Abstract
Teta aktivitesi septohippocampal sistemde üretilir ve derin intrahipokampal elektrotları ve implante elektroensefalografi (EEG) radiotelemetry veya bağlama sistemi yaklaşımları kullanılarak kaydedilebilir. Farmakolojik, hipokampal teta (dualist teorisi bakınız) heterojen ve tip I ve tip II teta içine ayırt edilebilir. Bu bireysel EEG alt tipleri bozulmuş teta aktivitesi neden olabilir örneğin Alzheimer, yapısal ve septohippocampal sisteminin fonksiyonel değişiklikler gibi nörodejeneratif hastalıklar vb uyarılma, keşif, öğrenme ve bellek, yüksek bütünleştirici fonksiyonları gibi spesifik bilişsel ve davranışsal devletler, ilgili / salınımlar. hipokampal EEG standart kantitatif analiz Fast-Fourier-Dönüşüm (FFT) tabanlı frekans analizini içermektedir. Ancak, bu yordam özelde ve son derece organize teta salınımlarının teta etkinliğiyle ilgili ayrıntıları sağlamaz. DETA elde etmek içinhipokampus son derece organize teta salınımlarına bu kama bilgiler, yeni bir analitik yaklaşım geliştirdik. Bu yaklaşım, yüksek organize teta salınımları ve frekans özellikleri süresi zaman ve maliyet-etkin bir miktarının sağlar.
Introduction
Beyindeki teta aktivitesi, 2 uyarılma, dikkat, istemli hareket, keşif davranışı, dikkat davranışı, öğrenme ve bellek, somatosensoryel entegrasyonu ve hızlı göz hareketi (REM) da dahil olmak üzere farklı bilişsel ve işlevsel devletler, 1 ila uyku ilgilidir. Prensip olarak, ritmik bir varlık olarak teta aktivitesi çeşitli beyin bölgelerinde oluşturulabilir ve yüksek teta salınımlar olarak düzenlenmiş ve senkronize edilir. Aşağıda, teta aktivitesi / septohippocampal sistemi 3, 4 içinde oluşturulan salınımlar analizi ve ölçümü üzerinde durulacak. septum içinde, GABAerjik, glutamaterjik ve kolinerjik nöronlar proje hipokampus ve osilasyonel davranış başlatılması ve bakım katkıda bulunmaktadır. Hipokampal teta salınımları, yani septum başlatılan konusunda bir sürmekte olan tartışmalar vardır, 5, 6, 7.
Kökenine bakılmaksızın, hipokampus teta salınımları özellikle transgenik fare modellerinde, yıllardır ilgi odağı olmuştur. Bu modeller, derin EEG elektrotları implantasyon ve spesifik bilişsel ve davranışsal görevleri 8 altında hipokampal teta salınımlarının kayıt için izin verir. Hipokampal teta salınımlar doğada heterojendir. Teta salınımların sözde ikici teorisine dayanarak, bir atropin duyarlı tip II teta ve atropin duyarsız tip I teta 9, 10, 11 birbirinden ayırabilirsiniz. Bu sonuncusu, muskarinik M tarafından indüklenebilir 1 / M
Şu anda piyasada mevcut analitik yazılım (P mV 2) hızlı FFT tabanlı frekans analizleri, örneğin, güç analizi için izin verirveya güç spektrum yoğunluğu (PSD, mV 2 / Hz). Güç veya teta frekans aralığının güç spektrum yoğunluğu (PSD) analizi sadece faaliyet küresel bir bakış verir. Ancak, bilişsel ve davranış ile ilgili teta aktivitesi içine ayrıntılı bir fikir elde etmek için, son derece organize teta salınımlarının analizi zorunludur. Çok organize teta salınımlarının değerlendirilmesi nörodejeneratif ve nöropsikiyatrik hastalıklar alanında merkezi bir öneme sahiptir. Çoğu deneysel hastalık çalışmaları epidural yüzey ve derin intraserebral EEG'ler kaydetmek için son derece sofistike nöroşirürji yaklaşımlar kullanılarak transgenik fare modellerinde yürütülmektedir. Bu teknikler hem halata sistemleri 16 ve radiotelemetrik kurulumları 17, 18 içerir. Teta salınımlar uzun süreli kayıt koşulları altında kendiliğinden ve davranış ile ilgili teta salınımları olarak kaydedilebilir. Buna ek olarak, teta salınımlar reco olabilirfarmakolojik indüksiyon takip değil, aynı zamanda davranış veya bilişsel görevleri ya da kuyruk kıstırma olarak duyusal uyaranlara, hayvanların maruz kalma takip rded.
Erken teta salınımlar Csicsvari ve diğerleri tarafından tarif edilmiştir karakterize yaklaşımlar. 19. Uzun süre EEG kayıtları için uygun değildir - (50 dk 15) Yazarlar kısa süreli teta analizi için yarı otomatik bir araç tasarladık. Burada açıklanan Önerilen yöntem,> 48 saat 20 Uzun vadeli EEG kaydının analizi sağlar. Csicsvari ve diğ. 10 da teta-delta oranı sevk, ama son derece organize teta salınımlarının belirlenmesi için herhangi bir eşik sağlanır. delta ve teta aralığı tanımları bizim frekans aralığı tanımları maç. Açıkça belirtilmeyen gibi, bir FFT tabanlı yöntem Csicsvari ve arkadaşları tarafından kullanılan tahmin. teta-delta frekans bantlarında gücünü hesaplamak için. Bubiz çok yüksek hassasiyet ile sonuçlanan, frekans ölçekler çok sayıda (frekans Δ (f) = 0.05 Hz adımlar) üzerine dalgacık tabanlı genlikleri hesaplamak beri yine açıkça bizim yöntemden farklıdır. Tek tek analiz EEG çağın süresi bizim tanımına benzer.
