Summary
Murint fuld tykkelse hudtransplantation er en veletableret model til at studere afstødning i en alloimmun indstilling. Her giver vi en tutorial af hvert trin involveret i at udføre en BALB / c -> C57BL / 6 fuld-tykkelse hud transplantation.
Abstract
Murint fuld tykkelse hudtransplantation er en veletableret in vivo-model til at studere alloimmun respons og transplantatafstødning. På trods af sin begrænsede anvendelse til mennesker, har hudtransplantation hos mus blevet bredt anvendt til transplantation forskning. Proceduren er let at lære og udføre, og det kræver ikke sarte mikrokirurgiske teknikker eller omfattende uddannelse. Desuden transplantatafstødning i denne model forekommer i en meget reproducerbar immunologisk reaktion og kan let overvåges ved direkte inspektion og palpering. Desuden kan sekundær hud transplantation med donor-matchede eller tredjepart hudtransplantation udføres på mere komplekse transplantation modeller som et alternativ og ukompliceret metode til at vurdere donor-specifikke tolerance. Komplikationerne er lave og er generelt begrænset til anæstesi overdosering eller respiratorisk distress efter indgrebet. Organsvigt, på den anden side, forekommer almindeligt som følge af dårlig forberedelse af GRagter, ukorrekt positionering i transplantatlejet, eller uhensigtsmæssig placering af bandagen. I denne artikel præsenterer vi en protokol for fuld tykkelse hud transplantation hos mus og beskrive de vigtige skridt, der er nødvendige for en vellykket procedure.
Introduction
Organtransplantation er behandling af valg for patienter med slutstadiet organsvigt, og resultaterne har forbedret markant med fremskridt inden for kirurgiske procedurer og immunosuppression protokoller. Imidlertid er langsigtede immunosuppression forbundet med betydelige bivirkninger, og udvikling af nye strategier, der fremmer tolerance forbliver målet af moderne transplantation forskning.
Talrige dyremodeller er blevet udviklet til grundforskning i transplantation, for at studere de mekanismer allotransplantatafvisning og afprøve immunsuppression tilgange til forebyggelse af transplantatafstødning og til fremme langsigtet tolerance 1-3. Musemodeller er blevet grundpillen i immunologiske forskning på grund af den eksklusive og store tilgængelighed af diagnostiske og terapeutiske antistoffer og veldefinerede indavlede og transgene stammer. Hud transplantation er en simpel procedure, der ikke kræver særlige mikrokirurgiske færdigheder og kanlet overvåges postoperativt. Tilsammen har mus hudtransplantation været en ekstraordinær værktøj til at studere mange aspekter involveret i alloimmun respons, herunder antigen levering, celle menneskehandel, og ødelagt væv under afstødning 4,5.
Her viser vi trin-for-trin procedure for fuld-tykkelse hud transplantation ved hjælp af musen model, og vi beskriver de vigtige skridt, der er nødvendige for en vellykket transplantation af den transplanterede hud.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle procedurer blev udført i overensstemmelse med den vejledning for pleje og anvendelse af forsøgsdyr af National Institute of Health (NIH), og blev godkendt af Johns Hopkins University Animal Care og brug Udvalg (JHUACUC). De specifikke procedurer blev udført i henhold til den godkendte ACUC protokoller MO13M292 og MO13M370.
1. Donor Skin Harvest
- Bedøver donor mus med isofluran (induktion fordamper ved 4%, vedligeholdelse 1 - 2% gennem musen kegle). Brug tå knivspids tilbagetrækning refleks til at overvåge dybden af bedøvelse.
- Ved anvendelse af en elektrisk barbermaskine, barbere bagsiden af dyret og desinficere det med 10% povidon-iod (f.eks Betadine).
- Brug af steril saks, handsker og aseptisk teknik, høst donor tilbage hud fra hofte til halsen, med stump dissektion på niveau med den areolar bindevæv.
- Aflive dyret ved cervikal dislokation efter høst afhudtransplantat.
