Abstract
Theta aktivitet genereres i septohippocampal systemet og kan registreres ved hjelp av dype intrahippocampal elektroder og implanterbare elektroencefalografi (EEG) radiotelemetry eller tjore system tilnærminger. Farmakologisk er hippocampus theta heterogent (se dualistisk teoretisk) og kan differensieres til type I og type II theta. Disse individuelle EEG-subtyper er relatert til spesifikke kognitive og adferdstilstander, så som nervøse, utforskning, læring og hukommelse, høyere integrerende funksjon, etc. I neurodegenerative sykdommer slik som Alzheimers, strukturelle og funksjonelle endringer av septohippocampal system kan resultere i svekket theta aktivitet / svingninger. En standard kvantitativ analyse av det hippocampale EEG omfatter en Fast-Fourier-transformasjon (FFT) -basert frekvensanalyse. Men denne prosedyren ikke gi detaljer om theta aktivitet generelt og velorganiserte theta svingninger i særdeleshet. For å oppnå detailed informasjon om velorganiserte theta svingninger i hippocampus, har vi utviklet en ny analytisk tilnærming. Denne fremgangsmåten gjør det mulig for tids- og kostnadseffektiv kvantifisering av varigheten av høyt organiserte theta svingninger og deres frekvenskarakteristikker.
Introduction
Theta aktivitet i hjernen er knyttet til ulike kognitive og funksjonelle stater, inkludert opphisselse, oppmerksomhet, viljestyrte bevegelser, utforskende adferd, oppmerksomhet atferd, læring og hukommelse, somatosensoriske integrasjon, og raske øyebevegelser (REM) søvn 1, 2. Prinsipielt kan theta aktivitet som en rytmisk enhet genereres på ulike hjerneregioner og er godt organisert og synkronisert som theta svingninger. Nedenfor vil vi fokusere på analyse og kvantifisering av theta aktivitet / svingninger som genereres innenfor septohippocampal system 3, 4. Innenfor septum, GABAergic, glutamaterge og kolinerge neuroner prosjekt til hippocampus og bidra til initiering og opprettholdelse av theta oscillerende oppførsel. Det er en pågående diskusjon om hvorvidt hippocampus theta svingninger er initiert i septum, dvs. 5, 6, 7.
Uavhengig av deres opprinnelse, har hippocampus theta svingninger vært i fokus for interessen i mange år, særlig i transgene musemodeller. Disse modellene gir mulighet for implantering av dype EEG elektroder og for opptak av hippocampus theta svingninger i henhold til spesifikke kognitive og atferdsmessige oppgaver 8. Hippocampus theta svingninger er heterogene av natur. Basert på den såkalte dualistiske teori om theta svingninger, kan en skille mellom atropin-følsom type II-theta og atropin-insensitive type I theta 9, 10, 11. Sistnevnte kan typisk være forårsaket av muskarin M 1 / M
For tiden, gjør det mulig kommersielt tilgjengelig analyseprogrammer for rask FFT-baserte frekvensanalyse, for eksempel, analyse av kraft (P, mV 2)eller effektspektrum tetthet (PSD, mV 2 / Hz). Strøm eller makt spektrum tetthet (PSD) analyse av theta frekvensområdet bare gir en global oversikt over sin virksomhet. Men for å få en detaljert innblikk i kognitive og atferdsmessige theta-aktivitet, er obligatorisk analysen av høyt-organiserte theta svingninger. Vurderingen av velorganiserte theta svingninger er av sentral betydning innen nevrodegenerative og nevropsykiatriske sykdommer. De fleste eksperimentelle sykdoms studier er utført i transgene musemodeller ved hjelp av svært avansert nevrokirurgiske metoder for å registrere epidural overflate og dype intracerebrale EEG. Disse teknikkene inkluderer både tjore systemer 16 og radiotelemetric oppsett 17 18. Theta svingninger kan bli registrert som spontane og adferdsrelaterte theta svingninger under langsiktig opptaksforhold. I tillegg kan theta svingninger være recorded følgende farmakologiske induksjon, men også som følge av eksponering av dyr til atferds eller kognitive oppgaver eller til sensoriske stimuli, som for eksempel hale knipe.
Tidlig tilnærminger for å karakter theta svingninger ble beskrevet av Csicsvari et al. 19. Forfatterne utviklet en semi-automatisert verktøy for kortsiktig theta analyse (15-50 min) som ikke er egnet for lang tid EEG opptak. Vår metode, som er beskrevet her, gjør det mulig for analyse av langsiktig EEG opptak> 48 t 20. Csicsvari et al. 10 også referert til theta-delta-forhold, men ingen terskel for bestemmelse av velorganiserte theta svingninger er gitt. Deltaet og theta range definisjoner matche våre frekvensområde definisjoner. Ettersom det ikke er uttrykkelig nevnt, forutsettes det at en FFT-baserte metoden brukes ved Csicsvari et al. å beregne kraften av theta-delta-frekvensbånd. Detteigjen klart skiller seg fra vår fremgangsmåte, siden vi beregne wavelet-baserte amplituder på et stort antall frekvens skalaer (frekvens trinn Δ (f) = 0,05 Hz), noe som resulterer i mye høyere presisjon. Varigheten av individuelt analysert EEG epoken er lik vår definisjon.