KlausBerger ve diğ. 21 uzun vadeli EEG kayıtlarının analizi için teta-delta oranları faydalanmak. Ancak, bizim yaklaşımla karşılaştırıldığında üç büyük farklılıklar vardır: i) EEG dönem süresi, daha uzun, yani en az 6 s; ii) teta-delta oran bizim eşik çok daha yüksektir ve farklı frekans aralığı tanımları ile ilgili olan, 4'e ayarlanır; ve iii) güç tanımı (özellikle çok kısa bir süre pencereler için, yüksek hassasiyetli yoksun bir FFT yaklaşımına dayalı olması muhtemeldir 2 s, yani 2.5 Hz'lik bir frekansta) ile salınımlar için 5 çevrimleri. Bu gibi durumlarda, bir dalgacık tabanlı prosedür daha tavsiye edilir.Caplan ve arkadaşları tarafından yapılan bir çalışma. Teta-delta gücü oranı ihmal ederek 22 sadece teta gücü hesaplanır. Böylece, Caplan 22 yüksek veya düşük delta eşliğinde bilişsel teta zengin süreçler ayırt edemez yaklaşım.
Aşağıdaki protokol, güvenilir farelerin hipokampal EEG kayıtları son derece organize teta salınımlar analiz analitik dalgacık tabanlı bir yaklaşım sunacak. Bu prosedür otomatik olarak çalışır bu yana, büyük veri kümeleri ve uzun vadeli EEG ölçümleri uygulanabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm hayvan deneyleri yerel ve kurumsal Hayvan Bakımı Konseyi (Bonn Üniversitesi, BfArM, LANUV, Almanya) kurallarına göre gerçekleştirildi. Buna ek olarak, tüm hayvan deneyleri üstün mevzuat, örneğin, 24 Kasım 1986 (86/609 / EEC) Avrupa Toplulukları Konseyi Direktifi, ya da bireysel, bölgesel veya ulusal mevzuata uygun olarak yürütülmüştür. Özel bir çaba kullanılan hayvanların sayısı ve aynı zamanda bunların acı en aza indirmek için yapıldı.
1. Hayvan Konut ve EEG Kayıt Koşulları
- Filtre üstü kafeslerinde Ev fareleri veya ayrı ayrı havalandırılan kafesleri kullanın.
- implante hayvanlar ve telemetrik kayıtlar için uygun özel laboratuvar odalarında havalandırılan dolapları hayvan tesisinden fareler aktarın.
- standart koşullar (22 ° C TEM ile EEG elektrot implantasyonu ve daha sonra bantlar dahil olmak üzere tüm hayvan deney gerçekleştirmesıcaklık, 12 saat / 12 saat ışık-karanlık döngüsü,% 50-60 bağıl nem, gürültü azaltımı, vb) 18.
- Gıda ve su ad libitum net tip II polikarbonat kafeslerde, 4 - 3 gruplar halinde radyofrekans verici implantasyonu, ev hayvanları önce. Bu strese neden ve sonraki deneyler ve sonuçları ile müdahale gibi, bireysel fareler izole etmeyin.
- açık barınma koşullarının kullanmak, ancak bunun yerine deney ve kayıt sırasında havalandırılmış dolapları kullanmayın.
2. radiotelemetrik EEG Elektrot Yerleştirilmesi ve EEG Kayıtlar
- Örneğin enjeksiyon narkotik, ör ketaminehydrochloride / xylazinehydrochloride (100/10 mg / kg, periton boşluğu içine, ip) ya da inhalasyon uyuşturucu, izofluran 17, 18 kullanılarak fareler anestezi.
- izofluran narkoz, bir indüksiyon c içine fare konumlandırmak% 4-5 izofluran ve 0,8-1% oksijen veya karbojen (% 5 CO2 ve% 95 O 2) ile hamber.
- anestezi istenen derinliği kontrol etmek ve bir atma sistemi kullanarak izofluran deneyi maruz kalmasını önlemek için hayvanın burun / ağız bir silikon yüz maskesi yerleştirin.
- Enjekte edilebilir anestetikler, örneğin kullanımı, esketaminhydrochloride (100 mg / kg, ip) ile xylazinehydrochloride (10 mg / kg, ip), inhalasyon anestezisi mevcut değilse.
- Kuyruk tutam refleks, ayak tutam refleks ve solunum hızını kontrol ederek anestezi derinliği izleyin. Entübasyon yoluyla suni solunum farelerde gerekli olmadığını unutmayın.
- Hayvanın sırtında bir deri altı kese içine radyofrekans verici implant.
- Derisi vücut saç kaldırmak ve iki dezenfektanlar, yani% 70 etanol ve iyot bazlı fırçalama ile traş kafa derisi ön işleme tabi.
- Bir neşter kullanılarak, yapmaknucheal bölgeye alından kafa derisi üzerinde orta hat kesi.
- ense insizyon başlayarak, cerrahi makas veya cerrahi sonda kullanılarak künt diseksiyon gerçekleştirerek hayvanın arka bir tarafında bir deri altı torba hazırlar.
- deri altı kese içine vericiyi yerleştirin ve esnek verici yanı sıra kese içine açar aşırı uzunluğunu mevduat. cerrahi bölgeye ve verici implantın kirlenmesini önleyen özel dikkat. Düzgün örtüler kullanılarak steril olmayan alanlardan steril izole eder.
- Stereotaksik çerçeve, örneğin, bilgisayarlı 3D stereotaksik cihaz üzerinde deneysel hayvan yerleştirin. Bir burun kıskacı ve kulak çubukları kullanarak kafatası sabitleyin.
- Kafatasından daha fazla doku kaldırmak için ve kranial sütürler ve craniometrics işaretlerini, bregma ve lambda aydınlatmak için% 0.3 H 2 O 2 ile kafatası ön işleme tabi.
