Summary
الفئران كامل سمك زرع الجلد هو نموذج راسخة لدراسة الرفض في مكان منيع للمستضد الخيفي. هنا، ونحن نقدم البرنامج التعليمي كل خطوة تشارك في أداء BALB / ج -> C57BL / 6 زرع الجلد كامل سماكة.
Abstract
الفئران كامل سمك زرع الجلد هو راسخة في الجسم الحي نموذج لدراسة منيع للمستضد الخيفي الاستجابة والرفض الكسب غير المشروع. وعلى الرغم من تطبيق محدود للبشر، وزرع الجلد في الفئران وقد استخدمت على نطاق واسع للبحث الزرع. هذا الإجراء هو سهلة التعلم وأداء، وأنها لا تتطلب تقنيات المجهرية الدقيقة ولا تدريب مكثف. وعلاوة على ذلك، رفض الكسب غير المشروع في هذا النموذج يحدث في رد فعل مناعي استنساخه جدا ويتم رصد بسهولة عن طريق التفتيش المباشر والجس. وبالإضافة إلى ذلك، زرع الجلد الثانوي مع الطعوم المطابقة المانحة أو الجلد طرف ثالث يمكن أن يؤديها على المزيد من النماذج زرع معقدة كبديل وطريقة غير معقدة لتقييم التسامح المانحين محددة. مضاعفات منخفضة وهي بشكل عام تقتصر على جرعة زائدة من المخدر أو ضيق في التنفس بعد العملية. فشل الكسب غير المشروع، من ناحية أخرى، يحدث عادة نتيجة لضعف الاستعدادات للغرامفي الخلف، وتحديد المواقع غير صحيحة في السرير الكسب غير المشروع، أو وضع غير مناسب للضمادة. في هذه المقالة، نقدم بروتوكول لكامل سماكة زرع الجلد في الفئران ووصف الخطوات الهامة اللازمة لإجراء ناجحة.
Introduction
زرع الأعضاء هو الاختيار الامثل لعلاج المرضى الذين يعانون من فشل في نهاية المرحلة الجهاز، والنتائج قد تحسنت بشكل ملحوظ مع التقدم في العمليات الجراحية والبروتوكولات المناعة. ومع ذلك، ويرتبط كبت المناعة على المدى الطويل مع آثار جانبية كبيرة، ووضع استراتيجيات جديدة تعزز التسامح يبقى الهدف من البحوث زرع الحديث.
وقد وضعت نماذج حيوانية عديدة للبحوث الأساسية في زراعة الأعضاء، لدراسة آليات الرفض المزروع واختبار النهج كبت المناعة لمنع رفض الكسب غير المشروع وتعزيز التسامح على المدى الطويل 1-3. أصبحت نماذج الماوس الدعامة الأساسية لبحوث المناعة نظرا لتوافر الحصري واسعة من الأجسام المضادة التشخيصية والعلاجية واضحة المعالم السلالات الفطرية والمعدلة وراثيا. زرع الجلد هو إجراء بسيط لا يتطلب مهارات المجهرية الخاصة ويمكن رصدها بسهولة بعد العمل الجراحي. مجتمعة، كان زرع الجلد الماوس أداة استثنائية لدراسة العديد من الجوانب المعنية في الاستجابة منيع للمستضد الخيفي، بما في ذلك تقديم المستضد والاتجار الخلية، وتدمير الأنسجة أثناء الكسب غير المشروع الرفض 4،5.
هنا، نقدم لك مجموعة من الإجراء خطوة بخطوة لزرع الجلد كامل سماكة باستخدام نموذج الفأر، ونحن تصف الخطوات الهامة اللازمة لengraftment ناجحة من الجلد المزروع.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وأجريت كافة الإجراءات وفقا لدليل لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية من المعهد الوطني للصحة (NIH) وتمت الموافقة من قبل لجنة جامعة جونز هوبكنز رعاية الحيوان واستخدام (JHUACUC). تم تنفيذ إجراءات محددة في إطار MO13M292 بروتوكولات ACUC المعتمدة وMO13M370.