Klausberger et al. 21 også gjøre bruk av theta-deltaet forholdstall for analyse av langsiktige EEG opptak. Men det er tre viktige forskjeller i forhold til vår tilnærming: i) EEG epoken varigheten er mye lengre, dvs. minst 6 s; ii) den theta-delta-forholdet er satt til 4, som er mye høyere enn vår terskel, og er relatert til forskjellige frekvensområde definisjoner; og iii) den kraft definisjonen er sannsynlig å være basert på en FFT tilnærming, som mangler høy presisjon, særlig for meget korte tidsvinduer (2 s, det vil si, 5 sykluser for svingninger med en frekvens på 2,5 Hz). I slike tilfeller er en wavelet-baserte prosedyre mer tilrådelig.En studie av Caplan et al. 22 utelukkende beregnet theta makt og overser de theta-deltaet effektforhold. Dermed Caplan nærmer 22 kan ikke skille mellom kognitive theta rike prosesser ledsaget av en høy eller lav delta.
I det følgende protokollen, vil vi presentere vår analyse wavelet-baserte tilnærming til pålitelig analysere velorganiserte theta svingninger i hippocampus EEG opptak fra mus. Siden denne fremgangsmåten fungerer automatisk, kan det brukes til store datasett og langsiktige EEG-målinger.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyreforsøk ble utført i henhold til retningslinjene for den lokale og institusjonelle Council on Animal Care (Universitetet i Bonn, BfArM, LANUV, Tyskland). I tillegg ble alle dyreforsøk utført i samsvar med overordnet regelverk, for eksempel, den europeiske fellesskaps rådsdirektiv av 24 november 1986 (86/609 / EØF), eller individuelle regional eller nasjonal lovgivning. Spesifikk innsats ble gjort for å minimere antall dyr som brukes, samt deres lidelse.
1. Animal Boliger og EEG opptaksforhold
- Hus mus i filter-topp bur eller bruke individuelt ventilerte bur.
- Overfør mus fra dyret anlegget til ventilerte skap i spesielle lab rom som egner seg for implantert dyr og telemetriske opptak.
- Utføre alle dyreforsøk, inkludert EEG elektroder implantasjon og de påfølgende opptak, under standardiserte forhold (22 ° C temperaturen, 12 h / 12 h lys-mørke-syklus, 50-60% relativ fuktighet, støydempning, etc.) 18.
- Før radiofrekvens senderen implantasjon, house dyr i grupper på 3-4 i klare type II polykarbonat bur, med mat og vann ad libitum. Ikke isolere enkelte mus, da dette kan føre til stress og forstyrre med påfølgende eksperimentering og resultater.
- Ikke bruk åpen boforhold, men bruk ventilerte skap i stedet under eksperimentering og innspilling.
2. Radiotelemetric EEG elektrode Implantasjon og EEG Recordings
- Anesthetize musene bruker injeksjon narkotika, f.eks ketaminehydrochloride / xylazinehydrochloride (100/10 mg / kg, intraperitonealt, ip) eller inhalasjon narkotika, f.eks isofluran 17, 18.
- For isofluran narkose, plasserer du musen i en induksjons cHamber med 4-5% isofluran og 0,8-1% oksygen eller karbogen (5% CO2 og 95% O 2).
- Plasser en silisiumansiktsmaske på nese / munn av dyret for å styre den ønskede anestesidybden og unngå experimenter eksponering for isofluran ved hjelp av et skyllesystem.
- Bruk injiserbare bedøvelse, f.eks esketaminhydrochloride (100 mg / kg, ip) og xylazinehydrochloride (10 mg / kg, ip), hvis inhalasjonsanastesi er ikke tilgjengelig.
- Overvåke anestesidybden ved å sjekke halen klype refleks, fot klype refleks, og respirasjonsfrekvens. Legg merke til at kunstig åndedrett via trakeal intubering er ikke nødvendig i mus.
- Implantere den radiofrekvens-senderen i et subkutant pose på ryggen av dyret.
- Fjern kroppshår fra hodebunnen og forbehandle barberte skalp med to desinfeksjonsmidler, dvs. 70% etanol og en jod-basert scrub.
- Ved hjelp av en skalpell, lageen midtlinjen snitt i hodebunnen fra pannen til nucheal regionen.
- Med start fra den nuchal innsnitt, forberede en subkutan lomme på den ene side av ryggen på dyret ved å utføre en stump disseksjon ved hjelp av kirurgiske sakser eller en kirurgisk sonde.
- Sett senderen i den subkutane posen og avsette den overskytende lengde av den fleksible senderen fører inn i posen også. Vær spesielt oppmerksom på å hindre forurensning av det kirurgiske området og senderen implantat. Riktig isolere steril fra ikke-sterile områder ved hjelp av gardiner.
- Plasser forsøksdyr på stereotaxic ramme, for eksempel en datastyrt 3D stereoenhet. Fest skallen ved hjelp av en nese klemme og øre barer.
- Forbehandle skallen med 0,3% H 2 O 2 for å fjerne ytterligere vev fra hodeskallen og å belyse de kraniale suturer og landemerker craniometrics, bregma og lambda.
- Bor hull på koordinatene til valg(Se trinn 2.6) ved anvendelse av en høyhastighets-nevrokirurgisk drill i et trykk-fri modus ved maksimal hastighet.
