Summary
鼠全层皮肤移植是一种行之有效的模型来研究排斥同种免疫的设置。在这里，我们提供了执行的BALB / c每个步骤的教程 - >的C57BL / 6的全层皮肤移植。
Abstract
鼠全层皮肤移植是一种行之有效的体内模型来研究同种免疫反应和移植排斥。尽管它的应用有限给人类，小鼠皮肤移植已被广泛用于移植研究。该程序是很容易学习和执行，并且它不需要细腻的显微外科技术，也没有广泛的培训。此外，在该模型中移植排斥反应发生在一个非常可重复的免疫反应，并且容易地通过直接检查和触诊监测。此外，与供体匹配的或第三方皮肤移植继发的皮肤移植可以在更复杂的移植模型作为替代，并评估供体特异性耐受简单的方法进行。的并发症是低，并且在一般限于在手术后麻醉过量或呼吸窘迫。移植失败，另一方面，通常发生作为制备较差克的结果船尾，不正确的定位于移植床上，或包扎不当位置。在这篇文章中，我们提出了小鼠全层皮肤移植的协议，并描述必需的成功过程中的重要步骤。
Introduction
器官移植是选择用于患者的终末期器官衰竭的治疗和结果都与在外科手术和免疫抑制剂的协议的进步显着提高。然而，长期免疫抑制与显著的副作用，以及促进容忍新的战略发展仍然现代移植研究的目标。
许多动物模型已经开发了用于移植的基础研究，研究移植排斥反应的机制和测试用于防止移植排斥和促进长期耐受1-3的免疫抑制方法。小鼠模型已成为免疫学研究的中流砥柱，由于诊断和治疗性抗体和良好定义的近交系和转基因品系的独家和广阔的可用性。皮肤移植的是，不需要特殊的显微技术和可以简单的程序轻松术后监测。总之，小鼠皮肤移植一直是一个特殊的工具来研究许多方面参与同种免疫反应，包括抗原呈递细胞贩运，和移植排斥4,5期间组织破坏。
在这里，我们展示了一步一步的程序使用鼠标模型皮肤全层移植，而我们描述必要的移植皮肤移植成功的重要步骤。
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Protocol
所有程序均按照指南的护理与健康研究所（NIH）的实验室动物的用途进行，由约翰霍普金斯大学动物护理和使用委员会（JHUACUC）获得批准。经批准的ACUC协议MO13M292和MO13M370下进行的具体程序。
1.捐赠皮肤丰收
- 麻醉供体小鼠异氟醚（感应蒸发器4％，在维持1 - 2％，通过鼠标锥）。使用脚趾捏撤回反射来监测麻醉深度。
- 使用电动剃须刀，剃动物的背部，并用10％聚维酮碘（ 例如 ，聚维酮碘）消毒它。
- 在乳晕结缔组织的水平使用无菌剪刀，手套和无菌技术，从臀部到颈部收获供体背部皮肤，用钝器解剖。
- 安乐死颈椎脱位动物收获后植皮。
- 在显微镜下，分离结缔组织，脂肪组织，并用细切断术剪刀背部皮肤肉膜。肉膜负责皮肤抽搐动作的薄的，透明的肌肉。
- 使用无菌仪器技术，切出15毫米×15毫米的移植物从背部皮肤为10毫米×10毫米至15毫米×15毫米的接枝床。
- 储存在冰上的培养皿用无菌磷酸盐缓冲盐水（PBS）中浸泡的纱布的移植物。
注：8 - 10移植可以从一个供体小鼠获得。
2.收件人皮肤移植
- 麻醉受体小鼠异氟醚（感应蒸发器4％，在维持1 - 2％，通过鼠标锥）。使用脚趾捏撤回反射来监测麻醉深度。
- 辖丁丙诺啡0.02毫克/千克体重缓解术后疼痛。
- 剃动物的背部的一侧的接枝无线LL是插入并用10％聚维酮碘消毒。
- 使用剪刀，切割10毫米×10毫米至15毫米的皮肤×15毫米的正方形。缺陷尺寸应比接枝稍大（10％）。作为切割表面越好。小心保存肉膜和船只。肉膜可以是从通过它的流动性和血管运行浅到它的底层筋膜分开。
- 对接枝床接枝定位，避免沿边缘折叠。
- 放置在角落和在每个边的中间8缝线。对于每个缝合，通过接枝通过针，然后通过床周边接受者皮肤下面的移植物的肉膜。
- 取下面罩麻醉剂，让动物从麻醉中应用粘性绷带前部分恢复。
- 包裹收件人鼠标拥有超过移植折叠的纱布粘性绷带。通过结合两个绷带作包扎，切割一项所述的粘合剂部分和放置在两个吸收垫一起。
- 在恢复过程中密切监测鼠标以确保绷带没有限制胸部偏移和呼吸。取下绷带，如果呼吸速率降低或动物开始喘息浅或呼吸。
3.术后护理
- 手术感染预防后施用恩诺沙星5毫克/公斤。
- 发生在一个干净的笼子里移植鼠标可微波加热垫，直到它完全从麻醉中恢复。
- 观察小鼠1小时术后之前将其返回到壳体设施。
- 手术后七天，麻醉小鼠如步骤2.1。通过仅在绷带的腹侧切割取下绷带。