1. المانحة الجلد الحصاد
- تخدير الماوس المانحة مع isoflurane (المرذاذ الحث على 4٪ والصيانة في 1-2٪ من خلال مخروط الماوس). استخدام إصبع القدم انسحاب قرصة العاكسة لرصد عمق التخدير.
- باستخدام الحلاقة الكهربائية، حلاقة الجزء الخلفي من الحيوان وتعقيمها مع 10٪ اليود البوفيدون (على سبيل المثال، Betadine).
- باستخدام مقص العقيمة، والقفازات، وتقنية العقيم، والحصاد المانحة الجلد الخلفي من الفخذ في الرقبة، مع تشريح حادة على مستوى النسيج الضام الهالي.
- الموت ببطء الحيوانية خلع عنق الرحم بعد حصادرقعة جلدية.
- تحت المجهر، فصل الأنسجة الضامة والأنسجة الدهنية، وعضلية السبلة من الجلد مرة أخرى باستخدام مقص بضع وتر الجميلة. وعضلية السبلة هو رقيقة، شفافة العضلات المسؤولة عن حركة الوخز الجلد.
- استخدام معقم أدوات تقنية، قطع ترقيع 15 ملم × 15 ملم من الجلد مرة أخرى ل10 ملم × 10 ملم إلى 15 ملم × 15 ملم السرير الكسب غير المشروع.
- تخزين الطعوم على الشاش غارقة العقيمة مع الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) في طبق بتري على الجليد.
ملاحظة: 8-10 الطعوم يمكن الحصول عليها من الماوس مانح واحد.
2. مستلم الجلد زرع
- تخدير الماوس المتلقي مع isoflurane (المرذاذ الحث على 4٪ والصيانة في 1-2٪ من خلال مخروط الماوس). استخدام إصبع القدم انسحاب قرصة العاكسة لرصد عمق التخدير.
- إدارة 0.02 ملغم / كجم من وزن الجسم من البوبرينورفين لتخفيف الألم بعد الجراحة.
- حلق الجانب من الجزء الخلفي من الحيوان حيث واي الكسب غير المشروعليرة لبنانية تكون إدراج وتعقيم مع 10٪ البوفيدون اليود.
- باستخدام مقص، وقطع 10 ملم × 10 ملم إلى 15 ملم × 15 ملم مربع من الجلد. يجب أن يكون حجم الخلل أكبر قليلا (10٪) من الكسب غير المشروع. قطع كما ظاهريا ممكن. الحرص على الحفاظ على عضلية السبلة والسفن. وعضلية السبلة يمكن تمييزها من اللفافة الكامنة التي كتبها التنقل والأوعية الدموية التي تعمل سطحية لذلك.
- ضع الكسب غير المشروع على السرير الكسب غير المشروع، وتجنب طيات على طول الحواف.
- وضع 8 الغرز على الزوايا وعلى منتصف كل طرف. لكل خياطة، وتمرير الإبرة من خلال الكسب غير المشروع ومن ثم عن طريق عضلية السبلة من الكسب غير المشروع سرير تحت الجلد المتلقي المحيطة بها.
- إزالة القناع مخدر والسماح للحيوان يتعافى جزئيا من التخدير قبل تطبيق ضمادة لاصقة.
- التفاف الماوس المتلقي في ضمادة لاصقة مع الشاش مطوية على الكسب غير المشروع. جعل ضمادة من خلال الجمع بين اثنين من الضمادات، وقطعالجزء اللاصق من واحد ووضع منصات ماصة اثنين معا.
- مراقبة الماوس عن كثب خلال الانتعاش للتأكد من أن ضمادة لا تقيد الصدر سياحة والتنفس. إزالة الضمادة إذا يقلل من معدل التنفس أو يبدأ الحيوان في اللحظات أو التنفس بسطحية.
3. بعد العملية الجراحية العناية
- إدارة إينروفلوكساسين 5 ملغ / كغ بعد عملية جراحية للوقاية من العدوى.
- ضع الماوس المزروعة في قفص نظيفة على وسادة التدفئة ميكرووافابل حتى يتعافى تماما من التخدير.
- مراقبة الماوس لمدة 1 ساعة بعد العمل الجراحي قبل إعادته إلى منشأة سكنية.
