Summary
マウス全層皮膚移植は同種免疫設定で拒絶反応を研究するために、十分に確立されたモデルです。 > C57BL / 6全層皮膚移植 - ここでは、BALB / cと実行に関与し、各ステップのチュートリアルを提供しています。
Abstract
マウスの全層皮膚移植は、同種免疫反応および移植片拒絶を研究するためのインビボモデルで十分に確立されています。ヒトへのその限られた用途にもかかわらず、マウスでは皮膚移植が広く移植研究のために採用されています。手順は、学び、実行することが容易であり、それは繊細な顕微技術も広範囲の訓練を必要としません。また、このモデルにおける移植片拒絶は、非常に再現性の免疫反応で発生しやすい直接検査や触診によって監視されます。また、ドナーをマッチさせた、またはサードパーティの皮膚移植片を有する二次皮膚移植はドナー特異的寛容を評価するための代替と合併症のない方法として、より複雑な移植モデル上で実行することができます。合併症は低く、一般的に手順の後、麻酔の過剰摂取や呼吸困難に限定されています。移植の失敗は、他の一方で、GRの準備不足の結果として、一般的に発生します移植床における後方、不正確な位置決め、または包帯の不適切な配置。この記事では、我々は、マウスの全層皮膚移植のためのプロトコルを提示し、成功した手順のために必要な重要な手順を説明します。
Introduction
臓器移植は、末期の臓器不全を有する患者のための選択の治療法である、と結果は外科的手順および免疫抑制プロトコルの進歩と飛躍的に向上しています。しかし、長期的な免疫抑制は、重大な副作用に関連付けられている、と寛容を促進する新たな戦略の開発は、現代の移植研究の目標のままです。
多数の動物モデルが、移植片拒絶反応を予防するため、長期的な耐性1-3を促進するための接近同種移植片拒絶反応のメカニズムを研究するために、および免疫抑制を試験するために、移植における基礎研究のために開発されています。マウスモデルは、原因、診断と治療用抗体の排他的で広大な可用性と明確に定義された近交系およびトランスジェニック株と免疫学研究の主力となっています。皮膚移植は特別な顕微スキルや缶を必要としない簡単な手順であります簡単に術後監視されます。まとめると、マウスの皮膚移植は、移植片拒絶4,5中の抗原送達、細胞輸送、および組織破壊を含む同種免疫応答に関与する多くの側面を研究するための例外的なツールとなっています。
ここでは、マウスモデルを用いた全層皮膚移植のためのステップバイステップの手順を示し、我々は移植皮膚の生着の成功のために必要な重要な手順を説明します。
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Protocol
すべての手順は、国立衛生研究所の実験動物の管理と使用に関する指針（NIH）に従って行ったし、ジョンズ・ホプキンス大学動物実験委員会（JHUACUC）によって承認されました。具体的な手順は、承認されたACUCプロトコルMO13M292とMO13M370下で行いました。
1.ドナー皮膚の収穫
- イソフルラン（ - マウスコーンを介して、2％、4％で誘導気化器、1でのメンテナンス）でドナーマウスを麻酔。麻酔深度を監視するために、つま先のピンチ引っ込め反射を使用してください。
- 電気かみそりを使用して、動物の背中を剃る、10％ポビドンヨード（ 例えば 、ベタジン）でそれを消毒します。
- 疎性結合組織のレベルで鈍的切開して、滅菌はさみ、手袋、無菌技術、収穫ドナー首の後ろに腰から皮膚を使用しました。
- 収穫後に頸椎脱臼により動物を安楽死させます皮膚移植。
- 顕微鏡下で、微細な腱切除はさみを使用して、背中の皮膚からの結合組織、脂肪組織、および皮筋層を分離します。皮筋層は、皮膚のけいれんの動きに責任薄い透明筋肉です。
- 無菌の楽器の技術を用いて、15ミリメートル×15 mmの移植床に10ミリメートル×10ミリメートルのための背中の皮膚から15ミリメートル×15 mmの移植片を切り出します。
- 氷上のペトリ皿中の滅菌リン酸緩衝生理食塩水（PBS）に浸したガーゼに移植片を保管してください。
注：8 - 10の移植片は、1つのドナーマウスから得ることができます。
2.受信者の皮膚移植
- イソフルラン（ - マウスコーンを介して、2％、4％で誘導気化器、1でメンテナンス）とレシピエントマウスを麻酔。麻酔深度を監視するために、つま先のピンチ引っ込め反射を使用してください。
