Summary
Murin full tjocklek hudtransplantation är en väl etablerad modell för att studera avslag i ett alloimmun inställning. Här ger vi en handledning för varje involverad i att utföra en BALB / c steg -> C57BL / 6 full tjocklek hudtransplantation.
Abstract
Murin full tjocklek hudtransplantation är en väletablerad in vivo modell för att studera alloimmun svar och avstötning av transplantat. Trots sin begränsade tillämpning på människor, har hudtransplantation på möss i stor utsträckning använts för transplantation forskning. Förfarandet är lätt att lära och utföra och det kräver inte känsliga mikrokirurgisk teknik eller omfattande utbildning. Dessutom, transplantatavstötning i denna modell förekommer i en mycket reproducerbar immunologisk reaktion och övervakas lätt genom direkt inspektion och palpation. Dessutom kan sekundär hudtransplantation med givare matchade eller tredjeparts hudtransplantation utföras på mer komplexa transplantationsmodeller som ett alternativ och okomplicerad metod för att bedöma givarspecifik tolerans. Komplikationerna är låga och är i allmänhet begränsade till anestesi överdos eller andnöd efter ingreppet. Graft fel, å andra sidan, uppträder vanligen som ett resultat av dålig förberedelse för grakterut, felaktig placering i transplantatet sängen, eller olämplig placering av bandaget. I den här artikeln presenterar vi ett protokoll för full tjocklek hudtransplantation på möss och beskriva de viktiga åtgärder som krävs för en lyckad procedur.
Introduction
Organtransplantation är behandling av valet för patienter med gravt organsvikt, och resultaten har förbättrats avsevärt med framsteg inom kirurgiska ingrepp och immunosuppression protokoll. Dock är långsiktigt immunosuppression i samband med betydande biverkningar, och utveckling av nya strategier som främjar tolerans förblir målet för moderna transplantationsforskning.
Ett stort antal djurmodeller har utvecklats för grundforskning vid transplantation, för att studera mekanismerna bakom allograftavstötning och testa immunsuppression metoder för att förhindra avstötning av transplantat och för att främja långtidstolerans 1-3. Musmodeller har blivit grunden för immunologisk forskning på grund av den exklusiva och stora tillgången på diagnostiska och terapeutiska antikroppar och väldefinierade inavlade och transgena stammar. Hudtransplantation är en enkel procedur som inte kräver speciella mikrokunskaper och kanlätt övervakas postoperativt. Sammantaget har mushud transplantation varit ett utomordentligt verktyg för att studera många aspekter på alloimmun svar, bland annat antigen leverans, cell trafficking, och vävnadsdöd under avstötning 4,5.
Här visar vi steg-för-steg förfarande för full tjocklek hudtransplantation använder musmodell och vi beskriver de viktiga åtgärder som krävs för en lyckad engraftment av transplanterade hud.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla procedurer utfördes i enlighet med handledningen för vård och användning av försöksdjur i National Institute of Health (NIH) och godkändes av Johns Hopkins University Djurvård och användning kommittén (JHUACUC). De särskilda förfaranden utfördes under den godkända ACUC protokoll MO13M292 och MO13M370.
1. Donator Skin Harvest
- Söva donator mus med isofluran (induktions förångare vid 4%, underhåll vid 1-2% genom musen kon). Använd tå nypa tillbakadragande reflex att övervaka djupet av anestesi.
- Använda en elektrisk rakapparat, raka ryggen på djuret och desinficera det med 10% povidonjod (t.ex. Betadine).
- Använda steril sax, handskar och aseptisk teknik, skörd givare tillbaka hud från höften till halsen, med trubbig dissektion på samma nivå som den areolar bindväv.
- Avliva djuret genom cervikal dislokation Efter skörd avhudtransplantat.
- Under ett mikroskop, separera bindväv, fettvävnad, och panniculus carnosus från baksidan hud med fina tenotomy sax. Panniculus carnosus är en tunn, transparent muskel ansvarig för hud ryckningar rörelser.
