Summary
Diese Technik zeigt eine effiziente Möglichkeit, replikationsdefekte retroviralen Aktien Kodierung eines menschlichen Onkogen vorzubereiten, und anschließend zur Induktion der myeloproliferativen Erkrankung im Mausmodell verwendet.
Abstract
Unsere Laborstudien menschlichen myeloproliferativen Erkrankungen durch solche Onkogene als Bcr-Abl-oder Wachstumsfaktor-Rezeptor-derived Onkogene (ZNF198-FGFR1, Bcr-PDGFRα, etc.) induziert. Wir sind in der Lage zu modellieren und zu studieren eine dem Menschen ähnliche Erkrankung in unserem Mausmodell durch die Transplantation von Knochenmarkzellen zuvor mit einem Retrovirus Ausdruck des Onkogens von Interesse infiziert. Replikationsdefekte Retrovirus-Codierung ein menschliches Onkogen und ein Marker (GFP, RFP, Antibiotika-Resistenz-Gen, etc.) wird durch eine transiente Transfektion Protokoll mit 293T-Zellen, eine humane, renale epitheliale Zelllinie durch das Adenovirus E1A Genprodukt transformiert. 293-Zellen haben die ungewöhnliche Eigenschaft, sehr transfizierbare von Calciumphosphat (CaPO 4), mit bis zu 50-80% Transfektionseffizienz leicht erreichbar. Hier, Co-Transfektion wir 293-Zellen mit einem retroviralen Vektor, das Onkogen von Interesse und ein Plasmid, das die gag-pol-env Verpackung Funktionen, wie die Single-Genom Verpackung Konstrukte kat oder PCL, in diesem Fall die Ecopak Plasmid exprimiert. Die ersten Transfektion wird durch Verwendung von Chloroquin verbessert. Die Bestände an ecotropen Virus, wie Kulturüberstand 48 Stunden gesammelt. nach der Transfektion kann bei -80 ° C gelagert werden und zur Infektion von Zell-Linien im Hinblick auf die Transformation und in vitro-Untersuchungen oder primäre Zellen, wie zB Knochenmarkszellen der Maus, die dann für die Transplantation in unserem Mausmodell verwendet werden können .
Protocol
- Der Abend vor der Transformation, Platten-293T-Zellen in 3-5x10 6 Zellen / 6 cm Gewebe cultureplate.
Hinweis: Wir verwenden 293T-Zellen für ihre einfache Transfektion und efficacyas Virus-produzierenden Zellen. Diese Zellen weisen einen Mangel an Verpackung des Virus sei denn, ein Helfer-Plasmid eingeführt.
- Am ersten Morgen, entfernen und ersetzen Sie mit 4 ml 293T Zelle med mit 25 mM Chloroquin. Legen Sie in Inkubator für 1 Stunde.
Hinweis: Die Platte sollte ca. 80% konfluent.
- In der Zwischenzeit bereiten Virus-machen Mischung für 2 Platten zu einer Zeit, in 5 ml Röhrchen:
- 2 x 10 mg retroviralen Plasmid-Konstrukt
- 2 x 5 mg Verpackung Konstrukt (Ecopak)
- 2 x 62 ml CaCl
- komplette auf 1 ml mit sterilem ddH 2 O
Hinweis: Während des retroviralen Plasmid kodiert das Onkogen von Interesse und ein Marker kodiert Ecopak gag-pol-env. Zusammen mit dem 293T-Zellen, werden sie erzeugen eine ecotropen Retrovirus (RV) spezifisch für Maus-Zellen, aber nicht infektiös für den menschlichen Zellen. Beide Chloroquin und CaCl 2 wurde gezeigt, dass die Transfektionseffizienz zu erhöhen.
- Add 1 ml 2x sterileHBS die Mischung tropfenweise, unter leichtem Vortexen der Röhre.
- Unmittelbar fügen Sie diese Lösung, um 2 Platten, je 1 ml, sanft, Tropfen für Tropfen.
