Summary
쥐의 전체 두께 피부 이식은 동종 설정에 거부 반응을 연구하는 잘 확립 된 모델이다. > C57BL / 6 전층 피부 이식 - 여기, 우리는 BALB / C를 수행에 관련된 각 단계의 튜토리얼을 제공합니다.
Abstract
쥐의 전체 두께 피부 이식은 동종 반응과 이식 거부 반응을 연구하는 잘 설립 생체 내 모델입니다. 인간에게 제한된 응용 프로그램에도 불구하고, 마우스의 피부 이식 널리 이식 연구에 이용되고있다. 절차 배우고 수행하는 것이 용이하고, 섬세한 미세 수술 기술도 광범위한 훈련을 필요로하지 않는다. 또한,이 모델의 이식 거부는 매우 재현 면역 반응에서 발생하고 쉽게 직접 검사 및 촉진에 의해 모니터링된다. 또한, 기증자 일치 또는 타사 피부 이식 2 차 피부 이식은 다른 기증자 별 허용 오차를 평가하는 복잡하지 않은 방법으로 더 복잡한 이식 모델에서 수행 할 수 있습니다. 합병증은 낮으며 시술 후 마취 과다 복용 또는 호흡 곤란으로 제한 일반적이다. 이식 실패는 한편, GR의 불량한 제조의 결과로서 통상적으로 발생그래프트 침대에서 후미, 잘못된 위치, 또는 붕대의 부적절한 배치. 이 글에서, 우리는 생쥐에서 전층 피부 이식을위한 프로토콜을 제시하고 성공적인 수속에 필요한 중요한 단계를 설명합니다.
Introduction
장기 이식은 말기 장기 부전 환자에 대한 선택의 치료이며, 결과는 수술 절차 및 면역 억제 프로토콜의 발전에 현저하게 향상되었습니다. 그러나, 장기간의 면역 억제는 상당한 부작용과 연관 내성을 증진 새로운 전략의 개발은 현대 이식 연구의 목표로 남아있다.
많은 동물 모델은 이식 거부 반응의 메커니즘을 연구하는 면역 억제가 이식 거부 반응을 방지하기위한 장기 공차 1-3 촉진 접근 테스트 이식에 기초 연구 개발되어왔다. 마우스 모델에 의한 진단 및 치료 항체와 잘 정의 된 근친과 유전자 변형 종자의 독점과 광대 한 가용성 면역 학적 연구의 주류가되었다. 피부 이식은 특수 미세 수술 기술을 필요로 할 수없는 간단한 절차입니다쉽게 수술 후 모니터링 될 수있다. 함께 찍은, 마우스 피부 이식은 이식 거부 4,5 동안 항원 전달 세포 인신 매매, 조직 파괴를 포함하여 동종 응답에 관련된 여러 측면을 연구하는 뛰어난 도구가되고있다.
여기서는 마우스 모델을 이용하여 전체 두께 피부 이식을위한 단계별 과정을 보여, 우리는 이식 된 피부의 성공적인 생착에 필요한 중요한 단계를 설명한다.
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Protocol
모든 절차는 관리 및 국립 보건 연구소 (NIH)의 실험 동물의 사용에 대한 가이드에 따라 실시하고, 존스 홉킨스 대학 동물 관리 및 사용위원회 (JHUACUC)에 의해 승인되었다. 구체적인 절차는 승인 ACUC 프로토콜 MO13M292 및 MO13M370 하에서 수행 하였다.
1. 기증자 피부 수확
- (- 마우스 콘을 통해 2 % 1에서 유지 보수, 4 %에서 유도 기화기) 이소 플루 란과 기증자 마우스를 마취. 마취의 깊이를 모니터하기 위해 발가락 핀치 철수 반사를 사용합니다.
- 전기 면도기를 사용하면 동물의 뒤쪽을 면도하고 (예 Betadine) 10 %, 포비돈 요오드로 소독.
- 유륜 결합 조직의 수준에서 무딘 절개와 멸균 가위, 장갑, 및 무균 기술, 목에 엉덩이에서 수확 기증자 다시 피부를 사용.
- 수확 후 자궁 전위에 의해 동물을 안락사피부 이식.
- 현미경, 미세 건 절단술 가위를 사용하여 다시 피부의 결합 조직, 지방 조직 및 panniculus의 카르노 서스를 구분합니다. panniculus의 카르노 서스 피부 경련의 움직임을 담당하는 얇은 투명 근육이다.
- 멸균 악기의 기술을 사용하여, 15 mm X 15 mm 이식 침대로 10 mm × 10-mm에는 후면 피부에서 15 mm X 15 mm 이식을 잘라.
- 얼음에 페트리 접시에 멸균 인산 완충 생리 식염수 (PBS)로 적신 거즈에 이식을 저장합니다.