MERK: Trykk-fri boring unngår plutselige gjennombrudd av borhodet og skade på cortex. For en kraniotomi, er en nevrokirurgisk høyhastighets drill anbefales. Velge borehodediameter standard på 0,3 - 0,5 mm, avhengig av elektrodediameteren. - velge elektrodetype forsiktig, med tanke på impedansen, diameter, belegg, etc.
MERK: Parylene belagt tungsten eller rustfritt stål elektroder er de mest vanlige. De elektrodetyper bør velges i henhold til forsøks krav. Som en preemptive manøver, sterilisere elektrode tips før implantasjon bruker 70% etanol. Legg merke til at elektrodebelegget ikke tillater varmesterilisering. - For intrahippocampal CA1 EEG opptak, bore et hull stereotaksikalt på følgende koordinater: bregma, -2 mm; mediolateral, 1,5 mm (høyre hjernehalvdel); dorsoventral, 1,3 mm (TARGEt region: ove ammonis (CA1) pyramide lag). For referanseelektrode, bore et hull over lillehjernen cortex på følgende stereotaxic koordinater: bregma, -6,2 mm, mediolateral, 0 mm; dorsoventral, 0 mm.
MERK: lillehjernen elektroden fungerer som en pseudoreference elektrode, som lillehjernen er en ganske stille hjernen regionen. Stereotaxic koordinater ble avledet fra en standard mus hjernen atlas. - Før innsettingen av elektrodene, forkorte dem til ønsket lengde. Mekanisk klipp ekstrakraniell del av elektroden til den rustfrie stålspiralen til senderen.
MERK: Lodding bør unngås, da dette kan introdusere betydelig støy i systemet. - Feste elektroden til den vertikale armen til den stereotaktisk anordning og sett elektroden i henhold til de ovennevnte stereotaksiske koordinater.
- Fest elektrodene ved hjelp glassionomersement og vente til sement har fullt herdet.
- Lukk hodebunnenved hjelp av over-og-over-sting med ikke-absorberbare 5-0 eller 6-0 sutur materiale.
- For postoperativ smertebehandling, administrere carprofen (5 mg / kg, subkutant, sc) en gang daglig i 4 påfølgende dager etter implantasjon. Legg merke til at karprofen skal injiseres før det første innsnitt (trinn 2.2.2).
- Tillater dyrene å komme i 10 - 14 dager etter implantasjon før opptak og / eller injeksjons eksperimenter er i gang.
3. Spontane Opptak av Theta Svingninger og Farmakologisk Induksjon
- Aktiver radiofrekvens senderen bruker magnetbryter. Plasser dyret med sin hjem bur på mottaker plate. Utfør langsiktige hippocampus EEG opptak i minst 24-48 timer.
MERK: Analysen av EEG amplitude og EEG frekvens karakteristikk av langtidsopptak gir detaljert innsikt i biologiske avhengigheten av theta svingninger og deres tilknytning til spesifikke atferdsmessige ogkognitive forhold / oppgaver. Alltid kombinere EEG opptak med videoovervåkning av forsøksdyr. - For farmakologiske induksjon av theta svingninger, administrere en enkelt dose av uretan (800 mg / kg ip) eller en enkelt dose av en muskarine reseptoragonister, f.eks pilokarpin (10 mg / kg ip), arecolin (0,3 mg / kg ip) eller oksotremorin (0,03 mg / kg ip). Forbehandle mus med N-metylskopolamin (0,5 mg / kg ip) for å unngå perifere muskarine reaksjoner. Fersk oppløse alle legemidler i 0,9% NaCl eller Ringer løsning.
MERK: Høyere doser av muskarine reseptor agonister kan føre til pågripelse induksjon hos forsøksdyr. Også vurdere at de dosene som er gitt her representerer landemerker som krever forutgående dose-effektstudier i mus linje under etterforskning. Merk at uretan er et mutagen og kreftfremkallende som krever nødvendige forholdsregler i lagring og håndtering. - Injisere atropin (50 mg / kg, ip) for å skille atropin-følsom type IIfra atropin-insensitive type I Theta svingninger.
MERK: atropin dosering er igjen arts- og belastning avhengig og krever forutgående dose-effektevaluering. Den optimale tidspunktet for atropin injeksjon avhenger farmakodynamikken til muskarine reseptor agonister. For identifikasjon av type II theta, er atropin injeksjon anbefales 1 time etter uretan administrasjon. - Prøv å unngå senere søknad av flere medikamenter, som systemisk Drug Administration endrer globale transkripsjons og translasjonsforskning mønstre, som påvirker påfølgende EEG opptak. Vær oppmerksom på at kortvarig theta svingninger kan også være forårsaket av sensoriske stimuli, som for eksempel Tail eller pote-knipe.
- Extract / eksport representant EEG datasett av pre-fase (baseline) og etter injeksjon fase fra den totale EEG opptak som ASCI eller TXT-filer, vurderer farmakokinetikken til legemidler anvendt og kravene til det enkelte studieprotokoll.
4.Validering av EEG elektrodeplassering
- Avlive dyrene ved å plassere dem i en inkubasjon kammer og innføre 100% karbondioksid. Bruke en fyllgrad på 10-30% av kammervolumet per minutt med karbondioksid tilsatt til den eksisterende luft i inkubasjonsblandingen kammeret; Dette vil resultere i hurtig tap av bevissthet med minimal slitasje på dyrene.
- Fjern musen fra kammeret når åndedrettsstans og en falmet øyenfarge vedvarer i 2-3 min.