- بعد سبعة أيام من الجراحة، تخدير الماوس كما في الخطوة 2.1. إزالة الضمادة عن طريق قطع فقط من خلال الجانب البطني من ضمادة.
- مراقبة وجس الكسب غير المشروع في اليوم التالي لعلامات scabbing، الانكماش، أو صلابة. إذا كان موجودا، والكسب غير المشروع قد لا يتحقق vasculariza السليموينبغي النظر في نشوئها وعطل فني.
- مراقبة يوميا بحثا عن علامات على الرفض. النظر في ترقيع رفض عندما ≥90٪ من الأنسجة الكسب غير المشروع يصبح الميتة.
- الموت ببطء الحيوانات رفضت وحصادها لتحليلها.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
وضع ضمادة على الماوس المتلقي هو خطوة هامة من هذا الإجراء. يتم وضع الكسب غير المشروع الجلد على الجذع المتلقي، بين الكتف والورك والعمود الفقري (الشكل 1). ويتكون ضمادة الشاش مع مطوية والجمع بين اثنين من ضمادات لاصقة البلاستيكية. يتم وضع الماوس المتلقي مع الكسب غير المشروع إلى أسفل على الشاش في وسط ضمادة. باستخدام اثنين من ملقط الصغيرة المنحنية، يتم سحبها الطرف الأدنى من ضمادة أولا، ومن ثم يتم لف الجزء العلوي من ضمادة على الماوس في البطن.
في نماذج عدم تطابق كاملة، وعادة ما تكون رفضت ترقيع الجلد كامل سماكة في 8-12 أيام. في نماذج عدم تطابق طفيفة، ردود الرفض تكون أبطأ، وأكثر متغير، ويتميز الكسب غير المشروع مظهر الجلد عن طريق تغييرات واضحة أقل، مثل الانكماش أو فقدان الشعر (الشكل 2). الكسب غير المشروع الحاد رفض جنساLLY يبدأ مع تورم واحمرار في الكسب غير المشروع. يتم اتباع هذه الأحداث من قبل تجفيف الكسب غير المشروع، وانكماش، وتشكيل جرب (الشكل 2B و C). اعتمادا على درجة من عدم تطابق MHC وبروتوكول المناعة، يمكن أن يحدث رفض عملية تحت الحاد، تميزت بعض التغييرات الطفيفة مثل فقدان الشعر، وتصبغ، التلال الجلدية، وحجم الكسب غير المشروع. في هذه الحالات، يظهر الكسب غير المشروع رفض لامعة، والأبيض، وبلا شعر، مع حواف غير متساوية (الشكل 2F) 14.
استخدام هذا النموذج لزرع الجلد، ونحن التحقيق نهجا جديدا يستهدف الأيض تي خلية لمنع الكسب غير المشروع الرفض 15. ومن المعروف أن مسارات الإشارات الأيضية تلعب أدوارا حاسمة في إملاء نتائج استجابات خلايا T 16. خلايا T ساذجة تعتمد على الفسفرة المؤكسدة الميتوكوندريا لتوليد الطاقة اللازمة لمراقبة المناعة الأساسية. ومع ذلك،على التنشيط، المستجيب خلايا تي إعادة برمجة عملية الأيض لتحلل الهوائية وتظهر زيادة الجلوتامين الأيض 16،17. باستخدام BALB / ج الجهات المانحة وC57BL / 6 كمتلقين، لاحظنا أن تثبيط تحلل والفسفرة التأكسدية (2DG + الميتفورمين) أو الجلوتامين الأيض وحدها (دون) لفترات طويلة الجلد الكسب غير المشروع البقاء على قيد الحياة، ولكن منع المسارات الثلاثة في وقت واحد أدى إلى زيادة كبيرة الكسب غير المشروع البقاء على قيد الحياة (الشكل 3C). وعلاوة على ذلك، كان العلاج الأيض الثلاثي أكثر فعالية من السيكلوسبورين التقليدية أو rapamycin (الشكل 3A وباء). لم يتحقق القبول دائم، واستراتيجيات أخرى، بما في ذلك العلاج استنزاف والحصار costimulation، أو العلاجات الأيض أحدث، قد تشجع تحريض أفضل من التسامح زرع. ومع ذلك، قدمت دراسة اثنين من رؤى جديدة: استخدام مثبطات غير محددة لاستهداف الخلايا المناعية انتقائية مع زيادة الطلب التمثيل الغذائي، فضلا عن شرط ر س منع المسارات الأيضية الثلاثة في وقت واحد للحصول على المناعة أكثر قوة في رفض الكسب غير المشروع.