참고 : 8-10 이식 한 기증자 마우스에서 얻을 수 있습니다.
2.받는 사람 피부 이식
- (- 마우스 콘을 통해 2 % 1에서 유지 보수, 4 %에서 유도 기화기) 이소 플루 란과받는 사람 마우스를 마취. 마취의 깊이를 모니터하기 위해 발가락 핀치 철수 반사를 사용합니다.
- 수술 후 통증 완화를 위해 부 프레 놀핀의 0.02 ㎎ / ㎏ BW를 관리 할 수 있습니다.
- 동물의이면 측 면도 여기서 그래프트 WILL 삽입 될 10 % 포비돈 요오드 소독.
- 가위를 사용하여 피부의 X 15 mm 광장 15 mm에 10 mm × 10-mm를 잘라. 결함 크기보다 그래프트 (10 %) 약간 커야한다. 같은 피상적으로 가능한 한 컷. panniculus의 카르노 서스과 혈관을 유지하기 위해주의하십시오. panniculus의 카르노 서스는 이동성과 그것을 피상적 실행 혈관에 의해 기본 밴드 구별 할 수 있습니다.
- 가장자리를 따라 주름을 방지 그래프트 침대에 이식을 배치합니다.
- 모서리에 각 모서리의 중간에 8 봉합을 배치합니다. 각각의 봉합사를 들어, 주변받는 사람의 피부 아래에 침대 이식의 panniculus의 카르노 서스를 통해 다음 이식을 통해 바늘을 통과.
- 마취 마스크를 제거하고 동물이 접착 붕대를 적용하기 전에 마취에서 부분적으로 복구 할 수 있습니다.
- 이식 접혀 거즈와 접착 붕대에받는 사람 마우스를 감싸. 절단, 두 붕대를 결합하여 붕대를 확인접착제의 하나의 부분과 함께 두 흡수 패드를 배치.
- 붕대는 흉부 여행을 제한하고 호흡을하지 않는 것을 보장하기 위해 복구 중에 밀접하게 마우스를 모니터합니다. 호흡 속도가 감소 또는 동물이 얕게 말하다 또는 숨 시작하면, 붕대를 제거합니다.
3. 수술 후 케어
- 감염 예방을위한 수술 후 enrofloxacin 5 ㎎ / ㎏을 관리 할 수 있습니다.
- 완전히 마취에서 회복 될 때까지 전자 레인지 가열 패드를 통해 깨끗한 케이지에 이식 된 마우스를 놓습니다.
- 주택 시설에 반환에 수술 전에 1 시간 동안 마우스를 관찰합니다.
- 세븐 일 수술 후, 단계 2.1에서와 같이 마우스를 마취. 붕대의 복부 측면을 통해 만 절단하여 붕대를 제거합니다.
- 관찰하고 가피, 수축, 또는 경도의 증상에 대해 다음 날에 이식을 만져. 존재하는 경우, 이식은 적절한 vasculariza를 달성하지 않을 수 있습니다기와는 기술적 인 실패로 간주되어야한다.
- 거절의 흔적을 매일 모니터링합니다. 이식 조직의 ≥90 %가 괴사 될 때 거부 이식을 고려한다.
- 거부 된 동물을 안락사 및 분석을 수확.
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Representative Results
받는 사람 마우스의 붕대의 위치는 절차의 중요한 단계입니다. 피부 이식은 어깨, 고관절, 척추 (그림 1) 사이에,받는 사람 트렁크에 위치한다. 붕대 접혀 거즈와 두 개의 플라스틱 접착 붕대의 조합으로 이루어집니다. 받는 사람 마우스는 붕대의 중심에 거즈를 통해 아래로 이식으로 배치됩니다. 두 곡선의 마이크로 핀셋을 사용하여, 붕대의 하단부는 제 당겨하고 붕대의 상단은 복부 위에 마우스 싸여있다.
완전 불일치 모델에서, 전체 두께 피부 이식은 일반적으로 8 ~ 12 일 거부됩니다. 작은 불일치 모델에서 거부 반응을 더 변수 느리고, 피부 이식 모양 그러한 수축 또는 모발 손실 (도 2)와 같은 덜 뚜렷한 변화 특징으로한다. 급성 이식 거부 장군에서야 베드로는 이식의 부종과 홍반으로 시작된다. 이러한 이벤트는 이식 탈수, 수축하고, 딱지 형성 (그림 2B와 C) 다음에 있습니다. MHC 불일치 및 면역 프로토콜의 과정에 따라 제거는 탈모, 색소 침착, 피부 리지, 그래프트 량 미묘한 변화에 의해 표시하는 급성 공정에 의해 발생할 수있다. 이러한 경우, 거부 이식은 고르지 않은 가장자리 (그림 2 층) (14), 반짝이 흰색, 털이 나타납니다.
