Summary
Denna teknik visar ett effektivt sätt att förbereda replikering-defekta retrovirus lager kodar en människa onkogen, och därefter används för induktion av myeloproliferativ sjukdom i musmodell.
Abstract
Vår laboratoriestudier mänskliga myeloproliferativa sjukdomar som orsakas av sådan onkogener som Bcr-Abl-eller tillväxtfaktor receptor-derived onkogener (ZNF198-FGFR1, Bcr-PDGFRα etc.). Vi kan modellera och studera en mänsklig-liknande sjukdom i vår musmodell, genom att transplantera benmärgsceller tidigare infekterats med ett retrovirus som uttrycker onkogen av intresse. Replikering-defekt retrovirus kodar en människa onkogen och en markör (GFP, RFP, gen för antibiotikaresistens, etc.) är producerad av en transient transfektion protokoll med 293T celler, en mänsklig nedsatt epitelceller linje förvandlas genom adenovirus E1A genprodukten. 293 celler har den ovanliga egenskapen att vara mycket transfectable av kalciumfosfat (CAPO 4), med upp till 50-80% transfektion effektivitet lätt att uppnå. Här samarbete transfektera vi 293 celler med ett retrovirus vektor som uttrycker onkogen av intresse och en plasmid som uttrycker gag-pol-ENV förpackningar funktioner, såsom den enda-genomet förpackningar konstruktioner kat eller PCL, i detta fall Ecopak plasmiden. Den initiala transfektion förbättras ytterligare med hjälp av klorokin. Lagren av ecotropic virus, som samlats in som supernatant 48 timmar. efter transfektion, kan förvaras vid -80 ° C och används för infektion av cell-linjer på grund av omvandling och in vitro studier, eller primära celler såsom benmärg hos möss celler, som sedan kan användas för transplantation i vår musmodell .
Protocol
- Kvällen innan förvandlingen, plåt 293T celler vid 3-5x10 6 celler / 6 cm vävnad cultureplate.
Observera: Vi använder 293T celler för sin enkla transfektion och efficacyas virus celler. Dessa celler är brist på förpackningar viruset inte en hjälpare plasmid införs.
- Den första morgonen, ta försiktigt bort medium och ersätt med 4 ml 293T cell med innehållande 25 mM klorokin. Sätt i inkubator för 1 tim.
Observera: plattan bör vara ca 80% konfluenta.
- Under tiden förbereder virus som gör blandning för 2 tallrikar på en gång, i 5 ml rör:
- 2 x 10 mg retrovirala plasmid konstruera
- 2 x 5 mg förpackningar konstruera (Ecopak)
- 2 x 62 ml CaCl
- komplett med 1 ml med steril DDH 2 O
OBS: Även om retrovirala plasmiden kodar onkogen av intresse och en markör, kodar Ecopak gag-pol-ENV. Tillsammans med 293T celler, kommer de att producera en ecotropic retrovirus (RV) specifik för musceller, men inte smittsam för mänskliga celler. Både klorokin och CaCl 2 har visat sig öka transfektion effektivitet.
- Tillsätt 1 ml 2x sterileHBS droppvis till blandningen under lätt vortexa röret.
- Omedelbart lägga till denna lösning till två plattor, 1 ml vardera, försiktigt, droppe för droppe.
- Sätt i kuvös under 7 till 11 timmar.
- På kvällen (7 till 11 timmar. Senare), ta försiktigt bort medium och mycket försiktigt ersätta med 5 ml färsk 293T medium. Sätt i kuvös tills middagstid nästa dag.
OBS: Detta steg är viktigt eftersom du måste ta av klorokin från cellerna. Om den förvaras under en längre tid, klorokin giftigt. Lösningen i plattorna ser suddiga, på grund av en mycket fin, damm-liknande utfällning av transfektion blandningen.
OBS: Det är viktigt att göra alla medier förändras med extrem mildhet, eftersom cellerna har sensibiliserade av klorokin, och kan lätt ta bort från plattan.