- seçim koordinatlarında delik açınMaksimum hızda bir basınç serbest modunda yüksek hızlı nöroşirürji matkap kullanarak (adım 2.6 bakınız).
NOT: Basınç serbest delme korteks delici kafasının ve hasar ani bir atılım önler. Bir kraniotomi için bir beyin cerrahisi yüksek hızlı matkap tavsiye edilir. 0,5 mm, elektrot çapına bağlı olarak - 0.3 standart matkap kafalı çaplarını seçin. - Dikkatle empedans, çap, kaplama, vb göz önüne alındığında, elektrot türünü seçin
Not: Parylene kaplanmış tungsten veya paslanmaz çelik elektrotlar en yaygın olanlarıdır. Elektrot tipi deney ihtiyaçlarına göre seçilmelidir. Bir önleyici bir manevra olarak,% 70 etanol kullanılarak implantasyon öncesinde elektrot uçları sterilize. elektrot kaplama ısı sterilizasyonu için izin vermediğini unutmayın. - intrahipokampal CA1 EEG kayıtları için aşağıdaki koordinatları stereotaxically bir delik: bregma, -2 mm; mediolateral, 1,5 mm (sağ hemisfer); dorsoventral 1.3 mm (Küçük kalkant bölge: cornu ammonis (CA1) piramidal tabakası). referans elektrot için aşağıdaki stereotaksik koordinatlarda serebellar korteks üzerinde bir delik: bregma, -6.2 mm, mediolateral, 0 mm; dorsoventral, 0 mm.
NOT: beyincik oldukça sessiz beyin bölgesi olarak serebellar elektrot, bir pseudoreference elektrot olarak hizmet vermektedir. stereotaksik koordinatlar standart fare beyin atlas elde edilmiştir. - Elektrotların sokulmasından önce, gerekli uzunlukta bunları kısaltır. Mekanik vericinin paslanmaz çelik sarmalın elektrodun ekstrakranial kısmını klibi.
NOT: Bu sistemde önemli bir parazite gibi Lehimleme kaçınılmalıdır. - stereotaksik cihazın dikey koluna elektrodu takın ve yukarıda belirtilen stereotaksik koordinatlarına göre elektrot yerleştirin.
- Cam iyonomer çimento kullanarak elektrotları düzeltmek ve çimento tamamen sertleşene kadar bekleyin.
- derisini kapatınemilmeyen 5-0 veya 6-0 sütür materyali ile aşırı ve üzerinde sütür kullanarak.
- Ameliyat sonrası ağrı tedavisinde, 4 gün üst üste post-implantasyon için günde bir kez Birleşik Devletlerde köpekler (5 mg / kg, deri altından, sc) yönetmek. Bu karprofen ilk kesi (adım 2.2.2) önce enjekte edilmelidir unutmayın.
- kayıtları ve / veya enjeksiyon deneyleri çalıştırılmadan önce 14 gün sonra implantasyon - hayvanlar 10 kurtarmak için izin verin.
Teta Oscillations ve Farmakolojik İndüksiyonunun 3. Spontan Kayıtlar
- Manyetik anahtarını kullanarak radyofrekans verici etkinleştirin. Alıcı plaka üzerinde evde kafes ile hayvan yerleştirin. En az 24-48 saat süreyle uzun vadeli hipokampal EEG kayıtları yapın.
NOT: EEG genlik ve uzun vadeli kayıtların EEG frekans özelliklerinin analizi sirkadiyen teta salınımlarının bağımlılık ve spesifik davranışsal ve onların dernek haline ayrıntılı fikir verirbilişsel koşullar / görevler. Her zaman deney hayvanlarının video izleme EEG kayıtları birleştirir. - teta salınımların farmakolojik indüksiyonu için, üretan (800 mg / kg ip) veya bir muskarinik reseptör agonistlerinin, tek bir doz, örneğin pilokarpin (10 mg / kg ip), arekolin gibi (0.3 mg / kg ip) veya oksotremorin tek bir dozunun uygulanması (0.03 mg / kg ip). periferal muskarinik reaksiyonları önlemek için, N-metilskopolaminin (0.5 mg / kg ip) ile fareler ön muamele. Taze% 0.9 NaCl veya Ringer çözeltisi içinde tüm ilaçları çözülür.
Not: muskarinik reseptör agonistlerinin daha yüksek dozajlar deney hayvanlarında nöbet indüksiyon neden olabilir. Ayrıca burada verilen dozlar soruşturması kapsamında fare hattında önceki doz-etki çalışmaları gerektiren işaretlerini temsil ettiğini düşünün. Not üretan ve depolanması sırasında uygun önlemleri gerektiren bir mutajen ve kanserojen olduğunu. - Atropin enjekte (50 mg / kg, ip) atropin duyarlı tip II ayırt etmek içinatropin-duyarsız tip I salınımlar, teta.
NOT: atropin dozu tekrar türlerin ve zorlanma bağlıdır ve önceki doz-etki değerlendirme gerektirir. atropin enjeksiyonu optimal zaman noktası muskarinik reseptör agonistlerinin farmakodinamik bağlıdır. tip II teta tanımlanması için, atropin enjeksiyonu 1 saat üretan uygulamadan sonra tavsiye edilir. - sistemik ilaç idaresi sonraki EEG kayıtları etkileyen küresel transkripsiyonel ve translasyonel desenleri, değiştirir gibi birçok ilaç müteakip uygulama önlemek için deneyin. kısa süreli teta salınımları aynı zamanda bagaj veya pençe sıkıştığı olarak, duyusal uyaranlar tarafından uyarılan olabilir unutmayın.
- Özü / uygulamalı ilaçların farmakokinetiğini ve bireysel çalışma protokolü taleplerini göz önünde bulundurarak ön faz (başlangıç) ve ASCI veya TXT dosyaları gibi toplam EEG kaydı post-enjeksiyon aşamasının ihracat temsilcisi EEG veri setleri.