- 观察和触诊第二天对结痂，收缩或硬度的迹象接枝。如果存在，接枝可能不会取得恰当的vasculariza重刑和应被视为一个技术故障。
- 每天监测排斥反应的迹象。考虑移植时，移植组织的≥90％变为坏死拒绝。
- 安乐死被拒绝的动物和收获他们进行分析。
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Representative Results
收件人鼠标绷带的位置是该过程的一个重要步骤。皮肤移植物被定位在接受者躯干，肩膀，臀部和脊柱（ 图1）之间。绷带与折叠纱布和两个塑料粘性绷带的组合制成。收件人鼠标向下放置与接枝在纱布上的绷带的中心。使用两个弯曲微钳，绷带的下端首先拉出，然后将绷带的顶部被缠绕在鼠标腹部。
在完全不匹配车型，全层皮肤移植通常被拒绝了8〜12天。在次要错配模型中，排斥反应是较慢的，更可变的，与皮肤移植的外观的特征在于以下不同的变化，如收缩或脱发（ 图2）。急性排斥反应属LLY始于移植的肿胀和红斑。这些事件接着接枝干燥，收缩和痂的形成（ 图2B和C）。取决于MHC错配和免疫抑制协议的程度，可通过一个亚急性过程发生排斥反应，由细微的变化，如脱发，色素沉着，皮肤隆起和接枝量的标示。在这种情况下，被拒绝的移植物出现光泽，白色，无毛，有不平滑的边缘（ 图2F）14。
利用皮肤移植的这个模型，我们研究了一种新的方法针对T细胞的新陈代谢，防止移植排斥15。它公知的是代谢信号传导途径在口述的T细胞反应16的结果中发挥关键作用。幼稚T细胞依靠线粒体氧化磷酸化生成所需的基本免疫监视的能量。然而，激活后，效应T细胞代谢重新编程，以有氧糖酵解和显示增加的谷氨酰胺代谢16,17。使用的Balb / c为供体，C57BL / 6为受体，我们观察到，仅仅抑制糖酵解和氧化磷酸化（2DG +二甲双胍）或谷氨酰胺代谢（DON）延长皮肤移植存活，但同时也挡住了三条途径导致移植物在显著增存活（ 图3C）。此外，三重代谢疗法比常规环孢素或雷帕霉素（ 图3A和B）更有效。没有达到永久的验收，并进一步的战略，包括消耗治疗，共刺激封锁，或更新代谢疗法，可促进更好地诱导移植免疫耐受的。然而，这项研究提供了两个新的见解：使用非特异性抑制剂的靶向选择性的免疫细胞具有增加的代谢需求，以及要求吨 Ø同时阻止三大代谢途径在移植物排斥反应，以获得更强大的免疫抑制。
钙调磷酸酶抑制剂和哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）抑制剂构成大多数临床移植中使用的常规免疫抑制治疗。的Balb / c与环孢素和雷帕霉素C57BL / 6皮肤移植的平均肾存活率分别为17天和16天，分别。相比之下，收件人与抑制T细胞的糖酵解，线粒体氧化磷酸化代谢抑制剂治疗，和谷氨酰胺代谢延长了生存期：中位移植物存活率为29天。此外，来自代谢治疗组的皮肤移植物的组织学表现出更完整的组织对准和少淋巴细胞炎性浸润（ 图4）。
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图1： 用绷带移植物的覆盖。 （A）植皮放在右边主干。用纱布折叠和两个塑料带制成的绷带（B）绷带。 （C）的收件人小鼠置于纱布。 （DF）绷带缠鼠标。 请点击此处查看该图的放大版本。
图2： 急慢性排斥反应中皮肤移植外观。 （A）的Balb / c到C57BL / 6（完全不匹配）全层皮肤移植无排斥（8日）的证据。 （B）的Balb / c到C57BL / 6的全层皮肤移植的50％移植排斥（13天）。 （C）的Balb / c到C57BL / 6的全层皮肤移植完整的移植物排斥反应（18天）。 （D）的同系全层皮肤移植（8天）。 （E）的同系全层皮肤移植（30天）。 （F）C57BL / 10至C57BL / 6（轻微不匹配）全层皮肤移植慢性排斥反应（100天）。 请点击此处查看该图的放大版本。
图3： 只Balb / c到C57BL / 6皮肤移植的影响。 （一）治疗与环孢素（25毫克/公斤QD）。 （B）的治疗雷帕霉素（3mg / kg的QD）。 （C）治疗代谢抑制剂，2-脱氧-D-葡萄糖（2DG）500毫克/公斤QD，二甲双胍150毫克/千克QD和6-重氮-5-氧代-L-正亮氨酸（DON）1.6毫克/千克QOD。所有的治疗，从移植当天直到排斥管理。 请点击此处查看该图的放大版本。
图4：HE 染色;皮肤（右，左X100，X200）代谢疗法移植术后第7天 。 请点击此处查看该图的放大版本。