- Skjær rustfritt stål elektroder og eksplanterer radiofrekvente senderen. Halshogge musen med saks eller en giljotin og fjerne hjernen fra neurocranium ved forsiktig manipulering med kirurgiske saks og pinsett.
- Fiks hjernene i 4% paraformaldehyd i fosfatbuffer saltvann (PBS) (pH 7,4) over natten. For kryobeskyttelse, overføre hjerne til 30% glukose og lagre dem ved 4 ° C inntil videre behandling.
MERK: Paraformaldehyde betraktes som farlig avfall av 2012 OSHA Hazard Communication Standard (29 CFR 1910.1200). Ta nødvendige forholdsregler: Bruk personlig verneutstyr, sikre hensiktsmessig ventilasjon, og unngå støvdannelse. I tillegg fjerne antennelseskilder og ta forholdsregler mot utladning av statisk elektrisitet. Paraformaldehyde bør ikke slippes ut i miljøet. - Monter hentet hjernen på vevet innehaver av en cryostat ved hjelp av et lim og skjær hjernene til 40 - 75 mikrometer koronale skiver. Monter skivene på glassplater og beis dem med Nissl blå ved hjelp av standard histologisk prosedyre; denne prosedyren vil visualisere gren kanal som gjenspeiler den foregående elektrodeposisjonen. Merk at det også er mulig å skjære koronale skiver fra den native hjernen ved hjelp av en vibroslicer
- Innlemme bare de dyrene som oppfyller riktige EEG elektrode plassering kriterier; for CA1 regionen, bør enden av den dype elektroden være lokalisert inne i CA1 pyramidal lag.
- Record CA1 intrahippocampal EEG med en passende samplingsfrekvens uten a priori filter cut-off.
MERK: Samplingsfrekvensen, som er transmitter-spesifikke, bestemmer den øvre frekvensgrense av EEG-analyse. - Behandle de registrerte data med en analyse programvare. Program tidsfrekvensanalyser og beregninger med skreddersydde rutiner for tilstrekkelig kontroll av analysemetoder (figur 5) 20.
- Skjær innspilte EEG i seksjoner med en lengde på 1 time hver. Bruk raske dataprosessorer, siden beregningen tiden er høy. I tillegg gjøre bruk av programvare som kan Parallell databehandling med flere kjerner 20.
6. EEG Data Analysis
- Analyser datasegmenter ved hjelp av et komplekst Morlet wavelet for å beregne både frekvensen og amplituden av oscillasjonene.
MERK: Dette wavelet (f.eks Ψ (x) = (π b)(- 1/2) exp (2 i π c x) exp (-x 2 / b), hvor b er båndbredden parameter, c senterfrekvensen, og i den imaginære enhet) er ofte blitt anvendt i litteraturen for å studere EEG data, som det garanterer optimal oppløsning i både frekvens og tid 23, 24. - Bruk en båndbredde parameter og senterfrekvensen innstilling som særlig vekter frekvensen oppløsning til å skille frekvensdifferanse på 0,1 Hz nivå mens de fortsatt ikke forsømme en tilstrekkelig tidsoppløsning.
MERK: Nevronale prosesser i gamma bandet er kortvarig 25, og dette kan også holder for theta rytmer. Således må det analytisk tilnærming vurdere tilstrekkelig tidsoppløsning. - Analyser EEG data i frekvensområdet 0,2 til 12 Hz, med en step-størrelse på 0,1 Hz, således blant annet typisk Delta,TA, og alfa frekvensområder.
- Sett opp en automatisert, kompleks analytisk verktøy for utarbeidelse av theta frekvens arkitektur, som kan erstatte en standard visuell inspeksjon av theta svingninger; Denne prosedyren kalles theta-deteksjonsmetode (TDM).
- Beregn kvotienten av den maksimale amplitude i det theta frekvensområdet (3.5 til 8.5 Hz), og den maksimale amplitude i det øvre frekvensområdet delta (2-3,4 Hz) for tidsvinduer på 2,5 s hver.
MERK: Verdien av denne kvotient fungerer som et tiltak for å avgjøre om en theta svingning skjedde. Definisjonen av theta frekvensområdet kan variere avhengig av den funksjonelle tilstand og nevroanatomi krets / system som skal analyseres. - Klassifisere et segment som en "theta oscillasjon epoke," hvis den beregnede forholdet i løpet av dette segmentet er over 1,5.
MERK: Dette garanterer at den maksimale amplitude theta er minst 50% høyere enn amplituden på den øvre delta bandet under den tilhørende 2,5-s EEGsegmentet. Vær oppmerksom på at forholdet kanskje trenger tilpasning avhengig av linje og / eller arter som brukes. Et intervall på 2,5 s representerer en minimal varighet for en theta svingning, forhindrer falske positive deteksjoner av visse støyende epoker, og ligger innenfor området definisjonene av andre publikasjoner, 19, 26. Den øvre deltafrekvensområde tjener som en styrefrekvensbånd fordi fysiologisk relevant delta-aktivitet vises under ikke-theta epoker, for eksempel under langsom-bølgesøvn, som er sterkt dempet ved theta-aktivitet. - Gjenta denne prosedyren for hver en time delen; derfor hver del består av 1,440 EEG segmenter med lengder på 2,5 s hver.
- Statistisk evaluere dataene for de identifiserte theta oscillasjon epoker.