4.EEG Elektrot Yerleştirme Doğrulama
- bir kuluçka odasına yerleştirerek hayvanları Euthanize ve% 100 karbondioksit tanıtmak. kuluçka odasında mevcut havaya eklenen karbondioksit ile dakika başına odası hacminin% 10-30 bir dolgu hızını kullanın; Bu hayvanlara en az stres ile hızlı bilinç neden olur.
- solunum yolları tıkanırsa ve soluk bir göz rengi 2-3 dakika boyunca devam kez odasından fareyi çıkarın.
- paslanmaz çelik elektrotlar kesin ve radyofrekans verici eksplantasyona. makas veya bir giyotin kullanarak fare başını kesmek ve cerrahi makas ve forseps ile yumuşak manipülasyon neurocranium gelen beyin kaldırmak.
- gece boyunca, fosfat tamponlu salin (PBS) (pH 7.4) içinde% 4 paraformaldehid içinde beyinleri düzeltildi. donmaya karşı koruma sağlamak için, daha sonra işlenene kadar 4 ° C 'de onları% 30 glükoz beyinleri transferi ve depolar.
NOT: Paraformaldehyde 2012 OSHA Haz tehlikeli olarak kabul edilirard Haberleşme Standart (29 CFR 1910.1200). gerekli tedbirleri almak: Kişisel koruyucu ekipman kullanımı, uygun havalandırma sağlamak ve toz oluşumunu önlemek. Buna ek olarak, Ateşleme kaynaklarını ortadan kaldırmak ve statik boşalmaya karşı gerekli tedbirleri almak. Paraformaldehyde çevreye bırakılmamalıdır olmamalıdır. - bir yapıştırıcı kullanılarak bir kriyostat doku tutucu çıkarılan beyin takın ve 40 içine beyinleri kesilmiş - 75 mikron koronal kesitler. cam slaytlar üzerine dilimleri monte ve standart histolojik prosedür kullanılarak Nissl mavi ile leke; Bu prosedür, önceki elektrot pozisyonunu yansıtır şube kanalı görselleştirmek olacaktır. Bir vibroslicer kullanarak yerel beyin koronal kesitler kesilmiş da mümkün olduğunu not
- Doğru EEG elektrot yerleştirme kriterlerini karşılayan yalnızca hayvanların dahil; CA1 bölgesi için, derin elektrot ucu CA1 piramidal katmanının içinde lokalize edilmelidir.
- Kayıt CA1 a priori filtre cut-off uygun bir örnekleme oranı ile intrahipokampal EEG.
NOT: Verici özgü olan örnekleme oranı, EEG analizi üst frekans limitini belirler. - bir analiz yazılımı ile kaydedilen verileri işlemek. Program zaman-frekans analizleri ve analiz yöntemleri yeterli kontrolü (Şekil 5) 20 ısmarlama prosedürleri ile hesaplamalar.
- 1 saat, her bir uzunluğa sahip bölümler halinde EEG kesin. hesaplama zamanı yüksek olduğu için, hızlı bilgisayar işlemcileri kullanın. Ayrıca, birden çok çekirdekler 20 bilgisayar parallelize bir yazılım faydalanmak.
6. EEG Veri Analizi
- sıklığını ve salınımların genliği hem de hesaplamak için karmaşık bir Morlet dalgacık veri kesimleri analiz edin.
NOT: Bu dalgacık (ör Ψ (x) = (π b)(- 1/2) exp (2 i π c x) b bant genişliği parametre merkez frekansı c exp (-x 2 / b), ve i sanal birim) sık sık EEG incelemek için literatürde tatbik edilmiştir veri, bu frekans ve zaman 23, 24, hem de optimum çözünürlüğü garanti olarak. - hala yeterli bir zaman çözünürlüğü ihmal değil iken, özellikle ağırlıkları frekans çözünürlüğü 0.1 Hz düzeyinde frekans farklılıkları ayırt etmek için bir bant genişliği parametresi ve orta frekans ayarını kullanın.
NOT: gama bandında nöronal süreçler 25 kısa sürelidir ve bu da teta ritimleri için de geçerlidir tutabilir. Böylece, analitik yaklaşım yeterli zamansal çözünürlüğe düşünmek gerekir. - Böylece tipik bir Delta, 0.1 Hz adım boyutu ile, 12 Hz - 0.2 arasındaki bir frekans aralığında EEG verileri analizta ve alfa frekans aralıkları.
- Teta salınımlar standart görsel denetim yerine teta frekans mimarisinin hazırlanması için otomatik, karmaşık analitik aracı kurmak; Bu prosedür, teta algılama yöntemi (TDM) olarak adlandırılır.
- teta frekans aralığı (3,5-8,5 Hz) maksimum genlik bölüm ve 2.5 s her zaman pencereleri için üst delta frekans aralığında maksimum genlik (2-3,4 Hz) hesaplayın.
NOT: Bir teta salınım oluştu eğer bir önlem karar olarak, bu sayının değeri vermektedir. teta frekans aralığının tanımı analiz edilecek fonksiyonel devlet ve nöroanatomik devresi / sistemine bağlı olarak değişebilir. - Bu kesimi sırasında hesaplanan oran 1.5 üzerinde ise "osilasyonel çağı" olarak bir segment sınıflandırır.
NOT: Bu en fazla teta genliği, ilgili 2,5-S EEG boyunca üst ö bandında genlik en az% 50 daha yüksek olduğunu garantisegmenti. oran kullanılan hat ve / veya türüne göre adaptasyon gerekebilir unutmayın. 2.5 sn aralık belli gürültülü dönemini yalancı pozitif algılamaları engeller, bir teta salınımı için asgari süreyi temsil eder ve diğer yayınlar 19, 26 aralık tanımları içinde yer almaktadır. fizyolojik ilgili delta aktivitesi yüksek teta aktivitesi sırasında nemlendirilmiş olan yavaş dalga uykusu sırasında, örneğin, olmayan teta dönemini sırasında görünür, çünkü üst delta frekans aralığı kontrol frekans bandı olarak hizmet vermektedir. - Her 1 saat bölüm için bu işlemi tekrarlayın; Bu nedenle, her bölüm, 2.5 s, her uzunluklarında 1.440 EEG parçadan oluşur.