- Under et mikroskop, adskille bindevæv, fedtvæv, og panniculus carnosus fra bagsiden huden ved hjælp fine tenotomy saks. Panniculus carnosus er en tynd, transparent muskel ansvarlig for hudens trækninger bevægelser.
- Med steril instrumenter teknik, skåret ud 15-mm x 15 mm podninger fra bagsiden huden for en 10-mm x 10 mm til 15 mm x 15 mm graft seng.
- Opbevar transplantaterne på gazer gennemvædet med sterilt phosphatbufret saltvand (PBS) i en petriskål på is.
BEMÆRK: 8 - 10 podninger kan fås fra en donor mus.
2. Modtager Skin Transplant
- Bedøver modtageren mus med isofluran (induktion fordamper ved 4%, vedligeholdelse 1 - 2% gennem musen kegle). Brug tå knivspids tilbagetrækning refleks til at overvåge dybden af bedøvelse.
- Administrer 0,02 mg / kg legemsvægt af buprenorphin til postoperativ smertelindring.
- Barbere den side af ryggen af dyret, hvor transplantatet will være indsat og desinficere med 10% povidon jod.
- Med en saks, klippe en 10-mm x 10-mm til 15 mm x 15 mm kvadrat af huden. Defekten størrelse bør være lidt større (10%) end transplantatet. Skær så overfladisk som muligt. Vær omhyggelig med at bevare panniculus carnosus og fartøjer. Den panniculus carnosus kan skelnes fra den underliggende fascia ved sin mobilitet og blodkarrene, der kører overfladisk til det.
- Placer transplantatet på transplantatlejet, undgå folder langs kanterne.
- Placere 8 suturer på hjørnerne og på midten af hver kant. For hver sutur, passerer nålen gennem graften og derefter gennem panniculus carnosus af transplantatet seng under omgivende modtagerens hud.
- Fjern bedøvelsesmiddel maske og lad dyret komme sig delvist fra anæstesi før påføring af selvklæbende bandage.
- Wrap modtageren musen i en selvklæbende bandage med foldede gaze over transplantatet. Gør bandage ved at kombinere to bandager, opskæringden klæbende del af en og placere de to absorberende puder sammen.
- Overvåg musen nøje under opsving til at sikre, at bandagen ikke begrænser thorax udflugt og vejrtrækning. Fjern forbindingen, hvis respirationsfrekvens falder eller dyret begynder at gispe eller ånde overfladisk.
3. Postoperativ pleje
- Administrere enrofloxacin 5 mg / kg efter operation for infektion profylakse.
- Placer transplanterede mus i en ren bur over en mikrobølgeovn varmepude, indtil den er kommet sig fuldstændigt fra anæstesi.
- Overhold musen i 1 time postoperativt før returnere det til huset facilitet.
- Syv dage efter operationen, bedøver musen som i trin 2.1. Tage bindet ved at skære kun gennem den ventrale side af bandagen.
- Observer og palpere implantatet på den følgende dag for tegn på skorpedannelse, sammentrækning eller hårdhed. Hvis til stede, kan transplantatet ikke har opnået ordentlig vascularization og bør betragtes som et teknisk svigt.
- Overvåg dagligt for tegn på afstødning. Overvej transplantater afvist når ≥90% af graft væv bliver nekrotisk.
- Aflive de afviste dyr og høste dem til analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Placeringen af bandagen på modtagerens musen er et vigtigt skridt i proceduren. Hudtransplantatet placeret på modtagerens stammen, mellem skulderen, hoften, og rygrad (Fig 1). Bandagen er lavet med foldede gaze og kombinationen af to plastik klæbende bandager. Modtageren mus anbringes med transplantatet ned over gaze på midten af bandagen. Brug af to buede mikro pincet, er den nedre ende af bandagen trækkes først, og derefter toppen af bandagen vikles over musen til maven.