- Legen Sie in Inkubator für 7 bis 11 Uhr.
- Am Abend (7 bis 11 Uhr. Später), entfernen Medium, und sehr vorsichtig mit 5 ml frisch 293T Medium zu ersetzen. Legen Sie in Inkubator bis Mittag des nächsten Tages.
Hinweis: Dieser Schritt ist wichtig, da man, um aus dem Chloroquin aus den Zellen benötigt. Wenn für längere Zeit gehalten werden, ist Chloroquin giftig. Die Lösung in den Platten sieht verschwommen, durch eine sehr feine, staubförmige Fällung der Transfektion Mischung.
Hinweis: Es ist wichtig, dass alle Medien ändert sich mit extremen Milde zu tun, wie die Zellen wurden sensibilisiert durch die Chloroquin, und kann leicht von der Platte zu lösen.
- Am nächsten Tag, 18 bis 24 Uhr. vor dem Abrufen des Virus (gegen Mittag), entfernen Medium, und sehr vorsichtig mit 3 ml frisch 293T Medium zu ersetzen. Ersetzen Sie in Inkubator O / N.
- Der dritte Morgen (18 bis 24 Uhr. Höher), sanft saugen das Medium bilden die Platten mit einer 10 ml Spritze mit einer 18 G Nadel ausgestattet. Dieser Überstand enthält das Retrovirus.
- Wechseln Sie die Nadel auf eine 45 mm Spritzenfilter, Invertzucker Spritze mehrmals, um die Lösung gut mischen, pass Überstand durch Filter und Aliquots in Kryoröhrchen
Hinweis: Alternativ, wenn Sie machen 3 + Platten von Viren, Pool alle Überstände des gleichen Virus in eine 5 0 ml konischen Rohr. Gut mischen, dann aliquoten Überstände mit dem Retrovirus in Kryoröhrchen durch Filterung.
- Das Röhrchen mit dem Virus-full Überstände werden in -80 ° C gehalten, bis verwendet.
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Discussion
Vier kritische Punkte sorgen für den Erfolg eines guten viralen Lager:
- Die 293T Zellen haben sich als sehr gesund, das heißt sie auf einer sehr regelmäßigen Abständen wurden aufgeteilt, wurden nie überwachsen und sind bei der optimierten Dichte von 3,5 bis 5.000.000 pro 6 cm Gewebekultur Platte ausplattiert, so dass sie eine Dichte erreichen von 80% der Platte am Morgen der Transfektion.
- Die Zugabe von Chloroquin verbessert Transfektionseffizienz und anschließende Virustiter, ca. 3 - bis 5-fache, durch die Stabilisierung Zelle lysozomes und die Erhöhung des Anteils der DNA, die den Kern erreicht. Sodium Butyrat (ein weiterer Lysosom Stabilisator) hat auch für diesen Zweck verwendet worden. Chloroquin kann verzichtet werden, in welchem Fall Wechsel des Mediums 7-11 Uhr. nach der Transfektion an dieser Stelle ist nicht erforderlich.
- Die Qualität der DNA ist sehr wichtig. Die bevorzugte Methode der Reinigung sowohl der Vektor-und Verpackungs-Plasmid-DNA wird zweimal durch CsCl-Ethidiumbromid Schwebedichte Zentrifugation gereinigt. Wir mögen die Konzentration der DNA von mindestens 1 mg / ml, und die OD 260/280 Ratio sollte zwischen 1,75-1,90 werden. Qiagen-gereinigte DNA wird auch daran arbeiten, obwohl in den Händen der Autoren, die Ergebnisse sind nicht so gut. Es ist wichtig, dass das kombinierte Volumen von DNA-Lösungen klein (<50 ul insgesamt pro endgültigen ml) zu negativen Auswirkungen von Tris und EDTA (TE) auf den Calcium-Phosphat-Fällung zu vermeiden.