- Med användning av sterila instrument teknik, klipp ut 15-mm x 15-mm-transplantat från baksidan huden för en 10-mm x 10-mm till 15-mm x 15-mm transplantatbädden.
- Lagra transplantat på gasväv indränkt med steril fosfatbuffrad saltlösning (PBS) i en petriskål på is.
OBS: 8 - 10 transplantat kan erhållas från en donator mus.
2. Mottagare hudtransplantation
- Söva mottagaren mus med isofluran (induktions förångare vid 4%, underhåll vid 1-2% genom musen kon). Använd tå nypa tillbakadragande reflex att övervaka djupet av anestesi.
- Administrera 0,02 mg / kg kroppsvikt av buprenorfin för postoperativ smärtlindring.
- Raka sidan av ryggen på djuret där transplantatet will vara insatt och desinficera med 10% povidonjod.
- Med sax, klippa en 10-mm x 10 mm till 15 mm x 15 mm kvadrat av huden. Defekten storlek ska vara något större (10%) än transplantatet. Skär så ytligt som möjligt. Var noga med att bevara panniculus carnosus och fartyg. Panniculus carnosus kan särskiljas från den underliggande fascia genom sin rörlighet och blodkärlen som kör ytliga till det.
- Placera transplantatet på transplantat sängen, undvika veck längs kanterna.
- Placera 8 suturer i hörnen och på mitten av varje kant. För varje sutur, passerar nålen genom transplantatet och sedan genom panniculus carnosus av transplantatet säng under omgivande mottagaren huden.
- Ta bort narkosmasken och låt djuret återhämta sig delvis från anestesi innan applicering av plåster.
- Linda mottagande musen i ett plåster med vikta gasväv över transplantatet. Gör bandaget genom att kombinera två bandage, skäraden vidhäftande delen av en och placera de två absorberande dynor tillsammans.
- Övervaka musen noga under återhämtning för att säkerställa att bandaget inte begränsar bröstkorgen utflykt och andas. Avlägsna bandage om andningsfrekvensen minskar eller djuret börjar kippa eller andas grunt.
3. Postoperativ vård
- Administrera enrofloxacin 5 mg / kg efter kirurgi för infektionsprofylax.
- Placera den transplanterade musen i en ren bur under en i mikrovågsugn värmedyna tills den återhämtat sig fullständigt från anestesin.
- Observera musen för en timme postoperativt före att återvända till huset anläggningen.
- Sju dagar efter operationen, söva musen som i steg 2,1. Avlägsna bandaget genom att endast skära genom den ventrala sidan av bandaget.
- Observera och palpera transplantatet på följande dag efter tecken på skorpbildning, kontraktion eller hårdhet. Om närvarande kan transplantatet inte har uppnått korrekt vascularizaning och bör betraktas som ett tekniskt fel.
- Övervaka dagligen för tecken på avstötning. Överväga transplantat avvisas när ≥90% av transplantatet vävnaden blir nekrotisk.
- Avliva de avvisade djur och skörda dem för analys.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Placeringen av bandaget på mottagarens mus är ett viktigt steg i förfarandet. Hudtransplantatet är placerad på mottagarens bålen, mellan ansatsen, höft och rygg (figur 1). Bandaget görs med vikta gasväv och kombinationen av två plast vidhäftande bandage. Mottagaren mus placeras med transplantatet ner över gasväv på mitten av bandaget. Med användning av två krökta mikro pincett, är den nedre änden av bandaget dragés först, och sedan toppen av bandaget lindas över musen till buken.
I kompletta mismatch modellerna full tjocklek hudtransplantat vanligen förkastas i 8 till 12 dagar. I mindre mismatch modeller, avstötningssvar är långsammare, mer rörlig och hudtransplantation utseende kännetecknas av mindre tydliga förändringar, såsom kontraktion eller förlust av hår (Figur 2). Akut transplantatavstötning släktenally börjar med svullnad och erytem av transplantatet. Dessa händelser följs av transplantat uttorkning, krympning, och skorv bildning (figur 2B och C). Beroende på graden av MHC obalans och immunosuppression protokollet kan avslag ske genom en subakut process, präglad av subtila förändringar såsom håravfall, pigmentering, dermala åsar och transplantat volym. I dessa fall visas en avvisade transplantat glänsande, vit, och hårlösa, med ojämna kanter (Figur 2F) 14.
