Summary
Mürin tam kalınlıkta deri transplantasyonu alloimmun ortamda reddini incelemek için iyi kurulmuş bir modeldir. > C57BL / 6 tam kalınlıkta deri nakli - Burada bir BALB / c performans katılan her adımda bir öğretici sağlar.
Abstract
Mürin tam kalınlıkta deri transplantasyonu alloimmun tepki ve greft reddini incelemek için iyi kurulmuş bir in vivo modeldir. insanlara sınırlı uygulanmasına rağmen, farelerde deri transplantasyon yaygın Nakil için kullanılmıştır. Prosedür öğrenmek ve kolay uygulanabilir olması ve hassas mikrocerrahi teknikler de kapsamlı bir eğitim gerektirmez. Ayrıca, bu modelde graft reddi çok tekrarlanabilir immünolojik reaksiyon meydana gelir ve kolayca doğrudan kontrol ve elle muayene ile izlenir. Buna ek olarak, donör uyumlu veya üçüncü taraf deri grefti ile ikincil deri nakli alternatif ve donör spesifik tolerans değerlendirmek için basit bir yöntem olarak daha karmaşık nakli modellerinde yapılabilir. komplikasyonlar düşük ve işlem sonrası anestezi doz aşımı ya da solunum sıkıntısı ile sınırlı genel olarak. Greft yetmezliği, diğer taraftan, gr yetersiz hazırlık sonucu sık görülürgreft yatakta kıç, yanlış konumlandırma, ya da bandaj uygunsuz yerleştirme. Bu yazıda, farelerde tam kalınlıkta deri transplantasyonu için bir protokol mevcut ve başarılı bir işlem için gerekli olan önemli adımları açıklar.
Introduction
Organ nakli son dönem organ yetmezliği olan hastalarda tercih edilen tedavi olup, sonuçlar cerrahi işlemler ve immünsüpresyondaki gelişmeler ile son derece düzeldi. Ancak, uzun süreli immünsüpresyon önemli yan etkileri ile ilişkilidir ve hoşgörüyü teşvik yeni stratejilerin geliştirilmesi, modern nakli araştırmanın amacı kalır.
Çeşitli hayvan modelleri allograft reddinin mekanizmaları incelemek ve immünosupresyon aşı reddinin engellenmesi için ve uzun vadeli dayanıklılık 1-3 teşvik etmek için yaklaşımlar test etmek için, transplantasyon temel araştırma için geliştirilmiştir. Fare modelleri nedeniyle tanı ve tedavi antikorlar ve iyi tanımlanmış kendilenmiş ve transgenik suşlar seçkin ve geniş müsaitlik durumuna immünolojik araştırmaların temelini haline gelmiştir. Cilt nakli özel mikrocerrahi beceri gerektiren ve can değil basit bir işlemdirKolayca postoperatif izlenecektir. Birlikte ele alındığında, fare deri nakli greft reddi 4,5 sırasında antijen sunumu, hücre kaçakçılığı ve doku yıkımı da dahil olmak üzere immün yanıt katılan birçok açıdan incelemek için olağanüstü bir araç olmuştur.
Burada, fare modeli kullanılarak tam kalınlıkta deri transplantasyonu için adım-adım prosedürü göstermek ve biz nakledilen deri başarılı bütünleşme için gerekli önemli adımlar açıklanmaktadır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm işlemler Bakım ve Ulusal Sağlık Enstitüsü (NIH) Laboratuvar Hayvanları Kullanım Kılavuzu uyarınca yapılmıştır ve Johns Hopkins Üniversitesi Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (JHUACUC) tarafından onaylanmıştır. Belirli uygulama usulleri ACUC protokolleri MO13M292 ve MO13M370 altında yapıldı.
1. Donör Cilt Hasat
- (- Fare konisi ile 2% 1 bakım,% 4 indüksiyon buharlaştırıcı) izofluran ile donör fare anestezisi. anestezi derinliği izlemek için ayak tutam çekilme refleksi kullanın.
- Bir elektrikli tıraş makinesi kullanarak, hayvanın arka tıraş ve (örneğin, Betadine)% 10 povidon iyot ile dezenfekte edin.
- areolar bağ dokusu düzeyinde künt diseksiyon ile steril makas, eldiven ve aseptik teknik, boyun kalça hasat donör arka cilt, kullanma.
- hasat sonrası servikal dislokasyon ile hayvan Euthanizederi grefti.