- Die Wahl des retroviralen Vektors und Wirtsspektrum der Verpackung zu konstruieren sind wichtig. Für eine stabile Expression in murinen hämatopoetischen Stammzellen ist ein Vektor auf der myeloproliferativen Sarkom-Virus basiert bevorzugt. Ein gemeinsamer Vektor-Rückgrat ist die MIG RI, die einen MPSV long terminal repeat Sequenz, eine multiple Klonierungsstelle für die Einführung eines Onkogens, und einem nachgeschalteten internen Ribosomeneintrittsstelle im Zusammenhang mit dem Gen für Enhanced Green Fluorescent Protein (eGFP). Für die Transduktion Maus HSC, Virus mit einem ecotropen Wirtsspektrum ist optimal, aber diese Bestände instabil sind bei physiologischen Temperaturen und kann nicht durch Zentrifugation konzentriert werden.
Einige Check-Punkte: Falls gewünscht, einmal geerntet, die 293-Zellen können verwendet werden, um Proteinlysate für Immunoblotting auf die Expression von Proteinen durch den retroviralen Vektor (zB die TK) kodiert überprüfen zu machen. Wir verwenden außerdem eine LacZ-Codierung Kontroll-Plasmid in separate Platte zum Zeitpunkt der Transfektion (keine Verpackung vector erforderlich) zur Transfektion efficinecy von beta-gal-Assay zu überprüfen, wenn wir den Überstand der anderen Platten zu sammeln. Hinweis: Diese werden die Zellen und Reagenzien zu testen, aber nicht die Qualität der Plasmide für Viren machen verwendet.
Vor dem Einsatz von Viren, muss der Titer bestimmt werden. Dies ist entscheidend, um Titer von verschiedenen Virusstämmen in das gleiche Experiment übereinstimmen, und eine effiziente Transduktion von hämatopoetischen Stammzellen zu gewährleisten.
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Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| 293T cells | cell-line | Split 1:3 to 1:4 every 3 days, otherwise they will tend to clump with replating and will not transfect as well. | ||
| 293T cell medium | DMEM/hi-glu + 10 % FBS + 1% Pen/Strep + 1% L-Glutamine (1% NEAA, optional). We obtain our tissue culture slutions from CellGro. | |||
| coding DNA plasmid | Twice purified by CsCl. MSCV backbone, encoding oncogene and marker of choice (Neo, GFP, etc.) | |||
| EcoPak | also called pMCV-Ecopac: ecotropic packaging plasmid, encoding gag-pol-env | |||
| 2x HBS | For 500 ml: 8.0 g NaCl+ 0.37 g KCl + 106.5 mg Na2HPO4 (anhydrous; 201.1 mg if 7xH2O) + 1.0 g dextrose (D-glucose) + 5.0 g HEPES powder. Dissolve in 450 ml dH2O (milli-Q), adjust pH to 7.05 with NaOH, then complete to 500 ml with dH2O. Sterile filter thru 0.45 μ filter. Store at room temperature, with the cap on tight. | |||
| 2M CaCl2 | Sigma-Aldrich | |||
| miliQ H2O | sterile-filtered | |||
| Chloroquine | 1000x stock is 25 mM in PBS- (w/o Ca2+/Mg2+), stored at -20C. Add fresh to the medium when needed. | |||
| 6 cm plates | for tissue culture | |||
| Incubator | for tissue culture. Set at 37C, 10% CO2. | |||
| 10 cc sterile syringes | Sterile. One per virus type. | |||
| 18G needles | single use, one per virus type. | |||
| 45 um syringe filters | ||||
| 5 ml plastic tubes | Sterile, to mix transfection solution, for up to 2 plates at a time (2 ml). We use Falcon tubes. | |||
| 50 ml conical tubes | ||||
| cryovials | 2 and 4 ml, for virus aliquots. | |||
All reagents used in the transfection must be sterile-filtered (CaCl2, 2x HBS, miliQ H2O) and kept sterile. |
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References
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