- İstatistiksel tespit teta salınım dönemlerini verileri değerlendirmek.
- tespit teta dönemini toplam süresi kez istatistiklerini hesaplayınız; farklı veya önceden tanımlanmış grupları; Böyle aydınlık / karanlık olarak çevrimleri; ve diğerleri parametreleri.
NOT: Amerikaampüller vb t-testi, ANOVA, MANOVA veya değişken bağlı grupların sayısını, koşullar içerebilir - tespit teta dönemlere genliği istatistikleri hesaplamak, ancak teta frekans aralığında (3,5-8,5 Hz).
- tespit teta dönemlere sıklığı istatistikleri değerlendirmek, ancak teta frekans aralığında (3,5-8,5 Hz).
NOT: Bir teta çağın teta frekans teta çağın en teta genlik ait frekansı olarak tanımlanır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Teta aktivitesi merkezi sinir sistemi (CNS) bölgelerin geniş bir yelpazede kaydedilebilir. Burada, fare hipokampus gelen teta salınımlar ilişkin bir analizi sunması. Bu tür salınımlar farklı davranışsal ve bilişsel devletler sırasında oluşabilir. Oldukça hem spontane uzun vadeli, görevle ilgili kısa vadeli ve farmakolojik kaynaklı koşullar altında teta salınımların analiz etmek için tavsiye edilir.
Şekil 1 kontrol koşulları altında bir temsilci intrahipokampal CA1 kayıt göstermektedir. Hayvan spontane değilse "teta devlet," intrahipokampal EEG genellikle büyük düzensiz genlik (LIA) aktivitesi ile karakterize edilir. Muskarinik reseptör agonistleri (örn arekolin gibi, pilokarpin veya üretan) atropin (50 mg / kg, ip, Şekil 1) tarafından bloke edilebilir yüksek organize teta salınımlarının sonuçların İdaresi.
(Şekil 2) olarak 2.5 EEG dönemini sınıflandırmak için kullanılmıştır. Bu sınıflandırmaya göre, spontan koşullar ya da belirli davranışsal ve bilişsel görevler altında teta salınımlarının toplam süresini ölçmek mümkündür.
(Farmakolojik üretan / atropin teta diseksiyon gibi) 30 dakika EEG segmenti analiz etmek için, ilk olarak, bir renk-genlik (mV) gösterir 0,2-12 Hz frekans aralığı için bir zaman-frekans analizi gerçekleştirebilir kodlu moda (Şekil 3 A). Şekil 3, bir açık hale gelir, EEG (beyaz oklar) bir görsel kontrol ile belirlendi yüksek amplitüdlü teta aktivitesi, ö frekans aralığında düşük genlik eşlik eder. sonra, maksimum genlikleriteta (3,5-8,5 Hz) ve delta (2-3,4 Hz) frekans aralıkları çizilmiştir (Şekil 3 B). Sistematik korelasyon çalışmaları 1.5 aşan maksimum delta genlik, maksimum teta genlik oranı yüksek organize teta salınımları (Şekil 3 C) belirten ortaya koymuştur.
Şekil 4 üretan (Şekil 4 II beyaz daireler) hipokampal teta salınımlar neden olabilir gösterilmiştir. Üretan muskarinik reseptörler üzerindeki agonist etki nedeniyle, tip II teta tetikleyebilir bir çoklu hedef ilaçtır. Bir atropin enjeksiyonu (Şekil 4 III) ardından, bu tip II teta salınımları (atropin duyarlı teta salınımlar) yürürlükten kaldırılmıştır. Muskarinik alıcı agonistleri, atropin ek olarak, teta oluşumu ve teta blokaj zaman karakteristiklerini etkileyen bireysel farmakokinetik özelliklere sahip olduğunu dikkate alınması önemlidir. Atropin duyarsız tip I teta unaff kalır unutulmamalıdırmuskarinik reseptör antagonistleri tarafından ected.
Bütün teta tespit ve miktar tayini aracının bir özeti Şekil 5'de tasvir edilmiştir. Bu genlik, frekans ve toplam hesaplanmasında sonuçlanır / teta süresi anlamına gelir. Daha önce tarif edilen tekniklerin aksine, yüksek hassasiyetli bir dalgacık dayalı bir yaklaşım kullanır. Burada anlatılan analitik araç uygulamasının çeşitli alanları vardır. Teta salınımlar septohippocampal sistemi oluşturulur ve genellikle, Alzheimer hastalığı, örneğin nörodejeneratif süreçleri ile bozulmaktadır. Alzheimer hastalığının çok sayıda fare modelleri homoloji izomorfizm, ve tahmin değişir tarif edilmiştir. Diğer teta aktivitesinde bir artış göstermek için gösterilmiştir, oysa Bu modellerin bazıları, teta aktivitesinde bir azalma gösterdiği rapor edilmiştir, nedeni henüz belirlenmemiştir. Biz başarıyla teta algılama t uygulamalıool Alzheimer hastalığı 8 5XFAD modelinde değişmiş osilasyonel mimarisini karakterize etmek burada nitelendirdi. Bununla birlikte, aynı zamanda, epilepsi araştırma ve nöropsikiyatrik hastalıklar uygulanabilir.