- Mikroskop altında, ince tenotomi makas kullanarak geri deriden bağ dokusu, yağ dokusu ve panniculus carnosus ayırın. panniculus carnosus cilt seğirmesi hareketleri sorumlu ince, şeffaf bir kastır.
- Steril aletler tekniği kullanarak, 15 mm x 15 mm greft yatağına 10 mm x 10 mm geri deriden 15 mm x 15 mm greft kesip.
- Buz üzerinde bir petri steril fosfat tamponlu salin (PBS) ile ıslatılmış etme yöntemleriyle ilgili greft saklayın.
Not: 8-10 greft, bir verici bir fare elde edilebilir.
2. Alıcı Cilt Nakli
- (- Fare konisi ile 2% 1 bakım,% 4 indüksiyon buharlaştırıcı) izofluran ile alıcı fare anestezisi. anestezi derinliği izlemek için ayak tutam çekilme refleksi kullanın.
- Ameliyat sonrası ağrı tedavisi için Buprenorfin 0.02 mg / kg BW yönetme.
- Hayvanın arka tarafı Tıraş nerede greft will takılı olması ve% 10 povidon iyot ile dezenfekte edin.
- makas kullanarak, derinin x 15 mm kare 15-mm 10 mm x 10 mm'lik kesti. kusur boyutu greft daha (% 10) biraz daha büyük olması gerekir. kadar yüzeysel mümkün olduğunca kesin. panniculus carnosus ve damarları korumak için özen gösterin. panniculus carnosus onun hareketlilik ve buna yüzeysel koşmak kan damarları tarafından altta yatan fasya ayırt olabilir.
- kenarları boyunca kıvrımlar kaçınarak, greft yatakta greft yerleştirin.
- Köşelerde ve her kenarın ortasında 8 sütür yerleştirin. Her sütür için, çevredeki alıcı deri altına yatak greft panniculus carnosus yoluyla daha sonra greft içinden iğne geçmesi ve.
- anestezi maskesi çıkarın ve hayvan yapışkan bandaj uygulamadan önce anestezi kısmen kurtarmak edelim.
- greft üzerine katlanmış gazlı bez ile bir yapışkan bandaj alıcı fare sarın. kesme, iki bandaj birleştirerek bandaj yapmakyapışkan birinin parçası ve birlikte iki emici pedler yerleştirerek.
- bandaj toraks gezi kısıtlayan ve nefes olmadığından emin olmak için kurtarma sırasında yakından fare izleyin. solunum sayısı azalır ya da hayvan sığ gasp ya da nefes başlarsa bandajı çıkarın.
3. Ameliyat Sonrası Bakım
- Enfeksiyon profilaksisi için ameliyattan sonra enrofloxacin 5 mg / kg yönetmek.
- tamamen anestezi kurtarır kadar mikrodalga ısıtma yastığı üzerinde temiz bir kafes içinde nakledilen fare yerleştirin.
- konut tesisine iade postoperatif önce 1 saat için fare gözlemleyin.
- Yedi gün ameliyat sonrası Adım 2.1 gibi fare uyutmak. bandaj ventral tarafta boyunca sadece keserek bandaj çıkarın.
- Gözlemlemek ve kabuklanma, kasılma veya sertlik belirtileri ertesi gün greft palpe. Varsa, greft uygun vasculariza elde olmayabiliryon ve teknik bir arıza düşünülmelidir.
- ret belirtileri günlük izleyin. greft dokusunun ≥90% nekrotik hale geldiğinde reddedilen greft düşünün.
- reddedilen hayvanları euthanize ve analiz için onları hasat.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Alıcı fare üzerindeki bandajın yerleştirme işleminin önemli bir adımdır. Deri grefti omuz, kalça, omurga ve (Şekil 1) arasında, alıcı gövde üzerinde konumlandırılmış. Bandaj katlanmış gazlı bez ve iki plastik yapışkanlı bandaj kombinasyonu ile yapılır. Alıcı fare bandajın ortasına gazlı bez üzerinde aşağı greft ile yerleştirilir. iki kavisli mikro forseps kullanılarak, bandajın alt ucu, ilk çekilir ve daha sonra bir bandaj üst karın fare üzerinde sarılır.
tam uyumsuzluk modellerinde, tam kalınlıkta deri grefti genellikle 8 ila 12 gün içinde reddedilir. Küçük uyumsuzluk modellerinde, ret yanıtları daha değişken, yavaş, ve deri grefti görünümü böyle daralma veya saç kaybı (Şekil 2) gibi daha az belirgin değişiklikler ile karakterize edilir. Akut graft reddi cinsLly greft şişlik ve eritem ile başlar. Bu olaylar greft kuruma, büzülme ve kabuk oluşumu (Şekil 2B ve C) tarafından takip edilmektedir. MHC uyumsuzluğu ve immünosupresyon protokolü derecesine bağlı olarak, ret gibi saç dökülmesi, pigmentasyon, cilt sırtlar ve greft hacmi olarak ince değişiklikler ile işaretlenmiş, subakut işlemiyle oluşabilir. Bu gibi durumlarda, bir reddedilen greft dengesiz kenarları (Şekil 2F) 14 ile, parlak beyaz ve tüysüz görünür.