- Beregn statistikk over den totale varigheten tider oppdaget theta epoker; distinkte eller forhåndsdefinerte grupper; sykluser, slik som lys / mørke; og andre parametere.
MERK: Statipinner kan innbefatte t-test, ANOVA, eller Manova, avhengig variabel, antallet grupper, betingelsene, etc. - Beregn statistikk av amplituden av de detekterte theta epoker, men bare i den theta frekvensområdet (3.5 til 8.5 Hz).
- Evaluere statistikken over frekvensen for de detekterte theta epoker, men bare i den theta frekvensområdet (3.5 til 8.5 Hz).
MERK: theta frekvens av en theta epoke er definert som den frekvens som hører til det maksimale theta amplituden av en theta epoke.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Theta aktivitet kan registreres i et bredt spekter av sentralnervesystemet (CNS) regioner. Her presenterer vi en analyse av theta svingninger fra murine hippocampus. Slike svingninger kan oppstå under ulike atferdsmessige og kognitive tilstander. Det er sterkt anbefalt å analysere theta svingninger under begge spontane langsiktige, oppgaverettet kortsiktige og farmakologisk-induserte forhold.
Figur 1 viser en representativ intrahippocampal CA1 opptak i henhold til kontrollforhold. Dersom dyret ikke er i en spontan "theta tilstand," the intrahippocampal EEG er ofte preget av stor uregelmessig amplitude (LIA) aktivitet. Administrasjon av muskarine agonister (f.eks arecolin, pilokarpin, eller uretan) resulterer i velorganiserte theta svingninger som kan bli blokkert av atropin (50 mg / kg, ip, figur 1).
(figur 2). Basert på denne klassifiseringen, er det mulig å kvantifisere den totale varigheten av theta svingninger i henhold spontane forhold eller spesifikke atferdsmessige og kognitive oppgaver.
For å analysere en 30-min EEG segment (som for farmakologisk uretan / atropin theta disseksjon), vi først utføre en tidsfrekvensanalyse for et frekvensområde på 0,2 til 12 Hz, som viser amplituden (mV) i en farge- kodet mote (figur 3 A). Som blir klart i figur 3 A, med høy amplitude theta-aktivitet, noe som bekreftes av en visuell inspeksjon av EEG (hvite piler), er ledsaget av en lav amplitude i delta frekvensområdet. Deretter maksimale amplituder avtheta (03.05 til 08.05 Hz) og delta (2 til 3,4 Hz) frekvensområder er plottet (figur 3 B). Systemakorrelasjons studier viste at forholdet mellom maksimal theta amplitude til maksimums-delta amplitude som overskrider 1,5, noe som indikerer høyt organisert theta oscillasjoner (figur 3C).
Figur 4 viser hvordan uretan kan indusere hippocampus theta svingninger (hvite sirklene i figur 4 II). Uretan er en multi-target medikament som kan utløse type II theta på grunn av dens agonistiske virkning på muskarine reseptorer. Etter en atropin injeksjon (figur 4 III), er disse type II theta svingninger (atropin-sensitive theta Svingninger) avskaffet. Det er viktig å tenke på at de muskarine reseptoragonister, i tillegg til atropin, har individuelle farmakokinetiske egenskaper som påvirker tids egenskapene til theta forekomst og theta blokade. Det skal bemerkes at atropin-insensitive type I theta forblir unaffinjiseres ved muskarine reseptor-antagonister.
En oppsummering av hele theta påvisning og kvantifisering verktøy er vist i figur 5. Det resulterer i beregningen av amplitude, frekvens, og summen / bety theta varighet. I motsetning til tidligere beskrevne teknikker gjør det bruk av en wavelet-baserte metode med høy presisjon. Den analytiske verktøy som er beskrevet her har flere bruksområder. Theta oscillasjoner genereres i den septohippocampal systemet og er ofte svekket av neurodegenerative prosesser, for eksempel ved Alzheimers sykdom. Tallrike musemodeller av Alzheimers sykdom, er blitt beskrevet som varierer i homologi, isomorfi, og forutsigbarhet. Noen av disse modellene ble rapportert å vise en reduksjon i theta-aktivitet, mens andre ble vist for å vise en økning i theta-aktivitet, forblir den grunn som skal bestemmes. Vi ble brukt theta deteksjon tool er beskrevet her for å karakterisere endrede theta oscillerende arkitektur i 5XFAD modell for Alzheimers sykdom 8. Men det kan også anvendes i epilepsi forskning og nevropsykiatriske sykdommer.