- 術後の疼痛緩和のためのブプレノルフィンの0.02ミリグラム/ kg体重を管理します。
- グラフトのWi動物の背中側を剃ります挿入され、10％ポビドンヨードで消毒することでしょう。
- はさみを使用して、皮膚の15ミリメートル×15ミリメートル四方に10ミリメートル×10ミリメートルを切りました。欠陥サイズは、グラフトより（10％）、わずかに大きくする必要があります。表面的に可能な限りカットします。皮筋層および血管を維持するために注意してください。皮筋層は、その移動性によって、根底にある筋膜およびそれに表面的な実行の血管と区別することができます。
- エッジに沿って折り目を避け、移植床に移植片を配置します。
- 四隅と各辺の中央に8縫合糸を配置します。各縫合糸のために、移植片を通過し、その後、周囲のレシピエントの皮膚下の移植床の皮筋層を介して針を渡します。
- 麻酔マスクを外し、動物が粘着包帯を適用する前に麻酔から部分的に回復してみましょう。
- グラフト折り重ねガーゼ絆創膏でレシピエントマウスをラップします。切断、2包帯を組み合わせることにより、包帯を作ります接着剤の1の部分と一緒に2吸収パッドを配置します。
- 包帯は、胸部の遠足と呼吸を制限しないことを確実にするためにリカバリ時に密接にマウスを監視します。呼吸数が減少または動物が浅く息をのむか、息を開始した場合に包帯を外します。
3.術後ケア
- 感染予防のための手術後のエンロフロキサシン5ミリグラム/キログラムを管理します。
- それは完全に麻酔から回復するまで電子レンジで加熱パッドの上にきれいなケージに移植したマウスを置きます。
- 術後の前の住宅施設に戻すに1時間、マウスを観察します。
- 七日手術後、ステップ2.1のように、マウスを麻酔。包帯の腹側を介してのみ切断することにより包帯を外します。
- 観察し、痂皮形成、収縮、または硬さの兆候が次の日に移植片を触診します。存在する場合、移植片は、適切vascularizaを達成していない可能性がありますションとは、技術的な失敗とみなされるべきです。
- 拒絶反応の徴候について毎日監視します。移植片組織の≥90％が壊死性になったときに拒否された移植片を考えてみましょう。
- 拒否された動物を安楽死させると分析のためにそれらを収穫。
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Representative Results
レシピエントマウスに包帯の配置は、手順の重要なステップです。皮膚移植は、肩、腰、及び背骨（ 図1）との間で、受信者の胴体上に配置されます。包帯は、折り畳まれたガーゼと2プラスチック絆創膏の組み合わせで作られています。レシピエントマウスは、包帯の中心にガーゼの上にダウン移植片で配置されています。 2つの湾曲マイクロ鉗子を用いて、包帯の下側端部が最初に引っ張られ、その後包帯の上面は腹部に、マウスの上にラップされます。
完全なミスマッチのモデルでは、全層皮膚移植片は、通常8〜12日で拒否されます。マイナーミスマッチモデルにおいて、拒絶反応は、多くの変数、遅い、および皮膚移植の出現は、収縮または毛髪の喪失（ 図2）として以下の異なる変化によって特徴付けられます。急性移植片拒絶の属LLY移植片の腫脹および紅斑から始まります。これらのイベントは、グラフト乾燥、収縮、およびかさぶたの形成（ 図2BおよびC）が続いています。 MHCの不一致や免疫抑制プロトコルの程度によっては、拒絶は、そのような脱毛、色素沈着、皮膚の隆起、および移植片ボリュームとして微妙な変化によってマークされ、亜急性プロセスで発生する可能性があります。これらのケースでは、拒否された移植片は、不均一なエッジ（ 図2F）14と、光沢のある白、毛のない表示されます。
皮膚移植のこのモデルを利用して、我々は、移植片拒絶15を防止するために、T細胞の代謝を標的とする新規なアプローチを検討しました。十分に代謝シグナル伝達経路は、T細胞応答16の結果を口述において重要な役割を果たすことが知られています。ナイーブT細胞は、基本的な免疫監視に必要なエネルギーを生成するために、ミトコンドリアの酸化的リン酸化に依存しています。しかしながら、活性化の際に、エフェクターT細胞は、代謝的に好気性解糖への再プログラミングおよび増加グルタミン代謝16,17を示します。レシピエントとしてドナー及びC57BL / 6としてのBalb / Cを使用して、我々は、解糖および酸化的リン酸化（2DG +メトフォルミン）または単独のグルタミン代謝（DON）長期の皮膚移植片の生存を阻害することが観察されたが、同時に3つの経路を遮断することが大幅増移植片が得られました生存（ 図3C）。また、トリプル代謝療法は、従来のシクロスポリンまたはラパマイシン（ 図3AおよびB）よりも有効でした。永久的な承諾を得られなかった、そして枯渇療法、共刺激の遮断、または新しい代謝療法を含むさらなる戦略は、移植寛容のよりよい誘導を促進することができます。しかし、研究では、2つの新規な洞察を提供し：選択的免疫増加代謝要求を持つ細胞、ならびに要件トンを標的とする非特異的阻害剤の使用 O移植片拒絶に、より堅牢な免疫抑制を得るために、同時に3代謝経路を遮断します。
