Summary
Deze techniek laat een efficiënte manier om replicatie-defecte retrovirale aandelen dat codeert voor een menselijk oncogen voor te bereiden, en vervolgens gebruikt voor de inductie van myeloproliferatieve ziekte in de muis model.
Abstract
Ons laboratorium onderzoek naar menselijke myeloproliferatieve ziekten veroorzaakt door dergelijke oncogenen als Bcr-Abl of groeifactor receptor-afgeleide oncogenen (ZNF198-FGFR1, Bcr-PDGFRα, etc.). We zijn in staat om het model en een mens-achtige ziekte te bestuderen in ons muismodel, door het transplanteren van beenmergcellen die eerder geïnfecteerd met een retrovirus uiting van de oncogen van belang. Replicatie-defecte retrovirus dat codeert voor een menselijk oncogen en een marker (GFP, RFP, antibiotica-resistentie-gen, enz.) wordt geproduceerd door een transiënte transfectie protocol met behulp van 293T-cellen, een menselijke nier epitheel cellijn getransformeerd door het adenovirus E1A genproduct. 293 cellen hebben de bijzondere eigenschap dat zeer transfectable door calciumfosfaat (Capo 4), met maximaal 50-80% transfectie-efficiëntie gemakkelijk haalbaar. Hier hebben we co-transfecteren 293 cellen met een retrovirale vector uiting van de oncogen van belang en een plasmide die de gag-pol-env verpakking functies, zoals de single-genoom verpakking kat of PCL, bouwt in dit geval de Ecopak plasmide uitdrukt. De initiële transfectie wordt verder verbeterd door het gebruik van chloroquine. Voorraden ecotropic virus, verzameld als cultuur supernatant 48 uur. post-transfectie, kunnen worden opgeslagen bij -80 ° C en worden gebruikt voor infectie van cel-lijnen in het licht van transformatie en in vitro studies, of primaire cellen zoals beenmergcellen van de muis, die vervolgens kunnen voor transplantatie worden gebruikt in ons muismodel .
Protocol
- De avond voor transformatie, plaat 293T cellen in 3-5x10 6 cellen / 6 cm weefsel cultureplate.
Opmerking: Wij gebruiken 293T-cellen voor hun gemak van transfectie en efficacyas virus producerende cellen. Deze cellen zijn deficiënt in de verpakking van het virus, tenzij een helper plasmide wordt geïntroduceerd.
- De eerste ochtend, voorzichtig verwijderen medium en te vervangen door 4 ml 293T-cellen med die 25 mM Chloroquine. Zet in de incubator gedurende 1 uur.
Let op: de plaat moet ongeveer 80% confluent.
- Ondertussen bereiden virus-maken mengsel voor 2 borden tegelijk, in 5 ml buizen:
- 2 x 10 mg retrovirale plasmideconstruct
- 2 x 5 mg verpakking construct (Ecopak),
- 2 x 62 ml CaCl
- compleet tot 1 ml met een steriele DDH 2 O
Opmerking: Als het retrovirale plasmide codeert voor het oncogen van belang en een marker, Ecopak codeert gag-pol-env. Samen met de 293T cellen, zullen zij een ecotropic retrovirus (RV) die specifiek zijn voor muizen cellen, maar niet besmettelijk voor de menselijke cellen. Zowel Chloroquine en CaCl 2 is aangetoond dat transfectie-efficiëntie te verhogen.
- Voeg 1 ml 2x sterileHBS druppelsgewijs aan het mengsel, terwijl zachtjes vortexen de buis.
- Onmiddellijk toevoegen deze oplossing tot en met 2 platen, 1 ml per stuk, zachtjes, druppel voor druppel.
- Zet in incubator voor 7 tot 11 uur.
- In de avond (7 tot 11 uur. Later), voorzichtig verwijderen medium, en heel voorzichtig te vervangen door 5 ml vers 293T medium. Zet in incubator tot het middaguur, de volgende dag.
Let op: deze stap is belangrijk, als je nodig hebt om op te stijgen van de chloroquine van de cellen. Indien gedurende langere tijd, chloroquine is giftig. De oplossing in de platen ziet er vaag, als gevolg van een zeer fijne, stof-achtige neerslaan van de transfectie mengsel.