I komplette mismatch modeller, er fuld-tykkelse hudtransplantater normalt forkastet i 8 til 12 dage. I mindre mismatch modeller, afstødningsreaktioner er langsommere, mere variabel, og huden graft udseende er karakteriseret ved mindre tydelige ændringer, såsom sammentrækning eller tab af hår (figur 2). Akut transplantatafstødning slægterlly begynder med hævelse og erytem af graften. Disse begivenheder er efterfulgt af graft udtørring, krympning, og skorpedannelse (Figur 2B og C). Afhængigt af graden af MHC mismatch og immunosuppression protokollen, kan afvisning ske ved en subakut proces, præget af subtile ændringer såsom tab af hår, pigmentering, dermale kamme, og graft volumen. I disse tilfælde vises en afvist graft skinnende, hvid, og hårløse, med ujævne kanter (figur 2F) 14.
Ved hjælp af denne model af hudtransplantation, undersøgte vi en hidtil ukendt fremgangsmåde målretning T-celle metabolisme at forhindre transplantatafstødning 15. Det er velkendt, at metaboliske signalveje spiller kritiske roller i diktere resultaterne af T-celle responser 16. Naive T-celler er afhængige af mitokondriel oxidativ phosphorylering til at generere den nødvendige energi til grundlæggende immunovervågning. Imidlertid,efter aktivering, effektor T-celler metabolisk omprogrammere til aerob glykolyse og udviser forøget glutamin metabolisme 16,17. Brug Balb / c som donorer og C57BL / 6 som modtagere, vi observeret, at hæmme glykolyse og oxidativ phosphorylering (2DG + metformin) eller glutamin stofskifte alene (DON) langvarig hudkontakt graftoverlevelse, men blokerer de tre veje samtidigt resulterede i signifikant-forøget graft overlevelse (figur 3C). Desuden tredobbelt metabolisk terapi var mere effektiv end konventionelle cyclosporin eller rapamycin (figur 3A og B). Permanent accept blev ikke nået, og yderligere strategier, herunder udtynding terapi, costimuleringsblokade eller nyere metaboliske behandlinger, kan fremme en bedre induktion af transplantation tolerance. Men den undersøgelse, to hidtil ukendte indsigter: brugen af ikke-specifikke inhibitorer til at målrette selektive immunceller med øget metabolisk krav samt kravet t o blokere de tre metaboliske veje samtidigt at opnå mere robust immunosuppression i transplantatafstødning.
Calcineurinhæmmere og mammalian target of rapamycin (mTOR) hæmmere udgør det meste af det konventionelle immunosuppressiv behandling anvendes i klinisk transplantation. Median transplantatoverlevelse satser af Balb / c for at C57BL / 6 hudtransplantater behandlet med cyclosporin og rapamycin var 17 og 16 dage henholdsvis. Til sammenligning modtagere behandlet med metaboliske inhibitorer, der inhiberer T-celle-glycolyse, mitokondriel oxidativ phosphorylering og glutamin metabolisme havde forlænget overlevelse: Medianen transplantatoverlevelse var 29 dage. Endvidere histologi hudtransplantater fra den metaboliske terapi udviste mere intakt væv tilpasning og mindre lymfocytisk inflammatorisk infiltrat (figur 4).