カルシニューリン阻害剤およびラパマイシンの哺乳動物標的（mTOR）阻害剤は、臨床移植において使用される従来の免疫抑制療法の大部分を構成します。シクロスポリンおよびラパマイシンで処理したC57BL / 6皮膚移植へのBalb / Cの中央値グラフト生存率はそれぞれ、17および16日でした。比較して、T細胞の解糖、ミトコンドリアの酸化的リン酸化、およびグルタミン代謝を阻害する代謝阻害剤で処理された受信者は、生存期間の延長を有した：メジアン移植片生存は29日でした。さらに、代謝療法群から皮膚移植片の組織学は、より多くの無傷組織アライメントと少ないリンパ球炎症性浸潤（ 図4）を示しました 。
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図1： 包帯とのグラフトのカバーリング。右トランク上に配置された（A）皮膚移植片。 （B）包帯は、折り畳まれたガーゼと2プラスチック製のストリップ包帯で作られました。ガーゼ上に配置された（C）受信者のマウス。 （DF）包帯は、マウスに巻き付け。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図2： 急性および慢性拒絶反応時の皮膚移植片外観。 C57BL / 6（完全なミスマッチ）除去（8日目）の証拠なしの全層皮膚移植に（A）のBalb / C。 50％の移植片拒絶とC57BL / 6全層皮膚移植に（B）のBalb / C（13日目）。 （C）完全な移植片拒絶（18日）とC57BL / 6全層皮膚移植へのBalb / C。 （D）同系全層皮膚移植（8日目）。 （E）同系全層皮膚移植（30日目）。 （F）C57BL / C57BL / 6（マイナー不一致）に10慢性移植片拒絶（100日目）との全層皮膚移植。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図3：C57BL / 6皮膚移植片生存へのBalb / C。シクロスポリンとの（A）トリートメント（25ミリグラム/キログラムQD）。 （B）ラパマイシンによる治療（3ミリグラム/キログラムのQD）。 （C）、代謝阻害剤での処理、2-デオキシ-D-グルコース（2DG）500ミリグラム/ kgのQD、メトホルミン150ミリグラム/ kgのQD、および6-ジアゾ-5-オキソ-L-ノルロイシン（DON）を1.6mg / kgのQOD。全ての処理は拒絶されるまで、移植の日から投与しました。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図4： ヘマトキシリンおよびエオシン染色（右、X100、左、X200）術後7日目での代謝治療で皮膚移植片の 。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
メダウォアによるその導入されて以来、最初のヒトの研究で、その後、ウサギおよびマウスで、皮膚移植、同種免疫応答6,7の研究のための貴重なモデルとなっています。この原稿では、上下の背中の皮膚を用いた大規模な、非血管新生化、全層皮膚移植のモデルを提示します。移植組織の供給源として、マウスの尾の皮膚又は耳の皮膚を使用することを含む様々な代替方法は、8,9までに報告されています。これらのモデルは、技術的なシンプルさの明確な利点を提示し、大容量のスループットを可能にします。表皮ランゲルハンス細胞と尾皮膚移植片における真皮樹状細胞の相対的な欠乏は、しかし、特にマイナーMHCの不一致モデル10,11に、ホストによってグラフト受け入れを促進するために遅れて拒絶につながるだけでなく、。このため、全層トランク皮膚移植は、T細胞メディアを研究するためのより強固なモデルと、より適していると考えられますテッドは拒絶12急性 。