피부 이식 모델을 이용하여, 우리는 (15) 이식 거부 반응을 방지하는 T 세포의 신진 대사를 타겟팅하는 신규 한 방법을 연구 하였다. 또한 대사 신호 경로는 T 세포 반응 (16)의 결과를 지시하는 중요한 역할을하는 것으로 알려져있다. 나이브 T 세포는 기본적인 면역 감시에 필요한 에너지를 생성하는 미토콘드리아의 산화 적 인산화에 의존한다. 하나,활성화시에, 이펙터 T 세포 대사 호기성 당분을 재 프로그래밍 증가 글루타민 대사 16,17을 나타낸다. 기증자 등을 Balb / C를 사용하고 C57BL / 6받는 사람으로, 우리가 단독으로 해당 작용과 산화 적 인산화 (2DG + 메트포민) 또는 글루타민 대사를 억제 (DON)는 피부 이식 생존을 연장 관찰하지만, 동시에 세 가지 경로를 차단은 유의-증가 이식 결과 생존 (그림 3C). 또한, 트리플 대사 치료는 종래의 사이클로스포린 또는 라파 마이신 (도 3A와 B)보다 더 효과적이었다. 영구 수용은 이식 허용 오차를보다 효율적으로 유도를 촉진 할 수있다 달성하고, 고갈 요법, 보조 자극 봉쇄, 이상 대사 치료를 더 포함하는 전략 없습니다. 그러나,이 연구는 두 개의 신규 한 통찰력을 제공 : 선택적 면역 증가 대사 요구와 셀뿐만 아니라 요구 t를 타겟팅 비특이적 억제제의 사용 O 이식 거부에 더욱 강력한 면역을 구하는 동시에 세 가지 대사 경로를 차단.
칼시 뉴린 억제제 및 라파 마이신의 포유 동물 표적은 (는 mTOR) 억제제는 임상 이식에 사용되는 종래의 면역 요법의 대부분을 구성한다. 사이클로스포린과 라파 마이신으로 치료 C57BL / 6 피부 이식을을 Balb / C의 중간 이식 생존율은 각각 17 십육일했다. 비교하여, 수신자는 T 세포 당분, 미토콘드리아의 산화 적 인산화를 저해하는 대사 억제제로 치료 및 글루타민 대사의 생존을 연장 하였다 : 평균 생존 기간을 29 일이었다. 또한, 대사 치료군에서 피부 이식의 조직 학적 더 손상 조직 배향 이하 염증성 침윤 림프구 (도 4)에 나타냈다.
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그림 1 : 붕대로 이식의 취재. 오른쪽 트렁크에 위치 (A) 피부 이식. 접힌 거즈와 두 개의 플라스틱 스트립 붕대로 만든 (B) 붕대. 거즈에 배치 (C)받는 사람 마우스입니다. (DF) 붕대 마우스를 감싸. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2 : 급성 및 만성 거부하는 동안 피부 이식 외관. C57BL / 6 (완전 불일치)에 (A)을 Balb는 / c를 거부 (일 8)의 증거없이 전층 피부 이식. (B)을 Balb / 50 % 이식 거부와 C57BL가 / 6 전층 피부 이식에 C (하루 13). (C)을 Balb / 전체 이식 거부 (일 18)와 C57BL / 6 전체 두께 피부 이식 다. (D) 동계 전층 피부 이식 (8 일). (E) 동계 전층 피부 이식 (일 30). (F) C57BL / C57BL / 6 (사소한 불일치) 10 만성 이식 거부 (하루 100) 전체 두께 피부 이식. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3 : C57BL / 6 피부 이식 생존을 Balb / C. (A) 치료 사이클로스포린 (25 ㎎ / ㎏의 QD)와 함께. (B) 치료 라파 마이신 (3 ㎎ / ㎏의 QD)와 함께. 대사 억제제 (C) 처리, 2- 데 옥시 -D- 글루코스 (2DG) 500밀리그램 / kg QD, 메트포르민 150 ㎎ / ㎏의 QD, 및 6- 디아 조 -5- 옥소 노르 류신 L (DON) 1.6 ㎎ / ㎏ QOD. 모든 치료를 거부 할 때까지 이식의 날부터 투여 하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4 : 헤 마톡 실린 및 에오신 얼룩, 피부의 (오른쪽, X100 왼쪽, X200)는 수술 후 7 일에서 대사 치료와 이식. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
토끼와 생쥐에서 다음 인간 연구에서 제 메다에 의해 소개 된 이후, 피부 이식은 동종 면역 반응 6,7의 연구를위한 귀중한 모델이되고있다. 이 논문에서는 상하 다시 피부를 이용한 대규모의 비 혈관 전층 피부 이식 모델을 제시한다. 꼬리 피부 또는 이식 조직 공급원으로서 마우스 귀 피부 사용을 포함하는 다양한 다른 방법은, 8,9까지보고되고있다. 이러한 모델은 단순 기술의 뚜렷한 장점을 제공하고 높은 볼륨 처리량을 허용한다. 꼬리 피부 이식의 표피 랑게르한스 세포 및 피부 수상 세포의 상대적인 부족하지만, 특히 작은 MHC 불일치 모델 (10, 11)에서 지연된 거부뿐만 아니라 용이 그래프트 수용에 관해서는 호스트에 의해 리드. 따라서, 전체 두께 트렁크 피부 이식은 T 세포 미디어를 연구하는보다 강력한 모델이 더 적합한 것으로 간주됩니다테드는 거부 (12) 급성.