- Nästa dag, 18 till 24 timmar. innan du hämtar viruset (tolvtiden), försiktigt bort medium och mycket försiktigt ersätta med 3 ml färsk 293T medium. Byt i kuvös O / N.
- Den tredje morgonen (18 till 24 timmar. Senare), försiktigt suga upp mediet formen plattorna med en 10 ml spruta med en 18 G nål. Detta supernatant innehåller retrovirus.
- Byt nål för att en 45 mm sprutfilter, vänd spruta flera gånger så att lösningen blandas väl, passera supernatanten genom filter, och delprov i cryotubes
Obs: Alternativt, om du gör 3 + plattor av virus, pool alla supernatanterna av samma virus i en 5 0 ml koniska rör. Blanda väl, då alikvot supernatanterna innehåller retrovirus i cryotubes genom filtrering.
- Rören innehåller virus-full supernatanterna förvaras i -80 ° C tills används.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Fyra kritiska punkter kommer att försäkra framgång för en bra viral lager:
- Den 293T celler måste vara mycket frisk, vilket innebär att de har delats upp på ett mycket regelbundet schema, aldrig igen, och är klädd i den optimerade täthet av 3,5 till 5.000.000 per 6 cm vävnadsodling tallrik, så att de når en densitet 80% av plåten på morgonen den transfektion.
- Tillägg av klorokin förbättrar transfektion effektivitet och efterföljande virus titer, ca 3 - till 5-faldig, genom att stabilisera cellen lysozomes och öka den del av DNA som når kärnan. Natrium butyrat (en annan lysosome stabilisator) har också använts för detta ändamål. Klorokin kan utelämnas, då förändras på medellång 7-11 timmar. post-transfektion vid denna punkt krävs inte.
- Kvaliteten på DNA är mycket viktigt. Den rekommenderade metoden för rening av både vektor och förpackning plasmid DNA är dubbelt renas genom CsCl-etidiumbromid stigande densitet centrifugering. Vi gillar koncentrationen av DNA ska vara minst 1 mg / ml, och OD 260/280 förhållandet bör vara mellan 1,75-1,90. Qiagen-renade DNA kommer också att arbeta, även i händerna av författarna är resultaten inte lika bra. Det är viktigt att den sammanlagda volymen av DNA-lösningar vara små (<50 ul totalt per sista ml) för att undvika negativa effekter av Tris och EDTA (TE) på kalciumfosfat fällningen.
- Valet av retrovirus vektor och värd utbud av förpackningen konstruera är viktiga. För stabila uttryck i murina hematopoetiska stamceller, är en vektor baserad på myeloproliferativa sarkom viruset föredra. En vanlig vektor ryggrad är MIG RI, som innehåller en MPSV lång sekvens terminal upprepar, en multipel kloning plats för införandet av en onkogen, och en nedströms intern ribosomer inträde webbplats kopplad till genen för förbättrad grönt fluorescerande protein (EGFP). För transduktion av musen HSC, virus med en ecotropic värdspektrum är optimal, men sådana bestånd är instabila vid fysiologisk temperatur och kan inte koncentreras genom centrifugering.
Vissa check-points: Om så önskas, en gång skördas, kan 293 celler användas för att göra protein lysates för immunoblotting att kontrollera uttrycket av proteiner som kodas av retrovirus vektor (t.ex. TK). Vi använder också en LacZ kodning kontroll plasmiden i separat plåt vid tiden för transfektion (ingen förpackning vektor behövs) för att leta transfektion efficinecy genom beta-gal-analysen när vi samlar in supernatanten av de andra plattorna. Obs: detta kommer att testa celler och reagenser, men inte kvaliteten på de plasmider som används för viruset att göra.