Opmerking: Het is belangrijk om te doen alle media veranderingen met extreme zachtheid, zoals de cellen zijn gesensibiliseerd door de chloroquine, en kan gemakkelijk los van de plaat.
- De volgende dag, 18 tot 24 uur. voor het ophalen van het virus (rond de middag), voorzichtig verwijderen medium, en heel voorzichtig te vervangen door 3 ml vers 293T medium. Vervang in de incubator O / N.
- De derde morgen (18 tot 24 uur. Later) voorzichtig zuigen het medium vormen de platen met een 10 ml injectiespuit voorzien van een 18 G naald. Dit supernatant bevat het retrovirus.
- Vervang de naald een 45 mm spuitfilter, omkeren spuit een paar keer om de oplossing goed te mengen, passeren supernatant door het filter, en aliquot in cryotubes
Opmerking: Als alternatief, als u het maken van 3 + platen van virus, zwembad de hele supernatanten van hetzelfde virus in een 5 0 ml conische buis. Meng goed, dan hoeveelheid supernatanten die het retrovirus in cryotubes door te filteren.
- De buizen met het virus vol supematanten worden gehouden in -80 ° C tot gebruik.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vier kritieke punten zullen verzekeren het succes van een goede viral voorraad:
- De 293T-producerende cellen moeten zijn erg gezond, wat betekent dat ze zijn gesplitst op een zeer regelmatig schema, werden nooit overwoekerd, en zijn vergulde bij de optimale dichtheid van 3.5-5 miljoen per 6 cm weefselkweek bord, zodat ze een dichtheid te bereiken van 80% van de plaat op de ochtend van de transfectie.
- Toevoeging van chloroquine verbetert de transfectie-efficiëntie en de daaropvolgende virustiter, ongeveer 3 - tot 5-voudig, door het stabiliseren van cel lysozomes en het verhogen van de fractie van DNA, dat de kern bereikt. Natriumbutyraat (een andere lysosoom stabilisator) is ook gebruikt voor dit doel. Chloroquine kan worden weggelaten, in welk geval het veranderen van de medium 7-11 uur. post-transfectie op dit punt is niet vereist.
- De kwaliteit van het DNA is erg belangrijk. De beste methode van zuivering van zowel de vector en de verpakking plasmide DNA wordt twee keer gezuiverd door CsCl-ethidiumbromide drijvend dichtheid centrifugeren. We willen de concentratie van het DNA ten minste 1 mg / ml, en de OD 260/280 verhouding moet tussen de 1.75-1.90. Qiagen-gezuiverde DNA zal ook werken, hoewel in de handen van de auteurs, zijn de resultaten niet zo goed. Het is belangrijk dat de gecombineerde volume van de DNA-oplossingen klein zijn (<50 ul totaal per finale ml) om de negatieve gevolgen van de Tris en EDTA (TE) op de calcium-fosfaat neerslag te vermijden.
- De keuze van de retrovirale vector en gastheer bereik van de verpakking te construeren zijn belangrijk. Voor stabiele expressie in muriene hematopoietische stamcellen, is een vector gebaseerd op de myeloproliferatieve sarcoma virus voorkeur. Een veel voorkomende vector backbone is de MIG RI, met daarin een MPSV lange terminale herhaling reeks, een multiple cloning site voor de invoering van een oncogen, en een downstream-interne ribosoom entry website gekoppeld aan het gen voor een betere groen fluorescerend eiwit (eGFP). Voor de transductie van HSC muis, virus met een ecotropic gastheerbereik is optimaal, maar die voorraden zijn instabiel bij fysiologische temperatuur en kan niet worden geconcentreerd door middel van centrifugeren.
Een aantal check-points: Indien gewenst, eenmaal geoogst, de 293-cellen kunnen worden gebruikt om eiwitten te maken voor lysaten immunoblotting om de expressie van eiwitten gecodeerd door de retrovirale vector (bijvoorbeeld de TK) te controleren. We gebruiken ook een LacZ codering controle plasmide in aparte plaat op het moment van transfectie (geen verpakking vector nodig) om voor transfectie rendement advieskosten controleren door beta-gal test bij het verzamelen van het supernatans van de andere platen. Let op: deze test de cellen en reagentia, maar niet de kwaliteit van de plasmiden gebruikt voor het maken van virussen.