Figur 1: Theta Svingninger i C57Bl / 6-mus. Radiotelemetric intrahippocampal CA1 opptak i henhold til spontane betingelser (I) og følgende uretan-injeksjon (800 mg / kg, ip, II). Etter uretan injeksjon, velorganiserte theta svingninger blir synlige, noe som kan bli blokkert av atropin (50 mg / kg, ip). Dette tallet har blitt modifisert fra referanse 20, med tillatelse. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: En Wavelet-basert analyse av en Deep CA1 EEG opptak fra en C57BL / 6 mus. (A og B) To 2,5-e EEG epoker er avbildet, visuelt klassifisert som henholdsvis ikke-theta og theta segmenter. (C og D) Tid-frekvens-analyse av CA1 EEG segmentene vist i A og B i området fra 0,2 til 12 Hz, med amplituden være fargekodet. Den tidsfrekvensanalyse i C oppviser uregelmessig, varierende theta arkitektur av frekvenser og tid, mens et segment med høyt synkroniserte theta oscillasjoner er karakterisert ved en vanlig, ikke-fluktuerende høy amplitude theta av en nesten konstant frekvens på 6 Hz. Forholdet mellom maksimal theta til maksimums-delta amplitude er 1,25 i C og 4,67 i D, klart å klassifisere
Figur 3: En Wavelet-baserte Theta Detection Tool. (A) Time-frekvensanalyse av en 30 min EEG-segmentet (ikke vist) som er registrert etter uretan administrasjon. Komplekset Morlet wavelet-baserte analyser ble utført i området fra 0,2 til 12 Hz, med amplituden (mV) er fargekodet. (B) Dette bilde viser den maksimale amplitude av den theta frekvensbåndet (3.5 til 8.5 Hz, grønn) og den øvre deltabåndet (2-3,4 Hz, rød) for den 30-min EEG-segmentet. (C) Denne figuren illustrerer forholdet mellom den maksimale amplitude theta(grønn i B), og den maksimale delta amplitude (rød i B). Merk at høyt synkronisert theta svingninger korrelerer med suprathreshold forholdstall i C. Dette tallet ble gjengitt fra Reference 20, med tillatelse. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: Wavelet-baserte Analyse av Farmakologisk-indusert, velorganiserte Theta Svingninger. Representative 30-min EEG-segmenter (ikke vist) er analysert i frekvensområdet 0-12 Hz med amplituden (mV) er fargekodet. En uretan-injeksjon på 800 mg / kg, ip, resulterte i den fragmenterte forekomst av høyt-organiserte theta svingninger, med en fremherskende frekvens på omkring 6 Hz (hvite sirkler). Etter en påropine injeksjon på 50 mg / kg, ip, er disse theta svingninger oppheves. Dette tallet ble gjengitt fra Reference 20, med tillatelse. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: flytdiagram som viser Kvantifisering av velorganiserte Theta Svingninger Registrert fra Murine CA1. Type II theta svingninger kan analyseres ved hjelp av en styre opptak (fase), en etter injeksjon (for eksempel uretan, arecolin, eller pilokarpin) fase, og en post-atropin fase (A1). 30 min EEG segmenter (A2) fra hver fase er tids frekvens analyseres i området 0,2 til 12 Hz ved hjelp av en wavelet-baserte metode (B1 og B2). Neste, theta segmenteringt deteksjon startes (C1), noe som gir en nærmere titt på tids frekvens karakteristikk av theta range (03.05 til 08.05 Hz, C2) og øvre delta området (2 til 3,4 Hz, C3) for EEG epoker som er 2,5 s hver (C4 og C5). Deretter blir amplituden analysert over theta og deltafrekvensområde som viser de maksimale verdiene (C6 og C7). Dersom den maksimale amplitude av theta / delta overskrider 1,5, er 2,5 s EEG segment klassifisert som en epoke med høyt organisert theta oscillasjon (C8), med en definert amplitude og frekvens (D1-D3). Dette theta gjenkjenningsverktøy muliggjør kvantifisering av theta pendling arkitektur (E1). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Theta aktivitet er av sentral betydning i systemisk nevrofysiologi. Det kan observeres i forskjellige områder av hjernen, spesielt i hippocampus, hvor det er relatert til spesifikke atferdsmessige og kognitive tilstander. I tillegg kan hippocampus theta være farmakologisk differensiert i atropin-følsom type II og atropin-ufølsom type I theta. Type I er antatt å være relatert til bevegelse, som å gå eller kjøre 27, 28, 29, 30, 31, mens type II kan observeres i løpet av varslings immobilitet staten 27, 28, 29, 30. Alert-immobilitet stater kan bli indusert av sjeldne og tilfeldige tone eller taktile stimuli, for eksempel 32. Type II theta er også relatert til passive hele kroppen rotasjon 14. Under paradoksal søvn, både atropin-sensitive og atropin-motstandsdyktig theta rytmene er til stede 33. Hvile immobilitet tilstand er preget av stor irregulær aktivitet (LIA) 27.
Generelt kan theta svingninger ført under spontan betingelser, men også følgende farmakologisk induksjon (for eksempel via anvendelsen av muskarine reseptoragonister, slik som uretan, pilokarpin, arekolin, oxotremorin, etc.). Legg merke til at, farmakodynamisk, er uretan en multi-target stoff som kan øke type II theta men også inhibere type I theta. I motsetning til dette, pilokarpin, arekolin, og oksotremorin selektivt å fremkalle type II-theta. Avhengig farmakokinetikken til de muskarine agonister brukes, tar det en variabel mengde tid til theta svingninger oppstår. Type II kan blokkeres effektivt av atropin. Kritisk, det gjørvismenn av muskarine agonister og antagonister å indusere og blokk type II theta svingninger er arts- og belastning avhengig. Det er således helt avgjørende for å utføre dose-effekt studier for å løse den optimale dose for induksjon av theta svingninger og for deres blokkeringen for en bestemt vitenskapelig spørsmål. Kortvarig theta svingninger kan også være forårsaket av sensoriske stimuli, som for eksempel Tail eller pote-knipe.