Innan du använder något virus, behöver titern som skall fastställas. Detta är avgörande för att matcha titrar av olika virus bestånd i samma experiment, och säkerställa en effektiv transduktion av hematopoetiska stamceller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| 293T cells | cell-line | Split 1:3 to 1:4 every 3 days, otherwise they will tend to clump with replating and will not transfect as well. | ||
| 293T cell medium | DMEM/hi-glu + 10 % FBS + 1% Pen/Strep + 1% L-Glutamine (1% NEAA, optional). We obtain our tissue culture slutions from CellGro. | |||
| coding DNA plasmid | Twice purified by CsCl. MSCV backbone, encoding oncogene and marker of choice (Neo, GFP, etc.) | |||
| EcoPak | also called pMCV-Ecopac: ecotropic packaging plasmid, encoding gag-pol-env | |||
| 2x HBS | For 500 ml: 8.0 g NaCl+ 0.37 g KCl + 106.5 mg Na2HPO4 (anhydrous; 201.1 mg if 7xH2O) + 1.0 g dextrose (D-glucose) + 5.0 g HEPES powder. Dissolve in 450 ml dH2O (milli-Q), adjust pH to 7.05 with NaOH, then complete to 500 ml with dH2O. Sterile filter thru 0.45 μ filter. Store at room temperature, with the cap on tight. | |||
| 2M CaCl2 | Sigma-Aldrich | |||
| miliQ H2O | sterile-filtered | |||
| Chloroquine | 1000x stock is 25 mM in PBS- (w/o Ca2+/Mg2+), stored at -20C. Add fresh to the medium when needed. | |||
| 6 cm plates | for tissue culture | |||
| Incubator | for tissue culture. Set at 37C, 10% CO2. | |||
| 10 cc sterile syringes | Sterile. One per virus type. | |||
| 18G needles | single use, one per virus type. | |||
| 45 um syringe filters | ||||
| 5 ml plastic tubes | Sterile, to mix transfection solution, for up to 2 plates at a time (2 ml). We use Falcon tubes. | |||
| 50 ml conical tubes | ||||
| cryovials | 2 and 4 ml, for virus aliquots. | |||
All reagents used in the transfection must be sterile-filtered (CaCl2, 2x HBS, miliQ H2O) and kept sterile. |
||||
References
- DuBridge, R. B., Tang, P., Hsia, H. C., Leong, P. M., Miller, J. H., Calos, M. P. Analysis of mutation in human cells by using an Epstein-Barr virus shuttle system. Mol Cell Biol. 7, 379-387 (1987).
- Cherry, S. R., Biniszkiewicz, D., van Parijs, L., Baltimore, D., Jaenisch, R. Retroviral expression in embryonic stem cells and hematopoietic stem cells. Mol Cell Biol. 20, 7419-7426 (2000).
- Finer, M. H., Dull, T. J., Qin, L., Farson, D., Roberts, M. kat: A high-efficiency retroviral transduction system for primary human T lymphocytes. Blood. 83, 43-50 (1994).
- Naviaux, R. K., Costanzi, E., Haas, M., Verma, I. M. The pCL vector system: rapid production of helper-free, high-titer, recombinant retroviruses. J Virol. 70, 5701-5705 (1996).
- Pear, W. S., Miller, J. P., Xu, L., Pui, J. C., Soffer, B., Quackenbush, R. C., Pendergast, A. M., Bronson, R., Aster, J. C., Scott, M. L., Baltimore, D. Efficient and rapid induction of a chronic myelogenous leukemia-like myeloproliferative disease in mice receiving P210 bcr/abl-transduced bone marrow. Blood. 92, 3780-3792 (1998).
- Pear, W. S., Nolan, G. P., Scott, M. L., Baltimore, D. Production of high-titer helper-free retroviruses by transient transfection. Proc Natl Acad Sci USA. 90, 8392-8396 (1993).
- Stocking, C., Kollek, R., Bergholz, U., Ostertag, W. Long terminal repeat sequences impart hematopoietic transformation properties to the myeloproliferative sarcoma virus. Proc Natl Acad Sci USA. 82, 5746-5750 (1985).
- Van Etten, R. A. Models of chronic myeloid leukemia. Curr Oncol Rep. 3, 228-237 (2001).
- Van Etten, R. A. Studying the pathogenesis of BCR-ABL+ leukemia in mice. Oncogene. 21, 8643-8651 (2002).
