Summary
이 기술은 인간의 oncogene을 인코딩 복제 - 결함 retroviral 주식을 준비하는 효율적인 방법을 보여줍니다, 그리고 이후 마우스 모델에 myeloproliferative 질병의 유도에 사용.
Abstract
BCR - ABL 또는 성장 인자 수용체 - 파생 oncogenes (ZNF198 - FGFR1, BCR - PDGFRα 등) 같은 oncogenes에 의해 유도된 우리 연구실 연구 인간 myeloproliferative 질병. 우리는 이전에 관심 oncogene을 표현하는 레트로 바이러스에 감염된 골수 세포를 이식함으로써, 우리의 마우스 모델에서 인간과 같은 질병을 모델 공부하실 수 있습니다. 복제 - 결함이있는 레트로 바이러스 인간 oncogene을 인코딩 및 마커 (GFP, RFP, 항생제 저항 유전자 등) 293T 세포, 아데노 바이러스 E1A 유전자 제품에 의해 변형 인간 신장 상피 세포주를 사용하여 과도 transfection 프로토콜에 의해 만들어진 것입니다. 최대 쉽게 달성 50-80%의 transfection 효율을 가진 293 세포는 인산 칼슘 (카포 4)에 의해 높은 transfectable되는 독특한 속성을 가집니다. 여기, 우리는 관심의 oncogene과 같은 포장이 경우 켓 또는 PCL을 구성 단일 게놈 EcoPak 플라스미드로 재갈 - POL - 환경을 포장 기능을 표현하는 플라스미드을 표현 retroviral 벡터와 함께 293 세포를 transfect에게 공동. 초기 transfection은 더욱 chloroquine의 사용에 의해 향상됩니다. ecotropic 바이러스의 주식, 문화 뜨는 48 시간으로 수집. 포스트 transfection은, C는 ° -80에 저장된 그런 다음 마우스 모델에서 이식에 사용할 수있는 변화의보기에 체외 연구에서 세포 - 선, 또는 마우스 골수 세포와 같은 기본 세포의 감염 사용할 수 있습니다 .
Protocol
- 3 - 5x10 6 셀 / 6cm 조직 cultureplate에서 변형, 플레이트 293T 세포 전에하세요.
참고 : 우리는 transfection하고 efficacyas 바이러스 생산 세포들의 편의를 위해 293T 세포를 사용합니다. 플라스미드 도우미가 도입되지 않는 한 이러한 세포가 바이러스를 포장에 부족한 수 있습니다.
- 첫 번째 아침 부드럽게 매체를 제거하고 4 ML 293T 세포 의대 25 MM의 Chloroquine을 포함로 바꿉니다. 1 시간을위한 인큐베이터에 넣어.
참고 : 접시 약 80 % 합류해야합니다.
- 한편, 5 ML 튜브에서 한 번에 두 접시를위한 바이러스 제작 혼합 준비 :
- 2 X 10 MG retroviral 플라스미드 구축
- 2 X 5 MG 포장 건설 (EcoPak)
- 2 X 62 ML CaCl
- 무균 ddH 2 O 1 ML 완료
참고 : retroviral 플라스미드 관심과 마커의 oncogene을 인코딩하는 동안 EcoPak는 개그 - POL - 환경을 인코딩합니다. 함께 293T 세포로, 그들은 ecotropic 마우스 세포에 대한 구체적인 레트로 바이러스 (RV),하지만 인간의 세포에 대한 infective를 생산합니다. Chloroquine과 CaCl 2 모두는 transfection 효율을 높이는 표시되었습니다.
- 2X sterileHBS의 1ml 부드럽게 튜브를 vortexing하면서 혼합물 드롭 현명한을 추가합니다.
- 즉시 부드럽게 두 접시, 1 ML 각에이 솔루션을 추가 드롭하여 놓습니다.
- 7-11 시간을위한 인큐베이터에 넣어.
- 저녁 (7-11 시간. 이상)에서 부드럽게 매체를 제거하고 매우 부드럽게 5 ML 신선한 293T 매체로 바꿉니다. 정오, 다음날까지 인큐베이터에 넣어.
참고 :이 단계는 당신이 세포에서 chloroquine를 벗을 필요로 중요합니다. 오랜 기간 동안 보관하는 경우, chloroquine은 독성이다. 접시에있는 해결 방법은 transfection 혼합물의 아주 좋은, 먼지와 같은 강수로 인해 희미 보인다.
참고 : 세포 chloroquine에 의해 sensitized되어 있고, 쉽게 플레이트에서 분리 수있는, 극도의 온유와 모든 매체 변경을 수행하는 것이 중요합니다.
- 그 다음날은 18 세 24 시간. 바이러스 (정오 정도) 검색하기 전에, 부드럽게 중간 제거하고 매우 부드럽게 3 ML 신선한 293T 매체로 바꿉니다. 보육 O / N.으로 바꾸기
- 세번째 아침 (18-24 시간. 나중에)는 부드럽게 18 G 바늘 장착되어 10 ML의 주사기와 매체 양식 접시를 빨아. 이 뜨는은 레트로 바이러스가 포함되어 있습니다.
- , 45mm의 필터 주사기에 바늘을 변경 잘 솔루션을 혼합하기 위해 주사기를 여러 번 반전, 필터를 통해 뜨는 통과하고, cryotubes에서 나누어지는
참고 : 또는, 당신이 5 0 ML 원뿔 관에 바이러스, 수영장 같은 바이러스의 모든 supernatants을 3 + 번호판을 만드하는 경우. 필터링하여 cryotubes에 레트로 바이러스를 포함하는 나누어지는의 supernatants 다음 잘 섞는다.