Cilt transplantasyon Bu model kullanarak, greft reddi 15 önlemek için, T-hücre metabolizmasını hedefleyen yeni bir yaklaşım araştırılmıştır. İyi metabolik sinyal yolları T-hücre yanıtlarının 16 çıktılarını dikte kritik rol oynadığı bilinmektedir. Naif T hücreleri temel immün gözetim için gerekli olan enerjiyi üretmek için mitokondriyal oksidatif fosforilasyon güveniyor. Ancak,aktivasyon üzerine, efektör T hücreleri metabolik aerobik glikoliz yeniden programlamak ve artan glutamin metabolizmasını 16,17 sergilerler. donörlerin olarak Balb / c kullanarak ve C57BL / 6 alıcı olarak, yalnız glikoliz ve oksidatif fosforilasyon (2DG + metformin) ya da glutamin metabolizmasını inhibe (DON) deri grefti yaşam süresini uzattığını görülmektedir, fakat aynı anda üç yollar engelleme anlamlı-artmış greft sonuçlandı hayatta kalma (Şekil 3C). Ayrıca, üçlü metabolik tedavi geleneksel siklosporin veya rapamisin (Şekil 3A ve B) daha etkili oldu. Kalıcı kabul nakli toleransı daha iyi uyarılmasını teşvik edebilir, elde ve tüketim tedavisi, yardımcı uyarmanın blokajı veya daha yeni metabolik tedaviler de dahil olmak üzere daha fazla stratejiler, değildi. Ancak, çalışma iki yeni bakış açıları sağlanan: seçici bağışıklık artan metabolik taleplerle hücreleri yanı sıra gereksinimi t hedef non-spesifik inhibitörlerinin kullanımı o greft reddi daha sağlam immünsupresyon elde etmek için aynı anda üç metabolik yolları bloke eder.
Calcineurin inhibitörleri ve rapamisinin memeli hedefi (mTOR) inhibitörleri klinik transplantasyonunda kullanılan geleneksel immunsupresif tedavinin en oluşturmaktadır. siklosporin ve rapamisin ile tedavi C57BL / 6 cilt nakli için Balb / c Medyan greft sağkalım oranları sırasıyla, 17 ve 16 gün idi. Buna karşılık, alıcı T hücresi glikoliz mitokondriyal oksidatif fosforilasyon inhibe metabolik inhibitörleri ile muamele edilmiş ve glutamin metabolizması uzun bir yaşam süresi vardı: ortalama aşı yaşamda kalması 29 gün idi. Ayrıca, metabolik tedavi grubundan deri grefti histoloji daha sağlam doku uyumu ve daha az lenfositik inflamasyon (Şekil 4) sergiledi.