مثبطات الكالسينيورين والهدف الثدييات من rapamycin (mTOR س) مثبطات تشكل أكثر من العلاج مناعة التقليدية المستخدمة في زراعة السريري. وكانت متوسط معدلات البقاء على قيد الحياة الكسب غير المشروع من BALB / ج لC57BL / 6 عمليات زرع الجلد تعامل مع السيكلوسبورين وrapamycin 17 و 16 يوما على التوالي. في المقارنة، والمتلقين تعامل مع مثبطات الأيضية التي تمنع تي تحلل الخلية، الميتوكوندريا الفسفرة التأكسدية، وكان التمثيل الغذائي الجلوتامين يطول بقاء: ان بقاء الكسب غير المشروع متوسط 29 يوما. وعلاوة على ذلك، فإن الأنسجة من ترقيع الجلد في المجموعة التي تلقت علاجا الأيض أظهرت محاذاة الأنسجة أكثر سليمة وأقل ارتشاح التهابي الليمفاوي (الشكل 4).
105 / 55105fig1.jpg "/>
الشكل 1: تغطية من الكسب غير المشروع مع ضمادة. (أ) الجلد الكسب غير المشروع وضعت على الجذع الصحيح. (ب) ضمادة مصنوعة من الشاش مطوية وقطعتين الضمادات البلاستيكية. (C) مستلم الماوس وضعت على الشاش. (DF) ضمادة ملفوفة حول الماوس. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: الجلد الكسب غير المشروع المظهر أثناء الحاد والرفض المزمن. (A) BALB / ج لC57BL / 6 (عدم تطابق تام) كامل سمك زرع الجلد دون دليل على الرفض (اليوم 8). (ب) BALB / ج لC57BL / 6 كامل سمك زرع الجلد مع 50٪ رفض الكسب غير المشروع (يوم 13). (C) BALB / ج لC57BL / 6 كامل سمك زرع الجلد مع رفض الكسب غير المشروع الكامل (اليوم 18). (D) مسانج كامل سمك زرع الجلد (اليوم 8). (E) مسانج كامل سمك زرع الجلد (30 يوما). (F) C57BL / 10 إلى C57BL / 6 (عدم تطابق طفيف) كامل سمك زرع الجلد مع رفض الكسب غير المشروع المزمن (100 يوم). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل (3): BALB / ج لC57BL / 6 الجلد الكسب غير المشروع البقاء على قيد الحياة. (أ) العلاج مع السيكلوسبورين (25 ملغ / كغ QD). (ب) علاج مع rapamycin (3 ملغ / كغ QD). (ج) العلاج مع مثبطات الأيض، 2-ديوكسي-D-الجلوكوز (2DG) 500مغ / كغ QD، الميتفورمين 150 ملغ / كغ QD، و 6 الديازين-5-أوكسو-L-نورلوسين (DON) 1.6 ملغ / كغ QOD. كانت تدار جميع العلاجات من يوم الزرع حتى الرفض. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: الهيماتوكسيلين ويوزين وصمة عار (يمين، X100، اليسار، X200) من الجلد الطعوم مع العلاج الأيضية في ما بعد الجراحة يوم 7. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
منذ مقدمته التي كتبها مدور، الأول في الدراسات الإنسانية وثم في الأرانب والفئران، وقد تم زرع الجلد نموذج لا تقدر بثمن لدراسة الاستجابات المناعية خيفي 6،7. في هذه المخطوطة، فإننا نقدم نموذجا على نطاق واسع، غير أوعية دموية، وزرع الجلد كامل سماكة باستخدام الجلد الخلفي العلوي والسفلي. ، وقد تم الإبلاغ عن وسائل بديلة مختلفة، بما في ذلك استخدام الجلد الذيل أو الجلد الأذن من الفأرة كمصدر الأنسجة الكسب غير المشروع حتى الآن 8،9. هذه النماذج تقدم ميزة واضحة من البساطة الفنية وتسمح لارتفاع حجم الإنتاجية. النقص النسبي في البشرة خلايا لانغرهانس والخلايا الجذعية عن طريق الجلد في ترقيع الجلد الذيل، ومع ذلك، يؤدي إلى تأخر الرفض وكذلك لقبول الكسب غير المشروع بتسهيل من قبل المضيف، ولا سيما في ثانوية نماذج عدم تطابق MHC 10،11. لذلك، يعتبر كامل سماكة ترقيع الجلد جذع نموذج أكثر قوة وأكثر ملاءمة لدراسة تي خلية وسائل الإعلامالحادة تيد الرفض 12.