- 바이러스 전체 supernatants을 포함하고있는 튜브가 사용하기 전까지 -80 ° C에 보관됩니다.
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Discussion
네 중요한 포인트는 좋은 바이러스 주식의 성공을 보장합니다
- 293T 생산 세포들은 밀도에 도달 있도록, 그들은 매우 정기적인 일정에 따라 분할되었습니다 의미 매우 건강해야 자란 없었다면, 그리고 6cm 조직 문화 플레이트 당 3.5-5000000의 최적화된 밀도에 비쳐지게 만들려합니다 transfection의 아침에 접시의 80 %.
- 셀 lysozomes을 안정화하고 핵에 도달 DNA의 분율을 증가하여 5 배 이상에 - chloroquine의 또한 약 3 transfection 효율 이후 바이러스 titer를 향상시킵니다. 나트륨 butyrate는 (다른 lysosome 안정제)도이 목적에 사용되고 있습니다. Chloroquine은 매체 7-11 시간을 변경하는 경우에는 생략할 수 있습니다. 이 시점에서 이후의 transfection이 필요하지 않습니다.
- DNA의 품질은 매우 중요합니다. 벡터 및 포장 플라스미드 DNAs 모두의 정화의 선호하는 방법은 두 번 CsCl - ethidium의 브로마이드 부력 밀도 원심 분리에 의해 정화됩니다. 우리는 최소한 1 MG / ML하는 DNA의 농도를 같이하고, OD 280분의 260 비율은 1.75-1.90 사이 여야합니다. 저자의 손에, 결과가 좋다되지 않은,하지만 Qiagen - 정화의 DNA는 또한 작동합니다. 그것은 DNA 솔루션의 결합 볼륨이 인산 칼슘의 침전에 트리스와 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) (TE)의 악영향을 피하기 위해 (최종 ML 당 <50 UL 합계) 작은 것이 중요합니다.
- 포장 구조의 retroviral 벡터와 호스트 범위의 선택은 중요합니다. murine 조혈 줄기 세포에 안정적인 표현, myeloproliferative 육종 바이러스를 기반으로 벡터 좋습니다. 일반적인 벡터 백본은 MPSV 긴 터미널 반복 시퀀스, oncogene의 도입에 대한 여러 복제 사이트 및 향상된 녹색 형광 단백질 (eGFP)의 유전자에 연결된 스트림 내부 ribosome 항목 사이트를 포함, MIG RI입니다. 와 마우스 HSC, 바이러스의 전달을위한 ecotropic 호스트 범위는 최적이지만, 이러한 주식 physiologic 온도에서 불안정하고 원심 분리하여 농축 수 없습니다.
일부 체크 포인트 : 원하는 경우, 한 번 수확, 293 세포가 retroviral 벡터 (예를 들어, TK)에 의해 인코딩 단백질의 표현을 확인하는 immunoblotting을위한 단백질 lysates를 만들기 위해 사용할 수 있습니다. 우리는 또한 우리가 다른 접시의 표면에 뜨는를 수집할 경우 베타 여자 분석하여 transfection의 efficinecy를 확인 transfection의 시간 (아무 포장 벡터가 필요 없습니다)에서 별도의 플레이트에 플라스미드 LacZ 인코딩 제어를 사용합니다. 참고 :이 바이러스 제작에 사용되는 plasmids의 품질 전지 및 시약을 테스트하지만,하지 않습니다.
바이러스를 사용하기 전에, titer가 결정되어야합니다. 이것은 동일한 실험에서 서로 다른 바이러스 주식 titers 일치하고, 조혈 줄기 세포의 효율적 전달을 보장하기 위해 중요합니다.
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Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| 293T cells | cell-line | Split 1:3 to 1:4 every 3 days, otherwise they will tend to clump with replating and will not transfect as well. | ||
| 293T cell medium | DMEM/hi-glu + 10 % FBS + 1% Pen/Strep + 1% L-Glutamine (1% NEAA, optional). We obtain our tissue culture slutions from CellGro. | |||
| coding DNA plasmid | Twice purified by CsCl. MSCV backbone, encoding oncogene and marker of choice (Neo, GFP, etc.) | |||
| EcoPak | also called pMCV-Ecopac: ecotropic packaging plasmid, encoding gag-pol-env | |||
| 2x HBS | For 500 ml: 8.0 g NaCl+ 0.37 g KCl + 106.5 mg Na2HPO4 (anhydrous; 201.1 mg if 7xH2O) + 1.0 g dextrose (D-glucose) + 5.0 g HEPES powder. Dissolve in 450 ml dH2O (milli-Q), adjust pH to 7.05 with NaOH, then complete to 500 ml with dH2O. Sterile filter thru 0.45 μ filter. Store at room temperature, with the cap on tight. | |||
| 2M CaCl2 | Sigma-Aldrich | |||
| miliQ H2O | sterile-filtered | |||
| Chloroquine | 1000x stock is 25 mM in PBS- (w/o Ca2+/Mg2+), stored at -20C. Add fresh to the medium when needed. | |||
| 6 cm plates | for tissue culture | |||
| Incubator | for tissue culture. Set at 37C, 10% CO2. | |||
| 10 cc sterile syringes | Sterile. One per virus type. | |||
| 18G needles | single use, one per virus type. | |||
| 45 um syringe filters | ||||
| 5 ml plastic tubes | Sterile, to mix transfection solution, for up to 2 plates at a time (2 ml). We use Falcon tubes. | |||
| 50 ml conical tubes | ||||
| cryovials | 2 and 4 ml, for virus aliquots. | |||
All reagents used in the transfection must be sterile-filtered (CaCl2, 2x HBS, miliQ H2O) and kept sterile. |
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References
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