Şekil 1: / 6 Fare C57BL Teta salınımlar. Spontan koşullar (I) 'in aşağıdaki üretan enjeksiyonu altında radiotelemetrik intrahipokampal CA1 kaydı (800 mg / kg, ip, II). üretan enjeksiyonu takiben, yüksek organize teta salınımlar atropin (50 mg / kg, ip) ile bloke edilebilir, görünür hale gelir. Bu rakam izni ile, referans 20 modifiye edilmiştir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 2: C57BL / 6 fare bir Derin CA1 EEG Kayıt A Dalgacık tabanlı analizi. (A ve B) İki 2.5-EEG dönemini görsel sırasıyla olmayan teta ve teta kesimleri, olarak sınıflandırılır, tasvir edilmiştir. (C ve D) genliği renk kodlu olmak 0,2-12 Hz aralığında A ve B görüntülenen CA1 EEG kesimleri, zaman-frekans analizi. Son derece senkronize teta salınımlar bir kesimi 6 Hz neredeyse sabit frekansta düzenli olmayan dalgalı yüksek genlik teta ile karakterize edilir ise C zaman-frekans analizi, frekans ve zaman konusunda düzensiz, dalgalı teta mimarisini sergiler. Maksimum delta genlik maksimum teta oranı C 1.25 ve D 4.67, açıkça sınıflandırmak
Şekil 3: Bir Dalgacık tabanlı Teta Algılama Aracı. (A) 30 dakika, EEG segmentinin zaman-frekans analizi üretan uygulamayı takiben kaydedilmiş (gösterilmemiştir). Karmaşık Morlet dalgacık dayalı analiz genlik (mV) olarak renk kodlu ile 0,2-12 Hz aralığında uygulandı. (B) Bu görüntü teta frekans bandında (3,5-8,5 Hz, yeşil) ve 30 dk EEG segmenti için üst delta bandı (kırmızı 2-3,4 Hz) maksimum genlik gösterir. (C) Bu rakam maksimum teta genlik oranı göstermektedir(b yeşil) ve (B kırmızı) maksimum delta genliği. yüksek senkronize teta salınımlar izni ile, bu rakam Referans 20 yeniden basıldı C. suprathreshold oranları ile ilişkili olduğunu unutmayın. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 4: Farmakolojik kaynaklı, yüksek organize Teta Titreşim ve Dalgacık tabanlı analizi. Örnek 30 dakikalık EEG bölümleri (gösterilmemiş olan) genlik (mV) olarak renk kodlu 0-12 Hz frekans aralığında analiz edilir. 800 mg / kg, ip A üretan enjeksiyonu, yaklaşık 6 Hz (beyaz daireler) bir baskın frekansa sahip yüksek organize teta salınımların parçalı bir oluşum içinde sonuçlanmıştır. bir tarafta50 mg / kg, ip de ropine enjeksiyon, bu teta titreşimler yürürlükten kaldırılmıştır. Bu rakam izni ile, Referans 20 yeniden basıldı. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 5: Murine CA1 dan kaydedilen yüksek organize Teta Titreşim miktarının belirlenmesi resimliyor Akış Şeması. Tip II teta salınımlar bir kayıt kontrolü (faz), bir post-enjeksiyon (örneğin, üretan, arekolin gibi, ya da pilokarpin) faz ve bir post-atropin faz (A1) kullanılarak analiz edilebilir. Her faz 30 dakika EEG segmentleri (A2) wavelet Yöntemi (B 1 ve B2) ile 0,2-12 Hz aralığında analiz zaman-frekans vardır. Sonra, teta segment algılama 2.5 s her biri teta aralığının zaman-frekans karakteristikleri (3,5-8,5 Hz, C2) ve EEG dönemini üst delta aralığı (2-3,4 Hz, C3) daha yakından bakmak veren (C1) başlatılır (C4 ve C5). Daha sonra, genlik maksimum değerleri (C6 ve C7) resmeden teta ve delta frekans aralığında analiz edilir. Teta / delta maksimum genliği 1.5 aşarsa, 2.5 EEG kademeli belirli bir genlik ve frekans (D1-D3) sahip, yüksek organize teta salınım (C8) arasında bir dönem olarak sınıflandırılır. Bu teta algılama aracı teta salınım mimarisi (E1) ölçümü için izin verir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Teta aktivitesi sistemik Nörofizyolojideki merkezi öneme sahiptir. Özellikle belirli davranış ve bilişsel ilişkin hippokampustaki, çeşitli beyin bölgelerinde görülmektedir. Buna ek olarak, hipokampal teta farmakolojik atropin duyarlı tip II ve atropin duyarsız tip I teta içine ayırt edilebilir. Tip I yürümek gibi veya çalışan, hareket ile ilişkili olduğu düşünülen 27, 28, 29, 30, 31, tip II uyarı-hareketsizlik durumuna 27, 28, 29, 30 boyunca görülebilir oysa. Uyarı-hareketsizlik durumları, örneğin 32, seyrek ve rastgele sesi veya dokunsal uyaranlara tarafından uyarılan edilebilir. Tip II teta da pa ilişkilidirssive tüm vücut rotasyonu 14. Paradoksal uyku sırasında, her ikisi de atropin duyarlı ve atropin dayanıklı teta ritimleri 33 mevcuttur. Dinlenme hareketsizlik devlet büyük düzensiz aktivitesi (LIA) 27 ile karakterizedir.
Genel olarak, teta titreşimler (pilokarpin, arekolin gibi, oksotremorin, vs. gibi üretan gibi muskarinik alıcı agonistleri, uygulanması yoluyla, örneğin), farmakolojik indüksiyonundan sonra spontan koşullan altında, ancak olabilir. unutmayın farmakodinamik, üretan tip II teta geliştirmek değil, aynı zamanda tip I teta inhibe bir çoklu hedef ilaçtır. Buna karşılık, pilokarpin, arekolin gibi, seçici tip II teta neden oksotremorinden. teta salınımlar meydana kadar kullanılan muskarinik agonistler farmakokinetiği bağlı olarak, o zaman değişken miktarda alır. Tip II atropin tarafından etkin bir bloke edilebilir. Kritik, domuskarinik agonist ve antagonistlerinin bilgeleri ikna etmek için ve blok tip II teta salınımlar türlerin ve zorlanma bağlıdır. Böylece, teta salınımlarının indüksiyon ve belirli bir bilimsel soru için kendi blokajı için optimal doz çözülmeye doz-etki çalışmalar yapmak kesinlikle gereklidir. Kısa ömürlü teta titreşimler aynı zamanda, bagaj ve pençe kıstırma duyu uyarıcılar tarafından indüklenebilir.