또한, 우리의 모델은 간단한 기술을 고용하고 고급 미세 수술 기술을 필요로하지 않습니다. 동작 시간 (~ 10의 절차의 완료 마취 개시로부터 마우스 당 분), 및 수술 후 이환율 및 사망률을 무시할 짧다. (붕대를 제거하기 전에 수술 플러스 사망 후 24 시간 내 사망) 전체 수술 사망률은 3.8 % (13)로보고되었다. 합병증의 대부분은 쉽게 수술 직후 기간 동안 호흡 곤란 6,17의 초기 징후에 붕대를 신속하게 제거하여 호흡 기능의 확대 모니터링을 방지 할 수 마취 과다 복용 또는 지나치게 제한적인 붕대에서 발생한다.
생착 과정에서 가장 중요한 요소는 그래프트 6 호스트 혈관의 내 성장에 의해 이식 조직의 재관류이다. 수확 피부가 필요주의 준비이야,하고 panniculus의 카르노 서스의 해부는 중요한 단계입니다. 우리는 현미경으로 panniculus의 카르노 서스를 제거하는 것을 선호합니다. 가장자리 중 하나에서 해부를 시작하고 근육을 밀고 약간 각도 곡선 건 절단술의 칼날로 피부에서 분리하여 천천히 진행하는 것이 좋습니다. 이식 침대의 위치는 관절과 척추에서 멀리해야한다. 수신자 마우스로 절개하기 전에 어깨와 허리 관절의 레벨을 구별하는 것을 돕는 피부 주름을 시각적으로 이동한다. 받는 피부를 제거 할 때, 카르노 서스 panniculus의 피상적 실행 혈관의 손상을 방지하는 것이 중요하다. 출혈이 발생하는 경우, 로컬 압축을 적용하고 생착을 방해 할 수 있습니다 혈액과 혈전을 제거합니다. 이식 및 자동 무의 변위를 방지하기 위해 충분히 협착해야하지만 마지막으로, 붕대, 그 타협 복구 호흡 곤란을 야기해서는 안혈관 재 형성의 과정 tilation. 플라스틱 스트립 밴드 - 에이즈는 부착이 목적을 위해 충분히 강하다. 우리는 완전히 마우스 허리를 포장하고 붕대와 이식 (그림 1) 사이의 접힌 거즈의 배치를 허용하는이 붕대를 결합합니다. 붕대는 그것의 복부 측면을 절삭하여 제거하고, 나머지는 직접 붕대를 제거하는 동안 이식을 방해하지 않기 위해, 동물에 의해 제거된다.
요약하면, 전층 피부 이식은 문학에 풍부한 참조가 잘 확립 된 모델이다. 절차가 수행하기 쉬운, 작동 시간이 짧고, 수술 후 합병증은 제한적이다. 중요한 단계는 세심한 기증자 피부 수확과받는 사람 붕대의 정확한 위치와 관련이 있습니다. 혈관 신생 및 조직 복구 증진 생체 물질을 포함하는 미래 연구는 상기 절차의 성공률을 향상시킬 수있다.
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Disclosures
저자는 공개 아무것도 없어.
Acknowledgments
이 작품은 NIH 교부금 R01AI077610에 의해 투자되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Straight micro forceps | Sigma | F4017 | |
| Curved micro forceps | Aesculap | BD333R | |
| Curved Stevens tenotomy scissors | Aesculap | BC905R | |
| Mayo dissecting scissors | Sigma | S3146 | |
| Micro needle holder | Aesculap | BM563R | |
| Sterile gauze | Covidien | 441218 | |
| 6-0 Nylon suture | MWI | 31849 | |
| Plastic Strips Band-Aid | Johnson & Johnson | Obtained from pharmacy | |
| 10 cm Petri dish | Fisherbrand | FB0875712 | |
| PBS | Quality Biological | 119069131 | |
| Buprenorphine | DEA Number required; Obtained from hospital pharmacy | ||
| Enrofloxacin | Bayer Health Care | 186599 |
References
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