105 / 55105fig1.jpg "/>
Figur 1: tildækning af Graft med forbinding. (A) hudtransplantat placeret på højre stammen. (B) Bandage fremstillet med en foldet gaze og to plaststrimler bandager. (C) Modtager mus placeret på gaze. (DF) Bandage viklet omkring musen. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Hud Graft Udseende under akut og kronisk afstødning. (A) Balb / c til C57BL / 6 (komplet mismatch) i fuld tykkelse hudtransplantation uden tegn på afstødning (dag 8). (B) Balb / c til C57BL / 6 i fuld tykkelse hudtransplantation med 50% transplantatafvisning (dag 13). (C) Balb / c for C57BL / 6 i fuld tykkelse hudtransplantation med komplet transplantatafvisning (dag 18). (D) Syngene transplantation fuld-tykkelse hud (dag 8). (E) Syngene fuld tykkelse hudtransplantation (dag 30). (F) C57BL / 10 til C57BL / 6 (mindre mismatch) fuld-tykkelse hud transplantation med kronisk afstødning (dag 100). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Balb / C til C57BL / 6 Hudtransplantatoverlevelse. (A) Behandling med cyclosporin (25 mg / kg QD). (B) Behandling med rapamycin (3 mg / kg QD). (C) Behandling med metaboliske inhibitorer, 2-deoxy-D-glucose (2DG) 500mg / kg QD, metformin 150 mg / kg QD, og 6-diazo-5-oxo-L-norleucin (DON) 1,6 mg / kg QOD. Alle behandlinger administreredes fra dagen for transplantation indtil afstødning. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Hematoxylin og Eosin Stain (højre, X100, venstre, X200) af hudtransplantationer med Metabolic Therapy på Postoperativ Dag 7. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Siden introduktionen af Medawar, først i humane undersøgelser og derefter i kaniner og mus, har hudtransplantation været en uvurderlig model for studiet af allogene immunresponser 6,7. I dette manuskript, præsenterer vi en model af store, ikke-vaskulariseret, fuld tykkelse hudtransplantation hjælp af øvre og nedre ryg hud. Forskellige alternative metoder, herunder anvendelse af halen hud eller øre huden på musen som vævskilden graft, er blevet rapporteret til dato 8,9. Disse modeller præsentere den klare fordel, teknisk enkelhed og tillader store mængder gennemløb. Den relative mangel på epidermale Langerhanske celler og dermale dendritiske celler i halen hudtransplantater, fører imidlertid til forsinket afstødning samt lettet transplantataccept af værten, især i mindre MHC mismatch modeller 10,11. Derfor er fuld tykkelse trunk hudtransplantation betragtes som en mere robust model og mere egnet til at studere T-celle-mediaTed akut afstødning 12.
Desuden er vores model anvender enkle teknikker og kræver ikke avancerede mikrokirurgiske færdigheder. Driftstiden er kort (~ 10 min per mus fra starten af anæstesi til afslutningen af proceduren), og den postoperative morbiditet og mortalitet er ubetydelig. Den overordnede konklusion dødelighed (død inden 24 timer efter kirurgi plus død før fjernelse af bandagen) er blevet rapporteret at være 3,8% 13. De fleste af de komplikationer skyldes anæstesi overdosis eller overdrevent restriktive bandager, som let kan forhindres ved nøje overvågning af respiratoriske funktion i den umiddelbare postoperative periode og ved hurtigt at fjerne bandagen på de tidligste tegn på åndedrætsbesvær 6,17.
Den mest kritiske faktor i processen med transplantation er revaskularisering af transplantatet væv ved indvækst af værten fartøjer til transplantatet 6. Den høstede hud krævers omhyggelig forberedelse, og dissektion af panniculus carnosus er et afgørende skridt. Vi foretrækker at fjerne panniculus carnosus under et mikroskop. Det anbefales at starte dissektion fra en af kanterne og fremme langsomt ved at skubbe muskler og adskille det fra huden med bladet på en buet tenotomy vinklet lidt. Stedet for transplantatet seng skal være langt fra led og rygsøjlen. Før indsnit i recipienten mus, bør skulderen og hoften flyttes at visualisere hudfolder der hjælper til at afgrænse omfanget af leddene. Når du fjerner modtageren hud, er det vigtigt at undgå at beskadige de blodkar, der kører overfladisk til panniculus carnosus. Hvis der opstår blødning, anvende lokal komprimering og fjerne blod og blodpropper, der kan forstyrre transplantation. Endelig bør bandage ikke forårsage åndedrætsbesvær, at kompromis opsving, selv om det skal være tilstrækkeligt constrictive at forhindre forskydning af transplantatet og auto-mutilation under processen med revaskularisering. Plastic Strips Band-aids er tilhænger og stærk nok til dette formål. Vi kombinerer to bandager til helt wrap musen taljen og tillade anbringelse af en foldet gaze mellem bandagen og transplantatet (figur 1). Bandagen fjernes ved at skære den ventrale side af det, og resten fjernes af dyret, for at undgå at forstyrre transplantatet under forsøget på at fjerne bandagen manuelt.