وبالإضافة إلى ذلك، لدينا نموذج يستخدم تقنيات بسيطة ولا تتطلب مهارات المجهرية المتقدمة. الوقت تعمل قصير (10 دقيقة ~ في الماوس من بداية التخدير لإتمام الإجراء)، ومعدلات الاعتلال والوفيات بعد الجراحة لا يكاد يذكر. وقد تم الإبلاغ عن وفيات المنطوق الإجمالية (الوفاة في غضون 24 ساعة بعد الجراحة بالإضافة إلى الموت قبل إزالة الضمادة) إلى 3.8٪ (13). تنشأ معظم المضاعفات الناجمة عن جرعة زائدة من التخدير أو الضمادات بشكل مفرط المقيدة، والتي يمكن الوقاية منها بسهولة عن طريق الرصد الدقيق لوظائف الجهاز التنفسي خلال فترة ما بعد الجراحة مباشرة والإزالة السريعة للضمادة في أقرب علامات الضائقة التنفسية 6،17.
العامل الأكثر أهمية في عملية engraftment هو إعادة التوعي من الأنسجة الكسب غير المشروع من قبل نشوب السفن المضيف إلى الكسب غير المشروع 6. تتطلب الجلد المقطوعق إعداد دقيق، وتشريح عضلية السبلة هو خطوة حاسمة. ونحن نفضل أن إزالة عضلية السبلة تحت المجهر. فمن المستحسن لبدء تشريح من واحدة من الحواف والمضي قدما ببطء عن طريق دفع العضلات وفصله من الجلد مع شفرة لبضع وتر المنحني الزاوية قليلا. يجب أن يكون موقع السرير الكسب غير المشروع بكثير من المفاصل والعمود الفقري. قبل اتخاذ شقوق في الماوس المتلقي، يجب أن يتم نقل الكتف والورك لتصور طيات الجلد التي تساعد على ترسيم مستوى المفاصل. عند إزالة الجلد المتلقي، فمن المهم لتجنب إتلاف الأوعية الدموية التي تعمل سطحية إلى عضلية السبلة. في حالة حدوث نزيف، وتطبيق ضغط المحليين وإزالة الدم والجلطات التي قد تتداخل مع engraftment. وأخيرا، ينبغي أن ضمادة لا يسبب صعوبات في التنفس أن الانتعاش حل وسط، على الرغم من أنه يجب أن يكون التضييقية بما فيه الكفاية لمنع النزوح من الكسب غير المشروع والسيارات موtilation خلال عملية إعادة التوعي. شرائط من البلاستيك حزام الايدز هي ملتصقة وقوية بما يكفي لهذا الغرض. نحن الجمع بين اثنين من الضمادات التفاف تماما الخصر الماوس والسماح للوضع الشاش مطوية بين ضمادة والكسب غير المشروع (الشكل 1). تتم إزالة الضمادة عن طريق خفض الجانب البطني من ذلك، وتتم إزالة بقية من الحيوان، من أجل تجنب تعطيل الكسب غير المشروع أثناء محاولة إزالة الضمادة يدويا.
وباختصار، كامل سمك زرع الجلد هو نموذج راسخة مع المراجع وفيرة في الأدب. هذا الإجراء هو السهل القيام بها، في وقت التشغيل غير قصيرة، ومضاعفات ما بعد الجراحة محدودة. ترتبط الخطوات الحاسمة لالدقيق الحصاد الجلد المانحة وفي موضعها المناسب ضمادة المتلقي. قد الدراسات المستقبلية التي تنطوي على الحيوية التي تعزز الأوعية الدموية وإصلاح الأنسجة زيادة تحسين معدل نجاح العملية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لديهم ما يكشف.