105 / 55105fig1.jpg "/>
Şekil 1: Bandaj ile Graft Kaplama. Sağ gövde üzerine yerleştirilmiş (A) Deri grefti. Katlanmış gazlı bez ve iki plastik şeritler bandaj ile yapılan (B) Bandaj. Gazlı bez üzerine yerleştirilen (C) Alıcı fare. (DF) Bandaj fare sarılı. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 2: Akut ve Kronik Reddi sırasında Deri Greft Görünüm. C57BL / 6 (tam uyumsuzluğu) (A) Balb / c reddi (gün 8) bulguları olmaksızın tam kalınlıkta deri nakli. (B) Balb /% 50 greft reddi, C57BL / 6 tam kalınlıkta deri nakli C (gün 13). (C) Balb / tam greft reddi (gün 18) ile C57BL / 6-tam kalınlıkta deri transplantasyonu c. (D), singenik derisi nakli (gün 8). (E) singenik tam kalınlıkta deri transplantasyonu (gün 30). (F) C57BL / C57BL / 6 (küçük uyumsuzluğu) 10 kronik greft reddi (gün 100) tam kalınlıkta deri nakli. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 3: C57BL / 6 Cilt Graft Survival Balb / c. (A) Tedavi siklosporin (25 mg / kg QD) ile. (B) işleme rapamisin (3 mg / kg QD) ile. Metabolik inhibitörleri ile (C) tedavisi, 2-Deoksi-D-glikoz (2DG) 500mg / kg QD, metformin, 150 mg / kg QD ve 6-diazo-5-okso-L-norlösin (DON) 1.6 mg / kg QOD. Tüm tedaviler reddine kadar naklin yapıldığı gün tatbik edilmiştir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 4: Hematoksilen ve Eosin Leke; Deri (sağ, X100 sol X200) Postoperatif 7. günde Metabolik Terapi ile greftler. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Tavşan ve farelerde daha sonra insan çalışmalarında ilk ve Medawar tarafından piyasaya sunulmasından bu yana, deri transplantasyonu allojenik bağışıklık tepkilerinin 6,7 çalışmaları için paha biçilmez bir model olmuştur. Bu yazıda, üst ve alt sırt derisi kullanılarak büyük ölçekli, non-vaskülarize, tam kalınlıkta deri nakli bir model sunuyoruz. Kuyruk deri veya Nakledilecek doku kaynağı olarak fare kulak derisi kullanılarak da dahil olmak üzere çeşitli alternatif yöntemler, 8,9 bugüne kadar rapor edilmiştir. Bu modeller, teknik sadelik ayrı bir avantajı sunmak ve yüksek hacimli üretim için izin verir. Kuyruk deri eklerine epidermal Langerhans hücreleri ve dermal dendritik hücrelerin göreceli eksikliği, özellikle de küçük bir MHC uyumsuzluğu modellerinde 10,11, gecikmiş reddedilmesine de kolaylaştırılmış aşı kabul için ana bilgisayar tarafından yol açar. Bu nedenle, tam kalınlıkta gövde deri grefti T-hücre medya incelemek için daha sağlam bir modeli ve daha uygun olarak kabul edilirted ret 12 akut.
Buna ek olarak, bizim modeli basit teknikleri kullanır ve gelişmiş mikrocerrahi beceri gerektirmez. çalışma süresi (~ 10 prosedürün tamamlanması için anestezi başlangıcından fare başına dakika) ve postoperatif morbidite ve mortalite ihmal edilebilir kısadır. (Bandaj çıkarılmadan önce cerrahi artı ölümünden sonra 24 saat içinde ölüm) genel cerrahi mortalite% 3.8 13 olarak rapor edilmiştir. Komplikasyonların çoğu kolayca postoperatif erken dönemde ve solunum sıkıntısı 6,17 erken belirtileri de bandaj hızla uzaklaştırılması ile solunum fonksiyonları yakından izlenmesi ile önlenebilir anestezi doz aşımı ya da aşırı kısıtlayıcı bandaj, kaynaklanır.
Engraftman sürecinin en kritik faktör greft 6 ev sahipliği gemilerin çoğalmasıyla greft dokusunun revaskülarizasyon olduğunu. Hasat cilt gerektirirdikkatli bir hazırlık s ve panniculus carnosus diseksiyon kritik bir adımdır. Bir mikroskop altında panniculus carnosus kaldırmak için tercih. Kenarlardan biri diseksiyon başlatmak ve kas itme ve hafif açılı bir kıvrık tenotomisinin bıçak ile deriden ayrılarak yavaş ilerlemeye önerilir. greft yatağının sitesi eklem ve omurga uzak olmalıdır. Alıcı fare içine kesiler yapmadan önce, omuz ve kalça eklemleri düzeyini ayırmak için yardımcı cilt kıvrımları görselleştirmek için hareket ettirilmelidir. Alıcı cilt çıkarırken, panniculus carnosus için yüzeysel koşmak kan damarları zarar vermemek için çok önemlidir. Kanama oluşursa, yerel sıkıştırma uygulamak ve engraftment engel olabilir kan ve pıhtılar çıkarın. greft ve otomatik mu hareketini önlemek üzere yeterince konstriktif olması gerekir, ancak son olarak, sargı bezi, uzlaşmanın geri solunum zorluğuna neden olmamalıdırrevaskülarizasyon işlemi sırasında basýnç. Plastik Şeritler Band-Aids yapışık ve bu amaç için yeterince güçlü. Biz tamamen fare bel sarmak için ve bandaj ve greft (Şekil 1) arasında bir katlanmış gazlı bez yerleştirilmesine olanak sağlamak üzere iki bandaj birleştirir. Bandaj bunun ventral tarafında kesilerek çıkarılır ve geri kalanı elle bandajı çıkarmak isterken greft bozmamak amacıyla, hayvan tarafından çıkarılır.