Sammenfattende fuld tykkelse hudtransplantation er en veletableret model med rigelige referencer i litteraturen. Proceduren er let at udføre, driftstiden er kort, og de postoperative komplikationer er begrænsede. De kritiske trin vedrører omhyggelig donorhud høst og den korrekte placering af modtageren bandage. Fremtidige undersøgelser med biomaterialer, der fremmer angiogenese og væv reparation kan yderligere forbedre succesraten af proceduren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev finansieret af NIH tilskud R01AI077610.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Straight micro forceps | Sigma | F4017 | |
| Curved micro forceps | Aesculap | BD333R | |
| Curved Stevens tenotomy scissors | Aesculap | BC905R | |
| Mayo dissecting scissors | Sigma | S3146 | |
| Micro needle holder | Aesculap | BM563R | |
| Sterile gauze | Covidien | 441218 | |
| 6-0 Nylon suture | MWI | 31849 | |
| Plastic Strips Band-Aid | Johnson & Johnson | Obtained from pharmacy | |
| 10 cm Petri dish | Fisherbrand | FB0875712 | |
| PBS | Quality Biological | 119069131 | |
| Buprenorphine | DEA Number required; Obtained from hospital pharmacy | ||
| Enrofloxacin | Bayer Health Care | 186599 |
References
- Furtmuller, G. J., et al. Orthotopic Hind Limb Transplantation in the Mouse. J Vis Exp. , (2016).
- Oh, B., et al. A Novel Microsurgical Model for Heterotopic, En Bloc Chest Wall, Thymus, and Heart Transplantation in Mice. J Vis Exp. , (2016).
- Oberhuber, R., et al. Murine cervical heart transplantation model using a modified cuff technique. J Vis Exp. , e50753 (2014).
- Jones, T. R., Shirasugi, N., Adams, A. B., Pearson, T. C., Larsen, C. P. Intravital microscopy identifies selectins that regulate T cell traffic into allografts. J Clin Invest. 112, 1714-1723 (2003).
- Celli, S., Albert, M. L., Bousso, P. Visualizing the innate and adaptive immune responses underlying allograft rejection by two-photon microscopy. Nat Med. 17, 744-749 (2011).
- Medawar, P. B. The behaviour and fate of skin autografts and skin homografts in rabbits: A report to the War Wounds Committee of the Medical Research Council. J Anat. 78, 176-199 (1944).
- Billingham, R. E., Brent, L., Medawar, P. B., Sparrow, E. M. Quantitative studies on tissue transplantation immunity. I. The survival times of skin homografts exchanged between members of different inbred strains of mice. Proc R Soc Lond B Biol Sci. 143, 43-58 (1954).
- Garrod, K. R., Cahalan, M. D.
- Schmaler, M., Broggi, M. A., Rossi, S. W. Transplantation of tail skin to study allogeneic CD4 T cell responses in mice. J Vis Exp. , e51724 (2014).
- Bergstresser, P. R., Toews, G. B., Gilliam, J. N., Streilein, J. W. Unusual numbers and distribution of Langerhans cells in skin with unique immunologic properties. J Invest Dermatol. 74, 312-314 (1980).
- Chen, H. D., Silvers, W. K. Influence of Langerhans cells on the survival of H-Y incompatible skin grafts in rats. J Invest Dermatol. 81, 20-23 (1983).
- Chong, A. S., Alegre, M. L., Miller, M. L., Fairchild, R. L. Lessons and limits of mouse models. Cold Spring Harb Perspect Med. 3, a015495 (2013).
- Mayumi, H., Nomoto, K., Good, R. A. A surgical technique for experimental free skin grafting in mice. Jpn J Surg. 18, 548-557 (1988).
- McFarland, H. I., Rosenberg, A. S.
- Lee, C. F., et al. Preventing Allograft Rejection by Targeting Immune Metabolism. Cell reports. 13, 760-770 (2015).
- Pollizzi, K. N., Powell, J. D. Integrating canonical and metabolic signalling programmes in the regulation of T cell responses. Nat Rev Immunol. 14, 435-446 (2014).
- Pearce, E. L., Poffenberger, M. C., Chang, C. H., Jones, R. G. Fueling immunity: insights into metabolism and lymphocyte function. Science. 342, 1242454 (2013).