Acknowledgments
وقد تم تمويل هذا العمل من قبل منحة المعاهد الوطنية للصحة R01AI077610.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Straight micro forceps | Sigma | F4017 | |
| Curved micro forceps | Aesculap | BD333R | |
| Curved Stevens tenotomy scissors | Aesculap | BC905R | |
| Mayo dissecting scissors | Sigma | S3146 | |
| Micro needle holder | Aesculap | BM563R | |
| Sterile gauze | Covidien | 441218 | |
| 6-0 Nylon suture | MWI | 31849 | |
| Plastic Strips Band-Aid | Johnson & Johnson | Obtained from pharmacy | |
| 10 cm Petri dish | Fisherbrand | FB0875712 | |
| PBS | Quality Biological | 119069131 | |
| Buprenorphine | DEA Number required; Obtained from hospital pharmacy | ||
| Enrofloxacin | Bayer Health Care | 186599 |
References
- Furtmuller, G. J., et al. Orthotopic Hind Limb Transplantation in the Mouse. J Vis Exp. , (2016).
- Oh, B., et al. A Novel Microsurgical Model for Heterotopic, En Bloc Chest Wall, Thymus, and Heart Transplantation in Mice. J Vis Exp. , (2016).
- Oberhuber, R., et al. Murine cervical heart transplantation model using a modified cuff technique. J Vis Exp. , e50753 (2014).
- Jones, T. R., Shirasugi, N., Adams, A. B., Pearson, T. C., Larsen, C. P. Intravital microscopy identifies selectins that regulate T cell traffic into allografts. J Clin Invest. 112, 1714-1723 (2003).
- Celli, S., Albert, M. L., Bousso, P. Visualizing the innate and adaptive immune responses underlying allograft rejection by two-photon microscopy. Nat Med. 17, 744-749 (2011).
- Medawar, P. B. The behaviour and fate of skin autografts and skin homografts in rabbits: A report to the War Wounds Committee of the Medical Research Council. J Anat. 78, 176-199 (1944).
- Billingham, R. E., Brent, L., Medawar, P. B., Sparrow, E. M. Quantitative studies on tissue transplantation immunity. I. The survival times of skin homografts exchanged between members of different inbred strains of mice. Proc R Soc Lond B Biol Sci. 143, 43-58 (1954).
- Garrod, K. R., Cahalan, M. D.
- Schmaler, M., Broggi, M. A., Rossi, S. W. Transplantation of tail skin to study allogeneic CD4 T cell responses in mice. J Vis Exp. , e51724 (2014).
- Bergstresser, P. R., Toews, G. B., Gilliam, J. N., Streilein, J. W. Unusual numbers and distribution of Langerhans cells in skin with unique immunologic properties. J Invest Dermatol. 74, 312-314 (1980).
- Chen, H. D., Silvers, W. K. Influence of Langerhans cells on the survival of H-Y incompatible skin grafts in rats. J Invest Dermatol. 81, 20-23 (1983).
- Chong, A. S., Alegre, M. L., Miller, M. L., Fairchild, R. L. Lessons and limits of mouse models. Cold Spring Harb Perspect Med. 3, a015495 (2013).
- Mayumi, H., Nomoto, K., Good, R. A. A surgical technique for experimental free skin grafting in mice. Jpn J Surg. 18, 548-557 (1988).
- McFarland, H. I., Rosenberg, A. S.
- Lee, C. F., et al. Preventing Allograft Rejection by Targeting Immune Metabolism. Cell reports. 13, 760-770 (2015).
- Pollizzi, K. N., Powell, J. D. Integrating canonical and metabolic signalling programmes in the regulation of T cell responses. Nat Rev Immunol. 14, 435-446 (2014).
- Pearce, E. L., Poffenberger, M. C., Chang, C. H., Jones, R. G. Fueling immunity: insights into metabolism and lymphocyte function. Science. 342, 1242454 (2013).