Det er ulike tilnærminger for å karakterisere theta aktivitet generelt. FFT-baserte tilnærminger, noe som resulterer i kontinuerlige eller usammenhengende (frekvensbånd-relatert) effektspekteret tetthet (PSD) analyse / tomter eller i en maktanalyse for enkelte frekvensbånd, er standard tilnærminger som gir verdifull informasjon om frekvenskarakteristikker.
Men for å oppnå en mer kompleks innsikt i theta-arkitektur, videre fremgangsmåter synes å være nødvendig. Spesielt kan man være interessert i de ulike organizational statene theta og deres frekvenser, som ikke kan måles direkte og nøyaktig ved de nevnte prosedyrer. I motsetning til romanen analytisk teknikk som presenteres her er wavelet-baserte og i stand til å vurdere velorganiserte, kortsiktige theta svingninger. De svarer ikke til standard theta makt, som også vurderer paroksysmal, usammenhengende theta aktivitet. Fokuset er å lokke fram konkrete tidsfrekvenskarakteristikker i EEG data som er typiske for theta epoker. Således hindrer den nye metoden falske positive klassifiseringen av theta epoker. Den automatiserte prosedyren garanterer evalueringen av langvarige EEG datasett og inkluderer derfor pålitelige statistiske sammenligninger av fysiologiske sykluser (lys / mørk syklus eller circadian rhythmicity) under langtidsstudier.
Denne protokollen er av særlig betydning i analyse av EEG-data oppnådd fra dyremodeller av nevrodegenerative sykdommer, særlig i den karakteristiske gjestgsering av høyt organiserte theta arkitektur i septohippocampal og andre nervesystemer. Kompleks og høy presisjon theta analyse kan bidra til å fastslå EEG fingeravtrykk som kan tjene som EEG biomarkører i fremtiden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Carprofen (Rimadyl VET - Injektionslösung) | Pfizer | PZN 0110208208 | 20ml |
| binocular surgical magnification microscope | Zeiss Stemi 2000 | 0000001003877, 4355400000000, 0000001063306, 4170530000000, 4170959255000, 4551820000000, 4170959040000, 4170959050000 | |
| Dexpanthenole (Bepanthen Wund- und Heilsalbe) | Bayer | PZN: 1578818 | |
| drapes (sterile) | Hartmann | PZN 0366787 | |
| 70% ethanol | Carl Roth | 9065.5 | |
| 0.3% / 3% hydrogene peroxide solution | Sigma | 95321 | 30% stock solution |
| gloves (sterile) | Unigloves | 1570 | |
| dental glas ionomer cement | KentDental /NORDENTA | 957 321 | |
| heat-based surgical instrument sterilizer | F.S.T. | 18000-50 | |
| high-speed dental drill | Adeor | SI-1708 | |
| Inhalation narcotic system (isoflurane) | Harvard Apparatus GmbH | 34-1352, 10-1340, 34-0422, 34-1041, 34-0401, 34-1067, 72-3044, 34-0426, 34-0387, 34-0415, 69-0230 | |
| Isoflurane | Baxter 250 ml | PZN 6497131 | |
| Ketamine | Pfizer | PZN 07506004 | |
| Lactated Ringer's solution (sterile) | Braun | L7502 | |
| Nissl staining solution | Armin Baack | BAA31712159 | |
| pads (sterile) | ReWa Krankenhausbedarf | 2003/01 | |
| Steel and tungsten electrodes parylene coated | FHC Inc., USA | UEWLGESEANND | |
| stereotaxic frame | Neurostar | 51730M | ordered at Stoelting |
| (Stereo Drive-New Motorized Stereotaxic) | |||
| tapes (sterile) | BSN medical GmbH & Co. KG | 626225 | |
| TA10ETA-F20 | DSI | 270-0042-001X | Radiofrequency transmitter 3.9 g, 1.9 cc, input voltage range ± 2.5 mV, channel bandwidth (B) 1 - 200 Hz, nominal sampling rate (f) 1,000 Hz (f = 5B) temperature operating range 34 - 41 °C warranted battery life 4 months |
| TL11M2-F20EET | DSI | 270-0124-001X | Radiofrequency transmitter 3.9 g, 1.9 cc, input voltage range ± 1.25 mV, channel bandwidth (B) 1 - 50 Hz, nominal sampling rate (f) 250 Hz (f = 5B) temperature operating range 34 - 41 °C warranted battery life 1.5 months |
| Vibroslicer 5000 MZ | Electron Microscopy Sciences | 5000-005 | |
| Xylazine (Rompun) | Bayer | PZN: 1320422 | |
| Matlab | Mathworks Inc. | programming, computing and visualization software | |
| SPSS | IBM | statistical analysis software |
References
- Vanderwolf, C. H. Hippocampal electrical activity and voluntary movement in the rat. Electroencephalogr Clin Neurophysiol. 26, 407-418 (1969).
- Kahana, M. J., Seelig, D., Madsen, J. R. Theta returns. Curr Opin Neurobiol. 11, 739-744 (2001).
- Varga, V., et al. The presence of pacemaker HCN channels identifies theta rhythmic GABAergic neurons in the medial septum. J Physiol. 586, 3893-3915 (2008).
- Takano, Y., Hanada, Y. The driving system for hippocampal theta in the brainstem: an examination by single neuron recording in urethane-anesthetized rats. Neurosci Lett. 455, 65-69 (2009).
- Goutagny, R., Manseau, F., Jackson, J., Danik, M., Williams, S. In vitro activation of the medial septum-diagonal band complex generates atropine-sensitive and atropine-resistant hippocampal theta rhythm: an investigation using a complete septohippocampal preparation. Hippocampus. 18, 531-535 (2008).