加えて、我々のモデルは、単純な技術を使用し、高度な顕微スキルを必要としません。運転時間（麻酔の発症から処置の終了まで、マウス当たり約10分）短く、術後の罹患率および死亡率は無視できます。 （包帯の除去の前に手術+死後24時間以内の死亡）全体の手術死亡率は3.8％で13であることが報告されています。合併症のほとんどは簡単に手術直後の期間中および呼吸窮迫6,17の初期徴候で包帯を迅速に除去することにより呼吸機能の綿密なモニタリングによって防ぐことができ、麻酔の過剰摂取や過度に制限的包帯、から生じます。
移植の過程で最も重要な要因は、移植片6に対する宿主血管の内部成長によって、移植組織の血管再生です。収穫肌必要入念な準備だ、と皮筋層の解剖は重要なステップです。私たちは顕微鏡下で皮筋層を除去することを好みます。エッジの1から解剖を開始するために、筋肉を押し、わずかに角度を付け、湾曲腱切除の刃で皮膚からそれを分離することにより、ゆっくりと前進することをお勧めします。移植床のサイトでは、関節や背骨から遠くにする必要があります。レシピエントマウスに切開を行う前に、肩や腰、関節のレベルを区別するのに役立ち、皮膚の襞を可視化するために移動する必要があります。受信者の皮膚を取り除くときは、皮筋層への表面的な実行の血管の損傷を防ぐことが重要です。出血が発生した場合、ローカルの圧縮を適用し、生着を妨げる可能性が血液や血栓を除去します。移植片および自動ムーの変位を防止するのに十分収縮である必要がありますが、最後に、包帯は、その妥協の回復、呼吸困難を起こすべきではありません血行再建のプロセスの間tilation。プラスチックストリップバンドエイドが付着し、この目的のために十分に強いです。我々は完全にマウスの腰をラップし、包帯および移植片（ 図1）との間に折り畳まれたガーゼの配置を可能にするために2包帯を兼ね備えています。包帯は、その腹側を切断することによって除去し、残りを手動包帯を除去しようとしたとき、移植片を破壊することを避けるために、動物によって除去されます。
要約すると、全層皮膚移植は、文献に豊富に参照を持つ十分に確立されたモデルです。手順は、実行が容易であり、動作時間が短く、術後の合併症は限られています。重要なステップは、細心のドナー皮膚の収穫と受信者の包帯の正しい配置に関連しています。血管新生および組織修復を促進する生体材料を含む今後の研究では、さらに手順の成功率を向上させることができます。
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Disclosures
著者らは、開示することは何もありません。
Acknowledgments
この作品は、NIHの助成金R01AI077610によって賄われていました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Straight micro forceps | Sigma | F4017 | |
| Curved micro forceps | Aesculap | BD333R | |
| Curved Stevens tenotomy scissors | Aesculap | BC905R | |
| Mayo dissecting scissors | Sigma | S3146 | |
| Micro needle holder | Aesculap | BM563R | |
| Sterile gauze | Covidien | 441218 | |
| 6-0 Nylon suture | MWI | 31849 | |
| Plastic Strips Band-Aid | Johnson & Johnson | Obtained from pharmacy | |
| 10 cm Petri dish | Fisherbrand | FB0875712 | |
| PBS | Quality Biological | 119069131 | |
| Buprenorphine | DEA Number required; Obtained from hospital pharmacy | ||
| Enrofloxacin | Bayer Health Care | 186599 |
References
- Furtmuller, G. J., et al. Orthotopic Hind Limb Transplantation in the Mouse. J Vis Exp. , (2016).
