Summary
טכניקה זו ממחישה דרך יעילה כדי להכין את השכפול פגום מניות retroviral קידוד oncogene אדם, לאחר מכן נעשה שימוש לזירוז המחלה myeloproliferative במודל עכבר.
Abstract
מחקרים במעבדה שלנו מחלות myeloproliferative האדם הנגרמת על ידי אונקוגנים כגון Bcr-Abl או גורם הגדילה לקולטן הנגזרות אונקוגנים (ZNF198-FGFR1, Bcr-PDGFRα וכו '). אנו מסוגלים מודל מחקר מחלות אנושיות, כמו במודל העכבר שלנו, על ידי השתלת תאים במח העצם נגוע בעבר עם רטרווירוס ביטוי oncogene של עניין. שכפול-פגום רטרווירוס קידוד oncogene האדם סמן (GFP, RFP, גן עמידות לאנטיביוטיקה, וכו ') מופק על ידי פרוטוקול transfection חולף באמצעות תאים 293T, קו אנושי כליות תא אפיתל ממיר את המוצר adenovirus גן E1A. 293 תאים יש את המאפיין יוצא דופן להיות transfectable מאוד על ידי סידן זרחתי (Capo 4), עם יעילות של עד 50-80% transfection להשגה בקלות. כאן, אנו שיתוף transfect 293 תאים עם וקטור retroviral ביטוי oncogene עניין פלסמיד המבטא את איסור הפרסום-pol-env פונקציות אריזה, כגון הגנום יחיד אריזה בונה קאט או PCL, במקרה זה EcoPak פלסמיד. Transfection הראשונית היא שיפור נוסף על ידי שימוש chloroquine. מניות של הנגיף ecotropic, שנאספו supernatant תרבות 48 שעות. פוסט transfection, ניתן לאחסן -80 ° C ו המשמש זיהום של קווי תאים לאור השינוי במבחנה, או תאים ראשוניים כגון עצם לתאי מוח העכבר, כי לאחר מכן ניתן להשתמש להשתלה במודל העכבר שלנו .
Protocol
- ערב קודם, השינוי התאים צלחת 293T ב 3-5x10 6 תאים / 6 cultureplate רקמות ס"מ.
הערה: אנו משתמשים 293T תאים על מנת להקל שלהם transfection ותאי efficacyas וירוס לייצר. תאים אלו חסרים האריזה וירוס אלא עוזר פלסמיד הוא הציג.
- בבוקר הראשון, בעדינות להסיר ולהחליף בינוני עם 4 מ"ל 293T תא התרופה המכילה 25 chloroquine מ"מ. מכניסים חממה שעות 1.
הערה: הצלחת צריך להיות בערך 80% ומחוברות.
- בינתיים, להכין וירוס קבלת תערובת עבור 2 צלחות בכל פעם, ב 5 צינורות מ"ל:
- 2 x 10 מ"ג לבנות פלסמיד retroviral
- 2 x 5 מ"ג האריזה לבנות (EcoPak),
- 2 x 62 מ"ל CaCl
- להשלים עם 1 מ"ל סטרילי DDH 2 O
הערה: בעוד retroviral פלסמיד המקודד את oncogene עניין סמן, EcoPak מקודד איסור הפרסום-pol-env. יחד עם תאים 293T, הם יוכלו לייצר רטרווירוס ecotropic (RV) ספציפית בתאי עכבר, אך לא זיהומיות עבור תאים אנושיים. שני chloroquine, CaCl 2 הוכחו להגביר את היעילות transfection.
- הוסף 1ml של sterileHBS 2x ירידה מבחינת לתערובת, תוך vortexing בעדינות את הצינורית.
- מיד להוסיף את פתרון 2 צלחות, 1 מ"ל כל אחת, בעדינות, טיפה אחר טיפה.
- שים באינקובטור במשך 7 עד 11 שעות.
- בשעות הערב (7-11 שעות. מאוחר יותר), להסיר בעדינות בינוני מאוד בעדינות להחליף עם בינוני 5 מ"ל 293T טריים. מכניסים החממה עד הצהריים, למחרת.
הערה: שלב זה הוא חשוב, אתה צריך לקחת את chloroquine מן התאים. אם כל הזמן לפרקי זמן, chloroquine רעיל. הפתרון של הצלחות נראה מטושטש, בשל משקעים מצוין כמו אבק, של התערובת transfection.
הערה: חשוב לעשות את כל השינויים התקשורת בעדינות קיצוניים, כמו התאים להיות רגיש על ידי chloroquine, והוא יכול בקלות לנתק מן הצלחת.