Med hjälp av denna modell av hudtransplantation, undersökte vi en ny metod med inriktning T-cellmetabolism för att förhindra avstötning av transplantat 15. Det är väl känt att metabola signalvägar spelar kritiska roller i att diktera resultaten av T-cellsvar 16. Naiva T-celler är beroende av mitokondriell oxidativ fosforylering för att generera den energi som krävs för grundläggande immunövervakning. Dock,vid aktivering, T-celler metaboliskt omprogrammera aerob glykolys och uppvisar ökad glutamin metabolism 16,17. Använda Balb / c som givare och C57BL / 6 som mottagare observerade vi att hämma glykolys och oxidativ fosforylering (2DG + metformin) eller glutamin metabolism ensam (DON) förlängd hudtransplantatöverlevnad, men blockerar de tre banorna samtidigt resulterat i betydligt-ökad transplantat överlevnad (figur 3C). Dessutom, trippel metabolisk terapi var effektivare än konventionella cyklosporin eller rapamycin (Figur 3A och B). Permanent acceptans uppnåddes inte, och ytterligare strategier, inklusive utarmning terapi, samstimulering blockad eller nyare metabola terapier, kan främja en bättre induktion av transplantationstolerans. Men studien gav två nya insikter: användningen av icke-specifika inhibitorer för att rikta selektiva immunceller med ökade metaboliska krav, liksom kravet på t o blockera de tre metaboliska vägar samtidigt för att erhålla mer robust immunsuppression i transplantatavstötning.
Calcineurinhämmare och mammalian target of rapamycin (mTOR-hämmare) utgör huvuddelen av konventionell immunosuppressiv behandling som används i klinisk transplantation. Median transplantat överlevnad av Balb / c för att C57BL / 6 transplantationer hud som behandlats med ciklosporin och rapamycin var 17 och 16 dagar, respektive. I jämförelse, mottagare behandlas med metabola hämmare som hämmar T-cells glykolys, mitokondriell oxidativ fosforylering, och glutamin metabolism hade förlängd överlevnad: mediantransplantatöverlevnaden var 29 dagar. Vidare histologin av hudtransplantat från den metaboliska terapigruppen uppvisade mer intakt vävnad inriktning och mindre lymfocytisk inflammatoriskt infiltrat (Figur 4).
105 / 55105fig1.jpg "/>
Figur 1: Täckning av transplantatet med bandaget. (A) Hud graft placeras på höger stammen. (B) Bandage gjord med ett vikt gasväv och två plastremsor bandage. (C) Mottagare musen placeras på gasväv. (DF) Bandage virad runt musen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: hudtransplantation Utseende under akut och kronisk avstötning. (A) Balb / c för att C57BL / 6 (komplett mismatch) full tjocklek hudtransplantation utan tecken på avstötning (dag 8). (B) Balb / c för att C57BL / 6 med full tjocklek hudtransplantation med 50% transplantatavstötning (dag 13). (C) Balb / c för att C57BL / 6 med full tjocklek hudtransplantation med fullständig transplantatavstötning (dag 18). (D) syngena full tjocklek hudtransplantation (dag 8). (E) syngena full tjocklek hudtransplantation (dag 30). (F) C57BL / 10 till C57BL / 6 (mindre mismatch) full tjocklek hudtransplantation med kronisk avstötning (dag 100). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Balb / c för att C57BL / 6 hudtransplantatöverlevnad. (A) Behandling med cyklosporin (25 mg / kg QD). (B) Behandling med rapamycin (3 mg / kg QD). (C) Behandling med metabola hämmare, 2-deoxi-D-glukos (2DG) 500mg / kg QD, metformin 150 mg / kg QD, och 6-diazo-5-oxo-L-norleucin (DON) 1,6 mg / kg QOD. Alla behandlingar administrerades från transplantationsdagen fram till avstötning. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Hematoxylin och Eosin Stain (höger, X100, vänster, X200) av hudtransplantat med Metabolic terapi vid Postoperativ Dag 7. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Sedan introduktionen av Medawar, först i humanstudier och sedan i kaniner och möss har hudtransplantation varit en ovärderlig modell för studier av allogena immunsvar 6,7. I detta manuskript, presenterar vi en modell av storskalig, icke-vaskulariserade, full tjocklek hud transplantation med användning av de övre och nedre delen av ryggen hud. Olika alternativa metoder, innefattande användning av svansen hud eller öronhuden på musen som implantatet vävnadskälla, har rapporterats till dags dato 8,9. Dessa modeller presenterar den klara fördelen av teknisk enkelhet och tillåter stora volymer genomströmning. Den relativa bristen på epidermala Langerhans celler och dermala dendritiska celler i svansen hudtransplantation, leder emellertid till fördröjd avstötning samt underlättat acceptans transplantat av värden, särskilt i mindre MHC mismatch modeller 10,11. Därför är full tjocklek trunk hudtransplantation anses vara en mer robust modell och mer lämpade för att studera T-cell-medieTed akut avstötning 12.
Dessutom utnyttjar vår modell enkla tekniker och kräver ingen avancerad mikrokirurgiska färdigheter. Drifttiden är kort (~ 10 min per mus från början av anestesi till slutförandet av förfarandet), och den postoperativa morbiditet och mortalitet är försumbar. Den totala operativa dödlighet (död inom 24 timmar efter operation plus död före avlägsnande av bandaget) har rapporterats vara 3,8% 13. De flesta av de komplikationer uppstår från anestesi överdos eller alltför begränsande bandage, som lätt kan förhindras genom noggrann övervakning av andningsfunktionen under den omedelbara postoperativa perioden och genom snabb borttagning av bandaget på tidigaste tecknen på andnöd 6,17.
Den mest kritiska faktorn i processen för engraftment är revaskularisering av transplantatvävnaden genom inväxt av värdkärlen till transplantatet 6. Den skördade huden krävaär noggranna förberedelser, och dissektion av panniculus carnosus är ett kritiskt steg. Vi föredrar att ta bort panniculus carnosus under ett mikroskop. Det rekommenderas att börja dissektion från en av kanterna och att avancera långsamt genom att trycka på muskeln och separera den från huden med bladet på en böjd tenotomy vinklad något. Platsen för transplantatbädden bör vara långt från leder och ryggraden. Innan du gör snitt i mottagaren musen bör axel och höft flyttas för att visualisera hudveck som hjälper till att avgränsa den nivå i lederna. När du tar bort mottagaren huden, är det viktigt att undvika att skada blodkärlen som kör ytliga till panniculus carnosus. Om blödning uppstår, tillämpa lokal kompression och tvätta bort blodet och blodproppar som kan störa engraftment. Slutligen bör bandaget inte orsaka andningssvårigheter som kompromiss återhämtning, även om det måste vara tillräckligt konstriktiv för att förhindra förskjutning av transplantatet och auto-mulation under processen för revaskularisering. Plastremsor plåster är vidhäftande och stark nog för detta ändamål. Vi kombinerar två bandage att helt svepa musen midjan och möjliggöra placeringen av ett vikt gasväv mellan bandaget och transplantatet (Figur 1). Bandaget avlägsnas genom att skära den ventrala sidan av det, och resten avlägsnas av djuret, för att undvika att störa transplantatet samtidigt som man försöker ta bort bandaget manuellt.
Sammanfattningsvis är full tjocklek hudtransplantation en väl etablerad modell med rikliga referenser i litteraturen. Förfarandet är lätt att utföra, är drifttiden kort, och postoperativa komplikationer är begränsade. De kritiska stegen är relaterade till noggrann givare hud skörd och korrekt placering av mottagaren bandage. Framtida studier med biomaterial som främjar angiogenes och vävnadsreparation kan ytterligare förbättra andelen framgångsrika förfarandet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingenting att lämna ut.