- Oh, B., et al. A Novel Microsurgical Model for Heterotopic, En Bloc Chest Wall, Thymus, and Heart Transplantation in Mice. J Vis Exp. , (2016).
- Oberhuber, R., et al. Murine cervical heart transplantation model using a modified cuff technique. J Vis Exp. , e50753 (2014).
- Jones, T. R., Shirasugi, N., Adams, A. B., Pearson, T. C., Larsen, C. P. Intravital microscopy identifies selectins that regulate T cell traffic into allografts. J Clin Invest. 112, 1714-1723 (2003).
- Celli, S., Albert, M. L., Bousso, P. Visualizing the innate and adaptive immune responses underlying allograft rejection by two-photon microscopy. Nat Med. 17, 744-749 (2011).
- Medawar, P. B. The behaviour and fate of skin autografts and skin homografts in rabbits: A report to the War Wounds Committee of the Medical Research Council. J Anat. 78, 176-199 (1944).
- Billingham, R. E., Brent, L., Medawar, P. B., Sparrow, E. M. Quantitative studies on tissue transplantation immunity. I. The survival times of skin homografts exchanged between members of different inbred strains of mice. Proc R Soc Lond B Biol Sci. 143, 43-58 (1954).
- Garrod, K. R., Cahalan, M. D.
- Schmaler, M., Broggi, M. A., Rossi, S. W. Transplantation of tail skin to study allogeneic CD4 T cell responses in mice. J Vis Exp. , e51724 (2014).
- Bergstresser, P. R., Toews, G. B., Gilliam, J. N., Streilein, J. W. Unusual numbers and distribution of Langerhans cells in skin with unique immunologic properties. J Invest Dermatol. 74, 312-314 (1980).
- Chen, H. D., Silvers, W. K. Influence of Langerhans cells on the survival of H-Y incompatible skin grafts in rats. J Invest Dermatol. 81, 20-23 (1983).
- Chong, A. S., Alegre, M. L., Miller, M. L., Fairchild, R. L. Lessons and limits of mouse models. Cold Spring Harb Perspect Med. 3, a015495 (2013).
- Mayumi, H., Nomoto, K., Good, R. A. A surgical technique for experimental free skin grafting in mice. Jpn J Surg. 18, 548-557 (1988).
- McFarland, H. I., Rosenberg, A. S.
- Lee, C. F., et al. Preventing Allograft Rejection by Targeting Immune Metabolism. Cell reports. 13, 760-770 (2015).
- Pollizzi, K. N., Powell, J. D. Integrating canonical and metabolic signalling programmes in the regulation of T cell responses. Nat Rev Immunol. 14, 435-446 (2014).
- Pearce, E. L., Poffenberger, M. C., Chang, C. H., Jones, R. G. Fueling immunity: insights into metabolism and lymphocyte function. Science. 342, 1242454 (2013).