- למחרת, 18-24 שעות. לפני שלקח את וירוס (בצהריים), להסיר בעדינות בינוני מאוד בעדינות להחליף עם המדיום מ"ל 3 293T טריים. החלף באינקובטור O / נ
- בבוקר השלישי (18-24 שעות. מאוחר יותר), בעדינות למצוץ את הטופס המדיום צלחות עם מזרק 10 מ"ל מצויד במחט G 18. Supernatant זה מכיל את רטרווירוס.
- שנה את המחט לסנן מזרק 45 מ"מ, להפוך מזרק מספר פעמים כדי לערבב את פתרון טוב, לעבור דרך supernatant סינון aliquot ב cryotubes
הערה: לחילופין, אם אתה עושה 3 + צלחות של הנגיף, בריכת כל supernatants של הנגיף אותו לתוך צינור 5 מ"ל 0 חרוטי. מערבבים היטב, אז supernatants aliquot המכיל את הרטרווירוס cryotubes ידי סינון.
- צינורות המכילים את הנגיף מלא supernatants נשמרים -80 ° C עד בשימוש.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ארבע נקודות קריטיות יבטיח את ההצלחה של מניות ויראלי טוב:
- התאים לייצר 293T צריך להיות מאוד בריא, כלומר הם היו מפוצלים לפי לוח זמנים קבוע מאוד, מעולם לא היו מגודלים, והם מצופה בצפיפות של 3.5-5000000 מותאם לכל צלחת 6 ס"מ תרבות רקמות, כדי שיוכלו להגיע צפיפות של 80% הצלחת בבוקרו של transfection.
- הוספת chloroquine משפרת את היעילות ואת transfection titer וירוס לאחר מכן, כ 3 - עד פי 5, על ידי ייצוב lysozomes תא והגדלת החלק היחסי של ה-DNA המגיעה לגרעין. בוטיראט נתרן (עוד מייצב ליזוזום) שימש גם למטרה זו. Chloroquine ניתן להשמיט, ובמקרה שינוי בינוני 7-11 שעות. פוסט transfection בשלב זה אינו נדרש.
- האיכות של ה-DNA הוא מאוד חשוב. השיטה המועדפת של טיהור וקטור והן DNAs אריזה פלסמיד מטוהרים פעמיים CsCl-ethidium צנטריפוגה צפיפות קליל ברומיד. אנחנו אוהבים את ריכוז הדנ"א להיות לפחות 1 מ"ג / מ"ל, והיחס 260/280 OD צריך להיות בין 1.75-1.90. Qiagen מטוהרים-DNA גם לעבוד, אם כי, בידי החוקרים, התוצאות הן לא פחות טוב. חשוב כי נפח בשילוב של פתרונות ה-DNA להיות קטן (<50 סה"כ ul לכל מ"ל הסופי), כדי למנוע תופעות לוואי של טריס ו EDTA (TE) על המשקע סידן פוספט.
- הבחירה של טווח וקטור מארח retroviral של לבנות את האריזה חשובים. עבור ביטוי יציב Murine בתאי גזע hematopoietic, וקטור מבוסס על נגיף סרקומה myeloproliferative היא העדיפה. עמוד השדרה וקטור המשותף הוא RI MIG, המכיל לחזור ארוך MPSV מסוף רצף, אתר שיבוט מרובים עבור המבוא של אונקוגן, ואת ערך הזרם הפנימי הריבוזום באתר המקושר הגן של חלבון פלואורסצנטי ירוק משופרת (eGFP). עבור התמרה של העכבר HSC, וירוס עם מגוון מארח ecotropic הוא אופטימלי, אבל מניות כאלה אינם יציבים בטמפרטורת פיזיולוגי ולא יכול להיות מרוכז על ידי צנטריפוגה.
יש לבדוק נקודות: אם תרצה, שנקטפו אחת, 293 תאים יכול לשמש כדי להפוך lysates חלבון עבור immunoblotting כדי לבדוק את הביטוי של החלבונים המקודדים על ידי וקטור retroviral (למשל, TK). אנו משתמשים גם שליטה קידוד LacZ פלסמיד בצלחת נפרדת בזמן transfection (אין וקטור אריזה הצורך) כדי לבדוק efficinecy transfection ידי assay beta-gal כאשר אנו אוספים את supernatant של לוחות אחרים. הערה: זה יהיה לבדוק את התאים ריאגנטים, אך לא את האיכות של פלסמידים משמש להכנת וירוס.