Acknowledgments
Detta arbete har finansierats av NIH bidrag R01AI077610.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Straight micro forceps | Sigma | F4017 | |
| Curved micro forceps | Aesculap | BD333R | |
| Curved Stevens tenotomy scissors | Aesculap | BC905R | |
| Mayo dissecting scissors | Sigma | S3146 | |
| Micro needle holder | Aesculap | BM563R | |
| Sterile gauze | Covidien | 441218 | |
| 6-0 Nylon suture | MWI | 31849 | |
| Plastic Strips Band-Aid | Johnson & Johnson | Obtained from pharmacy | |
| 10 cm Petri dish | Fisherbrand | FB0875712 | |
| PBS | Quality Biological | 119069131 | |
| Buprenorphine | DEA Number required; Obtained from hospital pharmacy | ||
| Enrofloxacin | Bayer Health Care | 186599 |
References
- Furtmuller, G. J., et al. Orthotopic Hind Limb Transplantation in the Mouse. J Vis Exp. , (2016).
- Oh, B., et al. A Novel Microsurgical Model for Heterotopic, En Bloc Chest Wall, Thymus, and Heart Transplantation in Mice. J Vis Exp. , (2016).
- Oberhuber, R., et al. Murine cervical heart transplantation model using a modified cuff technique. J Vis Exp. , e50753 (2014).
- Jones, T. R., Shirasugi, N., Adams, A. B., Pearson, T. C., Larsen, C. P. Intravital microscopy identifies selectins that regulate T cell traffic into allografts. J Clin Invest. 112, 1714-1723 (2003).
- Celli, S., Albert, M. L., Bousso, P. Visualizing the innate and adaptive immune responses underlying allograft rejection by two-photon microscopy. Nat Med. 17, 744-749 (2011).
- Medawar, P. B. The behaviour and fate of skin autografts and skin homografts in rabbits: A report to the War Wounds Committee of the Medical Research Council. J Anat. 78, 176-199 (1944).
- Billingham, R. E., Brent, L., Medawar, P. B., Sparrow, E. M. Quantitative studies on tissue transplantation immunity. I. The survival times of skin homografts exchanged between members of different inbred strains of mice. Proc R Soc Lond B Biol Sci. 143, 43-58 (1954).
- Garrod, K. R., Cahalan, M. D.
- Schmaler, M., Broggi, M. A., Rossi, S. W. Transplantation of tail skin to study allogeneic CD4 T cell responses in mice. J Vis Exp. , e51724 (2014).
- Bergstresser, P. R., Toews, G. B., Gilliam, J. N., Streilein, J. W. Unusual numbers and distribution of Langerhans cells in skin with unique immunologic properties. J Invest Dermatol. 74, 312-314 (1980).
- Chen, H. D., Silvers, W. K. Influence of Langerhans cells on the survival of H-Y incompatible skin grafts in rats. J Invest Dermatol. 81, 20-23 (1983).
- Chong, A. S., Alegre, M. L., Miller, M. L., Fairchild, R. L. Lessons and limits of mouse models. Cold Spring Harb Perspect Med. 3, a015495 (2013).
- Mayumi, H., Nomoto, K., Good, R. A. A surgical technique for experimental free skin grafting in mice. Jpn J Surg. 18, 548-557 (1988).
- McFarland, H. I., Rosenberg, A. S.
- Lee, C. F., et al. Preventing Allograft Rejection by Targeting Immune Metabolism. Cell reports. 13, 760-770 (2015).
- Pollizzi, K. N., Powell, J. D. Integrating canonical and metabolic signalling programmes in the regulation of T cell responses. Nat Rev Immunol. 14, 435-446 (2014).
- Pearce, E. L., Poffenberger, M. C., Chang, C. H., Jones, R. G. Fueling immunity: insights into metabolism and lymphocyte function. Science. 342, 1242454 (2013).