Genel olarak teta aktivitesinin karakterize edilmesi için farklı yaklaşımlar vardır. Sürekli veya süreksiz (frekans bandı ile ilgili) güç spektrum yoğunluğu (PSD) analizi / araziler veya bireysel frekans bantları için bir güç analizi ile sonuçlanan FFT tabanlı yaklaşımlar, frekans özellikleri hakkında değerli bilgiler sağlayan standart yaklaşımlardır.
Bununla birlikte, teta mimarisine daha karmaşık bir bilgi elde etmek için, ilave yaklaşımlar gerekli olduğu görünmektedir. Özellikle, biri farklı organda ilginizi çekebilirizational teta durumları ve yukarıda belirtilen prosedürlere doğrudan ve doğru olarak değerlendirilmesi mümkün değildir onların frekansları. Buna karşılık, burada sunulan yeni analitik teknik dalgacık tabanlı ve son derece organize, kısa vadeli teta salınımlar değerlendirilmesi yeteneğine sahiptir. Onlar da paroksismal, süreksiz teta aktivitesi dikkate standart teta gücü, uymamaktadır. Odak teta çağlarda için tipik olan EEG verilerinin belirli zaman-frekans karakteristiklerini ortaya etmektir. Böylece, yeni bir yöntem teta dönemini yalancı pozitif sınıflandırmaları engeller. Otomatik işlem uzun ömürlü EEG veri kümelerinin değerlendirilmesi garanti ve bu nedenle uzun süreli çalışmalar sırasında fizyolojik döngüleri (aydınlık / karanlık döngüsü veya sirkadiyen ritmisite) güvenilir istatistiksel karşılaştırmalar içerir.
Bu protokol, özellikle characteri olarak, nörodejeneratif hastalıkların hayvan modellerinde elde edilen EEG verilerinin analizinde özel bir önem taşımaktadırseptohippocampal oldukça düzenlenmiş teta mimarisi ve diğer sinir sistemlerinin yon. Karmaşık ve yüksek hassasiyetli teta analizi gelecekte EEG biyomarkerların olarak hizmet verebilir EEG parmak izlerini belirlemeye yardımcı olabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Carprofen (Rimadyl VET - Injektionslösung) | Pfizer | PZN 0110208208 | 20ml |
| binocular surgical magnification microscope | Zeiss Stemi 2000 | 0000001003877, 4355400000000, 0000001063306, 4170530000000, 4170959255000, 4551820000000, 4170959040000, 4170959050000 | |
| Dexpanthenole (Bepanthen Wund- und Heilsalbe) | Bayer | PZN: 1578818 | |
| drapes (sterile) | Hartmann | PZN 0366787 | |
| 70% ethanol | Carl Roth | 9065.5 | |
| 0.3% / 3% hydrogene peroxide solution | Sigma | 95321 | 30% stock solution |
| gloves (sterile) | Unigloves | 1570 | |
| dental glas ionomer cement | KentDental /NORDENTA | 957 321 | |
| heat-based surgical instrument sterilizer | F.S.T. | 18000-50 | |
| high-speed dental drill | Adeor | SI-1708 | |
| Inhalation narcotic system (isoflurane) | Harvard Apparatus GmbH | 34-1352, 10-1340, 34-0422, 34-1041, 34-0401, 34-1067, 72-3044, 34-0426, 34-0387, 34-0415, 69-0230 | |
| Isoflurane | Baxter 250 ml | PZN 6497131 | |
| Ketamine | Pfizer | PZN 07506004 | |
| Lactated Ringer's solution (sterile) | Braun | L7502 | |
| Nissl staining solution | Armin Baack | BAA31712159 | |
| pads (sterile) | ReWa Krankenhausbedarf | 2003/01 | |
| Steel and tungsten electrodes parylene coated | FHC Inc., USA | UEWLGESEANND | |
| stereotaxic frame | Neurostar | 51730M | ordered at Stoelting |
| (Stereo Drive-New Motorized Stereotaxic) | |||
| tapes (sterile) | BSN medical GmbH & Co. KG | 626225 | |
| TA10ETA-F20 | DSI | 270-0042-001X | Radiofrequency transmitter 3.9 g, 1.9 cc, input voltage range ± 2.5 mV, channel bandwidth (B) 1 - 200 Hz, nominal sampling rate (f) 1,000 Hz (f = 5B) temperature operating range 34 - 41 °C warranted battery life 4 months |
| TL11M2-F20EET | DSI | 270-0124-001X | Radiofrequency transmitter 3.9 g, 1.9 cc, input voltage range ± 1.25 mV, channel bandwidth (B) 1 - 50 Hz, nominal sampling rate (f) 250 Hz (f = 5B) temperature operating range 34 - 41 °C warranted battery life 1.5 months |
| Vibroslicer 5000 MZ | Electron Microscopy Sciences | 5000-005 | |
| Xylazine (Rompun) | Bayer | PZN: 1320422 | |
| Matlab | Mathworks Inc. | programming, computing and visualization software | |
| SPSS | IBM | statistical analysis software |
References
- Vanderwolf, C. H. Hippocampal electrical activity and voluntary movement in the rat. Electroencephalogr Clin Neurophysiol. 26, 407-418 (1969).
- Kahana, M. J., Seelig, D., Madsen, J. R.