- Manseau, F., Goutagny, R., Danik, M., Williams, S. The hippocamposeptal pathway generates rhythmic firing of GABAergic neurons in the medial septum and diagonal bands: an investigation using a complete septohippocampal preparation in vitro. J Neurosci. 28, 4096-4107 (2008).
- Hangya, B., Borhegyi, Z., Szilagyi, N., Freund, T. F., Varga, V. GABAergic neurons of the medial septum lead the hippocampal network during theta activity. J Neurosci. 29, 8094-8102 (2009).
- Siwek, M. E., et al. Altered theta oscillations and aberrant cortical excitatory activity in the 5XFAD model of Alzheimer's disease. Neural Plast. 2015, 781731 (2015).
- Buzsaki, G. Theta oscillations in the hippocampus. Neuron. 33, 325-340 (2002).
- Buzsaki, G., et al. Hippocampal network patterns of activity in the mouse. Neuroscience. 116, 201-211 (2003).
- Buzsaki, G., Moser, E. I. Memory navigation and theta rhythm in the hippocampal-entorhinal system. Nat Neurosci. 16, 130-138 (2013).
- Shin, J. Theta rhythm heterogeneity in humans. Clin Neurophysiol. 121, 456-457 (2010).
- Shin, J., et al. Phospholipase C beta 4 in the medial septum controls cholinergic theta oscillations and anxiety behaviors. J Neurosci. 29, 15375-15385 (2009).
- Shin, J., Kim, D., Bianchi, R., Wong, R. K., Shin, H. S. Genetic dissection of theta rhythm heterogeneity in mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 18165-18170 (2005).
- Brown, D. A., Adams, P. R. Muscarinic suppression of a novel voltage-sensitive K+ current in a vertebrate neurone. Nature. 283, 673-676 (1980).
- Senkov, O., Mironov, A., Dityatev, A. A novel versatile hybrid infusion-multielectrode recording (HIME) system for acute drug delivery and multisite acquisition of neuronal activity in freely moving mice. Front Neurosci. 9, 425 (2015).
- Lundt, A., et al. EEG Radiotelemetry in Small Laboratory Rodents: A Powerful State-of-the Art Approach in Neuropsychiatric, Neurodegenerative, and Epilepsy Research. Neural Plast. 2016, 8213878 (2016).
- Papazoglou, A., et al. Non-restraining EEG radiotelemetry: epidural and deep intracerebral stereotaxic EEG electrode placement. J Vis Exp. (112), (2016).
- Csicsvari, J., Hirase, H., Czurko, A., Buzsaki, G. Reliability and state dependence of pyramidal cell-interneuron synapses in the hippocampus: an ensemble approach in the behaving rat. Neuron. 21, 179-189 (1998).
- Muller, R., et al. Atropine-sensitive hippocampal theta oscillations are mediated by Cav2.3 R-type Ca2+ channels. Neuroscience. 205, 125-139 (2012).
- Klausberger, T., et al. Brain-state- and cell-type-specific firing of hippocampal interneurons in vivo. Nature. 421, 844-848 (2003).
- Caplan, J. B., Madsen, J. R., Raghavachari, S., Kahana, M. J. Distinct patterns of brain oscillations underlie two basic parameters of human maze learning. J Neurophysiol. 86, 368-380 (2001).
- Montgomery, S. M., Buzsaki, G. Gamma oscillations dynamically couple hippocampal CA3 and CA1 regions during memory task performance. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 14495-14500 (2007).
- Kronland-Martinet, R., Morlet, J., Grossman, A. Analysis of sound patterns through wavelet transform. Int J Pattern Recognit Artif Intell. 1, 29 (1987).
- Buzsaki, G., Wang, X. J. Mechanisms of gamma oscillations. Annu Rev Neurosci. 35, 203-225 (2012).
- Goutagny, R., Jackson, J., Williams, S. Self-generated theta oscillations in the hippocampus. Nat Neurosci. 12, 1491-1493 (2009).
- Bland, B. H. The physiology and pharmacology of hippocampal formation theta rhythms. Prog Neurobiol. 26, 1-54 (1986).
- Leung, L. S. Generation of theta and gamma rhythms in the hippocampus. Neurosci Biobehav Rev. 22, 275-290 (1998).
- Shin, J., Talnov, A. A single trial analysis of hippocampal theta frequency during nonsteady wheel running in rats. Brain Res. 897, 217-221 (2001).
- Shin, J. A unifying theory on the relationship between spike trains, EEG, and ERP based on the noise shaping/predictive neural coding hypothesis. Biosystems. 67, 245-257 (2002).
- Kramis, R., Vanderwolf, C. H., Bland, B. H. Two types of hippocampal rhythmical slow activity in both the rabbit and the rat: relations to behavior and effects of atropine, diethyl ether, urethane, and pentobarbital. Exp Neurol. 49, 58-85 (1975).
- Lu, B. L., Shin, J., Ichikawa, M. Massively parallel classification of single-trial EEG signals using a min-max modular neural network. IEEE Trans Biomed Eng. 51, 551-558 (2004).
- Robinson, T. E., Kramis, R. C., Vanderwolf, C. H. Two types of cerebral activation during active sleep: relations to behavior. Brain Res. 124, 544-549 (1977).