לפני השימוש בכל וירוס, titer צריך להיות נחוש. זה קריטי כדי להתאים titers מניות וירוס שונים בניסוי זהה, כדי להבטיח התמרה יעיל בתאי גזע hematopoietic.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| 293T cells | cell-line | Split 1:3 to 1:4 every 3 days, otherwise they will tend to clump with replating and will not transfect as well. | ||
| 293T cell medium | DMEM/hi-glu + 10 % FBS + 1% Pen/Strep + 1% L-Glutamine (1% NEAA, optional). We obtain our tissue culture slutions from CellGro. | |||
| coding DNA plasmid | Twice purified by CsCl. MSCV backbone, encoding oncogene and marker of choice (Neo, GFP, etc.) | |||
| EcoPak | also called pMCV-Ecopac: ecotropic packaging plasmid, encoding gag-pol-env | |||
| 2x HBS | For 500 ml: 8.0 g NaCl+ 0.37 g KCl + 106.5 mg Na2HPO4 (anhydrous; 201.1 mg if 7xH2O) + 1.0 g dextrose (D-glucose) + 5.0 g HEPES powder. Dissolve in 450 ml dH2O (milli-Q), adjust pH to 7.05 with NaOH, then complete to 500 ml with dH2O. Sterile filter thru 0.45 μ filter. Store at room temperature, with the cap on tight. | |||
| 2M CaCl2 | Sigma-Aldrich | |||
| miliQ H2O | sterile-filtered | |||
| Chloroquine | 1000x stock is 25 mM in PBS- (w/o Ca2+/Mg2+), stored at -20C. Add fresh to the medium when needed. | |||
| 6 cm plates | for tissue culture | |||
| Incubator | for tissue culture. Set at 37C, 10% CO2. | |||
| 10 cc sterile syringes | Sterile. One per virus type. | |||
| 18G needles | single use, one per virus type. | |||
| 45 um syringe filters | ||||
| 5 ml plastic tubes | Sterile, to mix transfection solution, for up to 2 plates at a time (2 ml). We use Falcon tubes. | |||
| 50 ml conical tubes | ||||
| cryovials | 2 and 4 ml, for virus aliquots. | |||
All reagents used in the transfection must be sterile-filtered (CaCl2, 2x HBS, miliQ H2O) and kept sterile. |
||||
References
- DuBridge, R. B., Tang, P., Hsia, H. C., Leong, P. M., Miller, J. H., Calos, M. P. Analysis of mutation in human cells by using an Epstein-Barr virus shuttle system. Mol Cell Biol. 7, 379-387 (1987).
- Cherry, S. R., Biniszkiewicz, D., van Parijs, L., Baltimore, D., Jaenisch, R. Retroviral expression in embryonic stem cells and hematopoietic stem cells. Mol Cell Biol. 20, 7419-7426 (2000).
- Finer, M. H., Dull, T. J., Qin, L., Farson, D., Roberts, M. kat: A high-efficiency retroviral transduction system for primary human T lymphocytes. Blood. 83, 43-50 (1994).
- Naviaux, R. K., Costanzi, E., Haas, M., Verma, I. M. The pCL vector system: rapid production of helper-free, high-titer, recombinant retroviruses. J Virol. 70, 5701-5705 (1996).
- Pear, W. S., Miller, J. P., Xu, L., Pui, J. C., Soffer, B., Quackenbush, R. C., Pendergast, A. M., Bronson, R., Aster, J. C., Scott, M. L., Baltimore, D. Efficient and rapid induction of a chronic myelogenous leukemia-like myeloproliferative disease in mice receiving P210 bcr/abl-transduced bone marrow. Blood. 92, 3780-3792 (1998).
- Pear, W. S., Nolan, G. P., Scott, M. L., Baltimore, D. Production of high-titer helper-free retroviruses by transient transfection. Proc Natl Acad Sci USA. 90, 8392-8396 (1993).
- Stocking, C., Kollek, R., Bergholz, U., Ostertag, W. Long terminal repeat sequences impart hematopoietic transformation properties to the myeloproliferative sarcoma virus. Proc Natl Acad Sci USA. 82, 5746-5750 (1985).
- Van Etten, R. A. Models of chronic myeloid leukemia. Curr Oncol Rep. 3, 228-237 (2001).
- Van Etten, R. A. Studying the pathogenesis of BCR-ABL+ leukemia in mice. Oncogene. 21, 8643-8651 (2002).