Voordat u een virus, de titer dient te worden bepaald. Dit is essentieel om de titers van verschillende virusvoorraden wedstrijd in hetzelfde experiment, en om een efficiënte transductie van hematopoietische stamcellen te garanderen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| 293T cells | cell-line | Split 1:3 to 1:4 every 3 days, otherwise they will tend to clump with replating and will not transfect as well. | ||
| 293T cell medium | DMEM/hi-glu + 10 % FBS + 1% Pen/Strep + 1% L-Glutamine (1% NEAA, optional). We obtain our tissue culture slutions from CellGro. | |||
| coding DNA plasmid | Twice purified by CsCl. MSCV backbone, encoding oncogene and marker of choice (Neo, GFP, etc.) | |||
| EcoPak | also called pMCV-Ecopac: ecotropic packaging plasmid, encoding gag-pol-env | |||
| 2x HBS | For 500 ml: 8.0 g NaCl+ 0.37 g KCl + 106.5 mg Na2HPO4 (anhydrous; 201.1 mg if 7xH2O) + 1.0 g dextrose (D-glucose) + 5.0 g HEPES powder. Dissolve in 450 ml dH2O (milli-Q), adjust pH to 7.05 with NaOH, then complete to 500 ml with dH2O. Sterile filter thru 0.45 μ filter. Store at room temperature, with the cap on tight. | |||
| 2M CaCl2 | Sigma-Aldrich | |||
| miliQ H2O | sterile-filtered | |||
| Chloroquine | 1000x stock is 25 mM in PBS- (w/o Ca2+/Mg2+), stored at -20C. Add fresh to the medium when needed. | |||
| 6 cm plates | for tissue culture | |||
| Incubator | for tissue culture. Set at 37C, 10% CO2. | |||
| 10 cc sterile syringes | Sterile. One per virus type. | |||
| 18G needles | single use, one per virus type. | |||
| 45 um syringe filters | ||||
| 5 ml plastic tubes | Sterile, to mix transfection solution, for up to 2 plates at a time (2 ml). We use Falcon tubes. | |||
| 50 ml conical tubes | ||||
| cryovials | 2 and 4 ml, for virus aliquots. | |||
All reagents used in the transfection must be sterile-filtered (CaCl2, 2x HBS, miliQ H2O) and kept sterile. |
||||
References
- DuBridge, R. B., Tang, P., Hsia, H. C., Leong, P. M., Miller, J. H., Calos, M. P. Analysis of mutation in human cells by using an Epstein-Barr virus shuttle system. Mol Cell Biol. 7, 379-387 (1987).
- Cherry, S. R., Biniszkiewicz, D., van Parijs, L., Baltimore, D., Jaenisch, R. Retroviral expression in embryonic stem cells and hematopoietic stem cells. Mol Cell Biol. 20, 7419-7426 (2000).
- Finer, M. H., Dull, T. J., Qin, L., Farson, D., Roberts, M. kat: A high-efficiency retroviral transduction system for primary human T lymphocytes. Blood. 83, 43-50 (1994).
- Naviaux, R. K., Costanzi, E., Haas, M., Verma, I. M. The pCL vector system: rapid production of helper-free, high-titer, recombinant retroviruses. J Virol. 70, 5701-5705 (1996).
- Pear, W. S., Miller, J. P., Xu, L., Pui, J. C., Soffer, B., Quackenbush, R. C., Pendergast, A. M., Bronson, R., Aster, J. C., Scott, M. L., Baltimore, D. Efficient and rapid induction of a chronic myelogenous leukemia-like myeloproliferative disease in mice receiving P210 bcr/abl-transduced bone marrow. Blood. 92, 3780-3792 (1998).
- Pear, W. S., Nolan, G. P., Scott, M. L., Baltimore, D. Production of high-titer helper-free retroviruses by transient transfection. Proc Natl Acad Sci USA. 90, 8392-8396 (1993).
- Stocking, C., Kollek, R., Bergholz, U., Ostertag, W. Long terminal repeat sequences impart hematopoietic transformation properties to the myeloproliferative sarcoma virus. Proc Natl Acad Sci USA. 82, 5746-5750 (1985).
- Van Etten, R. A. Models of chronic myeloid leukemia. Curr Oncol Rep. 3, 228-237 (2001).
- Van Etten, R. A. Studying the pathogenesis of BCR-ABL+ leukemia in mice. Oncogene. 21, 8643-8651 (2002).
