shin, J., Kim, D., Bianchi, R., Wong, R. K., Shin, H. S. Genetic dissection of theta rhythm heterogeneity in mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 18165-18170 (2005).
- Brown, D. A., Adams, P. R. Muscarinic suppression of a novel voltage-sensitive K+ current in a vertebrate neurone. Nature. 283, 673-676 (1980).
- Senkov, O., Mironov, A., Dityatev, A. A novel versatile hybrid infusion-multielectrode recording (HIME) system for acute drug delivery and multisite acquisition of neuronal activity in freely moving mice. Front Neurosci. 9, 425 (2015).
- Lundt, A., et al. EEG Radiotelemetry in Small Laboratory Rodents: A Powerful State-of-the Art Approach in Neuropsychiatric, Neurodegenerative, and Epilepsy Research. Neural Plast. 2016, 8213878 (2016).
- Papazoglou, A., et al. Non-restraining EEG radiotelemetry: epidural and deep intracerebral stereotaxic EEG electrode placement. J Vis Exp. (112), (2016).
- Csicsvari, J., Hirase, H., Czurko, A., Buzsaki, G. Reliability and state dependence of pyramidal cell-interneuron synapses in the hippocampus: an ensemble approach in the behaving rat. Neuron. 21, 179-189 (1998).
- Muller, R., et al. Atropine-sensitive hippocampal theta oscillations are mediated by Cav2.3 R-type Ca2+ channels. Neuroscience. 205, 125-139 (2012).
- Klausberger, T., et al. Brain-state- and cell-type-specific firing of hippocampal interneurons in vivo. Nature. 421, 844-848 (2003).
- Caplan, J. B., Madsen, J. R., Raghavachari, S., Kahana, M. J. Distinct patterns of brain oscillations underlie two basic parameters of human maze learning. J Neurophysiol. 86, 368-380 (2001).
- Montgomery, S. M., Buzsaki, G. Gamma oscillations dynamically couple hippocampal CA3 and CA1 regions during memory task performance. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 14495-14500 (2007).
- Kronland-Martinet, R., Morlet, J., Grossman, A. Analysis of sound patterns through wavelet transform. Int J Pattern Recognit Artif Intell. 1, 29 (1987).
- Buzsaki, G., Wang, X. J. Mechanisms of gamma oscillations. Annu Rev Neurosci. 35, 203-225 (2012).
- Goutagny, R., Jackson, J., Williams, S. Self-generated theta oscillations in the hippocampus. Nat Neurosci. 12, 1491-1493 (2009).
- Bland, B. H. The physiology and pharmacology of hippocampal formation theta rhythms. Prog Neurobiol. 26, 1-54 (1986).
- Leung, L. S. Generation of theta and gamma rhythms in the hippocampus. Neurosci Biobehav Rev. 22, 275-290 (1998).
- Shin, J., Talnov, A. A single trial analysis of hippocampal theta frequency during nonsteady wheel running in rats. Brain Res. 897, 217-221 (2001).
- Shin, J. A unifying theory on the relationship between spike trains, EEG, and ERP based on the noise shaping/predictive neural coding hypothesis. Biosystems. 67, 245-257 (2002).
- Kramis, R., Vanderwolf, C. H., Bland, B. H. Two types of hippocampal rhythmical slow activity in both the rabbit and the rat: relations to behavior and effects of atropine, diethyl ether, urethane, and pentobarbital. Exp Neurol. 49, 58-85 (1975).
- Lu, B. L., Shin, J., Ichikawa, M. Massively parallel classification of single-trial EEG signals using a min-max modular neural network. IEEE Trans Biomed Eng. 51, 551-558 (2004).
- Robinson, T. E., Kramis, R. C., Vanderwolf, C. H. Two types of cerebral activation during active sleep: relations to behavior. Brain Res. 124, 544-549 (1977).