Özetle, tam kalınlıkta deri nakli literatürde bol referansları olan köklü bir modeldir. prosedür gerçekleştirmek kolaydır, çalışma süresi kısa ve postoperatif komplikasyonlar sınırlıdır. kritik adımlar titiz donör cilt hasat ve alıcı bandaj doğru yerleştirilmesi ile ilgilidir. anjiogenezisi ve doku onarımını teşvik biyomateryalleri içeren Gelecekteki çalışmalar prosedürün başarı oranını artırabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.
Acknowledgments
Bu çalışma NIH hibe R01AI077610 tarafından finanse edildi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Straight micro forceps | Sigma | F4017 | |
| Curved micro forceps | Aesculap | BD333R | |
| Curved Stevens tenotomy scissors | Aesculap | BC905R | |
| Mayo dissecting scissors | Sigma | S3146 | |
| Micro needle holder | Aesculap | BM563R | |
| Sterile gauze | Covidien | 441218 | |
| 6-0 Nylon suture | MWI | 31849 | |
| Plastic Strips Band-Aid | Johnson & Johnson | Obtained from pharmacy | |
| 10 cm Petri dish | Fisherbrand | FB0875712 | |
| PBS | Quality Biological | 119069131 | |
| Buprenorphine | DEA Number required; Obtained from hospital pharmacy | ||
| Enrofloxacin | Bayer Health Care | 186599 |
References
- Furtmuller, G. J., et al. Orthotopic Hind Limb Transplantation in the Mouse. J Vis Exp. , (2016).
- Oh, B., et al. A Novel Microsurgical Model for Heterotopic, En Bloc Chest Wall, Thymus, and Heart Transplantation in Mice. J Vis Exp. , (2016).
- Oberhuber, R., et al. Murine cervical heart transplantation model using a modified cuff technique. J Vis Exp. , e50753 (2014).
- Jones, T. R., Shirasugi, N., Adams, A. B., Pearson, T. C., Larsen, C. P. Intravital microscopy identifies selectins that regulate T cell traffic into allografts. J Clin Invest. 112, 1714-1723 (2003).
- Celli, S., Albert, M. L., Bousso, P. Visualizing the innate and adaptive immune responses underlying allograft rejection by two-photon microscopy. Nat Med. 17, 744-749 (2011).
- Medawar, P. B. The behaviour and fate of skin autografts and skin homografts in rabbits: A report to the War Wounds Committee of the Medical Research Council. J Anat. 78, 176-199 (1944).
- Billingham, R. E., Brent, L., Medawar, P. B., Sparrow, E. M. Quantitative studies on tissue transplantation immunity. I. The survival times of skin homografts exchanged between members of different inbred strains of mice. Proc R Soc Lond B Biol Sci. 143, 43-58 (1954).
- Garrod, K. R., Cahalan, M. D.
- Schmaler, M., Broggi, M. A., Rossi, S. W. Transplantation of tail skin to study allogeneic CD4 T cell responses in mice. J Vis Exp. , e51724 (2014).
- Bergstresser, P. R., Toews, G. B., Gilliam, J. N., Streilein, J. W. Unusual numbers and distribution of Langerhans cells in skin with unique immunologic properties. J Invest Dermatol. 74, 312-314 (1980).
- Chen, H. D., Silvers, W. K. Influence of Langerhans cells on the survival of H-Y incompatible skin grafts in rats. J Invest Dermatol. 81, 20-23 (1983).
- Chong, A. S., Alegre, M. L., Miller, M. L., Fairchild, R. L. Lessons and limits of mouse models. Cold Spring Harb Perspect Med. 3, a015495 (2013).
- Mayumi, H., Nomoto, K., Good, R. A. A surgical technique for experimental free skin grafting in mice. Jpn J Surg. 18, 548-557 (1988).
- McFarland, H. I., Rosenberg, A. S.
- Lee, C. F., et al. Preventing Allograft Rejection by Targeting Immune Metabolism. Cell reports. 13, 760-770 (2015).
- Pollizzi, K. N., Powell, J. D. Integrating canonical and metabolic signalling programmes in the regulation of T cell responses. Nat Rev Immunol. 14, 435-446 (2014).
- Pearce, E. L., Poffenberger, M. C., Chang, C. H., Jones, R. G. Fueling immunity: insights into metabolism and lymphocyte function. Science. 342, 1242454 (2013).