- Varga, V., et al. The presence of pacemaker HCN channels identifies theta rhythmic GABAergic neurons in the medial septum. J Physiol. 586, 3893-3915 (2008).
- Takano, Y., Hanada, Y. The driving system for hippocampal theta in the brainstem: an examination by single neuron recording in urethane-anesthetized rats. Neurosci Lett. 455, 65-69 (2009).
- Goutagny, R., Manseau, F., Jackson, J., Danik, M., Williams, S. In vitro activation of the medial septum-diagonal band complex generates atropine-sensitive and atropine-resistant hippocampal theta rhythm: an investigation using a complete septohippocampal preparation. Hippocampus. 18, 531-535 (2008).
- Manseau, F., Goutagny, R., Danik, M., Williams, S. The hippocamposeptal pathway generates rhythmic firing of GABAergic neurons in the medial septum and diagonal bands: an investigation using a complete septohippocampal preparation in vitro. J Neurosci. 28, 4096-4107 (2008).
- Hangya, B., Borhegyi, Z., Szilagyi, N., Freund, T. F., Varga, V. GABAergic neurons of the medial septum lead the hippocampal network during theta activity. J Neurosci. 29, 8094-8102 (2009).
- Siwek, M. E., et al. Altered theta oscillations and aberrant cortical excitatory activity in the 5XFAD model of Alzheimer's disease. Neural Plast. 2015, 781731 (2015).
- Buzsaki, G. Theta oscillations in the hippocampus. Neuron. 33, 325-340 (2002).
- Buzsaki, G., et al. Hippocampal network patterns of activity in the mouse. Neuroscience. 116, 201-211 (2003).
- Buzsaki, G., Moser, E. I. Memory navigation and theta rhythm in the hippocampal-entorhinal system. Nat Neurosci. 16, 130-138 (2013).
- Shin, J.
- Shin, J., et al. Phospholipase C beta 4 in the medial septum controls cholinergic theta oscillations and anxiety behaviors. J Neurosci. 29, 15375-15385 (2009).
- Shin, J., Kim, D., Bianchi, R., Wong, R. K., Shin, H. S. Genetic dissection of theta rhythm heterogeneity in mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 18165-18170 (2005).
- Brown, D. A., Adams, P. R. Muscarinic suppression of a novel voltage-sensitive K+ current in a vertebrate neurone. Nature. 283, 673-676 (1980).
- Senkov, O., Mironov, A., Dityatev, A. A novel versatile hybrid infusion-multielectrode recording (HIME) system for acute drug delivery and multisite acquisition of neuronal activity in freely moving mice. Front Neurosci. 9, 425 (2015).
- Lundt, A., et al. EEG Radiotelemetry in Small Laboratory Rodents: A Powerful State-of-the Art Approach in Neuropsychiatric, Neurodegenerative, and Epilepsy Research. Neural Plast. 2016, 8213878 (2016).
- Papazoglou, A., et al. Non-restraining EEG radiotelemetry: epidural and deep intracerebral stereotaxic EEG electrode placement. J Vis Exp. (112), (2016).
- Csicsvari, J., Hirase, H., Czurko, A., Buzsaki, G. Reliability and state dependence of pyramidal cell-interneuron synapses in the hippocampus: an ensemble approach in the behaving rat. Neuron. 21, 179-189 (1998).
- Muller, R., et al. Atropine-sensitive hippocampal theta oscillations are mediated by Cav2.3 R-type Ca2+ channels. Neuroscience. 205, 125-139 (2012).
- Klausberger, T., et al. Brain-state- and cell-type-specific firing of hippocampal interneurons in vivo. Nature. 421, 844-848 (2003).
- Caplan, J. B., Madsen, J. R., Raghavachari, S., Kahana, M. J. Distinct patterns of brain oscillations underlie two basic parameters of human maze learning. J Neurophysiol. 86, 368-380 (2001).
- Montgomery, S. M., Buzsaki, G. Gamma oscillations dynamically couple hippocampal CA3 and CA1 regions during memory task performance. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 14495-14500 (2007).
- Kronland-Martinet, R., Morlet, J., Grossman, A. Analysis of sound patterns through wavelet transform. Int J Pattern Recognit Artif Intell. 1, 29 (1987).
- Buzsaki, G., Wang, X. J. Mechanisms of gamma oscillations. Annu Rev Neurosci. 35, 203-225 (2012).
- Goutagny, R., Jackson, J., Williams, S. Self-generated theta oscillations in the hippocampus. Nat Neurosci. 12, 1491-1493 (2009).
- Bland, B. H. The physiology and pharmacology of hippocampal formation theta rhythms. Prog Neurobiol. 26, 1-54 (1986).
- Leung, L. S. Generation of theta and gamma rhythms in the hippocampus. Neurosci Biobehav Rev. 22, 275-290 (1998).
- Shin, J., Talnov, A. A single trial analysis of hippocampal theta frequency during nonsteady wheel running in rats. Brain Res. 897, 217-221 (2001).
- Shin, J. A unifying theory on the relationship between spike trains, EEG, and ERP based on the noise shaping/predictive neural coding hypothesis. Biosystems. 67, 245-257 (2002).
- Kramis, R., Vanderwolf, C. H., Bland, B. H. Two types of hippocampal rhythmical slow activity in both the rabbit and the rat: relations to behavior and effects of atropine, diethyl ether, urethane, and pentobarbital. Exp Neurol. 49, 58-85 (1975).
- Lu, B. L., Shin, J., Ichikawa, M. Massively parallel classification of single-trial EEG signals using a min-max modular neural network. IEEE Trans Biomed Eng. 51, 551-558 (2004).
- Robinson, T. E., Kramis, R. C., Vanderwolf, C. H. Two types of cerebral activation during active sleep: relations to behavior. Brain Res. 124, 544-549 (1977).