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Discussion
因为由梅达沃，首先在人体研究，然后在兔子和老鼠其介绍，皮肤移植已成为同种异体免疫反应6,7研究的宝贵模型。在这个手稿中，我们提出采用上，下背部皮肤大规模，非血管，皮肤全层移植的典范。各种替代方法，包括使用尾部皮肤或鼠标作为接枝组织来源的耳部皮肤，已经报道了迄今8,9。这些模型展示技术简单的独特优势，并允许高容量的吞吐量。表皮朗格汉斯细胞和真皮树突状细胞在尾部皮肤移植物的相对缺乏，然而，导致延迟的排斥反应以及促进移植接受由主机，特别是在较小的MHC错配的模型10,11。因此，全层中继线植皮被认为是一个更稳健的模型，更适合以研究T细胞的培养基泰德急性排斥12。
此外，我们的模型采用简单的技术，并不需要先进的显微外科技术。操作时间很短（〜每只小鼠10分钟从麻醉发作的程序的完成），术后发病率和死亡率是微不足道的。 （去除绷带的术前加死亡后24小时内死亡）的总手术死亡率已报3.8％13。大多数并发症的出现从麻醉过量或过于限制性绷带，其可以通过呼吸功能的密切监测期间立即手术后期间，并通过在呼吸窘迫6,17的最早迹象迅速除去绷带容易地防止。
在植入过程中的最重要的因素是移植组织的由宿主血管向内生长到接枝6的血运重建。收获的皮肤需要的精心准备，肉膜的夹层是关键的一步。我们优选以除去在显微镜下肉膜。建议从边缘之一启动解剖并通过推动肌肉和它与略成一定角度的弯曲腱切断术的叶片的皮肤分离缓慢前进。移植床的网站应该从关节和脊柱远。使切口入受体小鼠前，肩部和臀部应该被移动到可视化的皮肤皱褶，帮助划定的高低接缝。当删除收件人皮肤，以免损坏血管运行肤浅的肉膜是很重要的。如果出现出血，局部应用压缩和清除血液凝块，并可能与移植干涉。最后，绷带不应引起呼吸困难妥协的复苏，尽管它必须有足够的紧缩，以防止贪污和自动亩位移血运重建过程中tilation。胶条创可贴贴是并为此目的不够强。我们将两个绷带完全包住鼠标腰部，并允许绷带和接枝（ 图1）之间的折叠纱布的位置。绷带通过切割它的腹侧除去，剩下的是由动物取出，以避免扰乱接枝而试图手动删除绷带。
总之，全层皮肤移植是与文献引用丰富的一套行之有效的模式。该过程容易进行，作业时间短，和术后并发症是有限的。关键步骤都涉及到细致的皮肤捐赠者收获和接受者绷带的正确位置。涉及促进血管生成和组织修复的生物材料今后的研究可以进一步提高该过程的成功率。
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Disclosures
作者什么都没有透露。
Acknowledgments
这项工作是由美国国立卫生研究院资助R01AI077610资助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Straight micro forceps | Sigma | F4017 | |
| Curved micro forceps | Aesculap | BD333R | |
| Curved Stevens tenotomy scissors | Aesculap | BC905R | |
| Mayo dissecting scissors | Sigma | S3146 | |
| Micro needle holder | Aesculap | BM563R | |
| Sterile gauze | Covidien | 441218 | |
| 6-0 Nylon suture | MWI | 31849 | |
| Plastic Strips Band-Aid | Johnson & Johnson | Obtained from pharmacy | |
| 10 cm Petri dish | Fisherbrand | FB0875712 | |
| PBS | Quality Biological | 119069131 | |
| Buprenorphine | DEA Number required; Obtained from hospital pharmacy | ||
| Enrofloxacin | Bayer Health Care | 186599 |
References
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