इस प्रोटोकॉल ट्रांसजेनिक सेल विशिष्ट फ्लोरोसेंट मार्करों व्यक्त चूहों के intravital इमेजिंग का वर्णन । Intravital इमेजिंग प्रक्रियाओं के सूक्ष्म दृश्य संभव है जो प्रत्यारोपित खिड़कियों का उपयोग कर जानवरों के रहने में उच्च संकल्प टिप्पणियों के लिए एक गैर इनवेसिव विधि प्रदान करता है । इस विधि अनुदैर्ध्य प्रक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए विशेष रूप से उपयोगी है ।
ट्यूमर और ट्यूमर पोत विकास, साथ ही चिकित्सीय चिकित्सा के लिए ट्यूमर प्रतिक्रिया, अत्यधिक गतिशील जैविक प्रक्रिया कर रहे हैं । प्रोटोकॉल स्थिर जानकारी प्रदान करता है और अक्सर एक सही व्याख्या के लिए पर्याप्त नहीं है । Intravital मूल्यांकन, जिसमें एक प्रक्रिया के समय में पालन किया जाता है, अतिरिक्त और अक्सर अप्रत्याशित जानकारी प्रदान करता है । सेल विशिष्ट मार्करों और लाइव सेल अनुरेखकों, इमेजिंग उपकरणों के लिए सुधार, और कई इमेजिंग मंडलों के विकास, intravital माइक्रोस्कोपी बेहतर समझने के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण बन गया है व्यक्त ट्रांसजेनिक जानवरों के निर्माण के साथ जैविक प्रक्रियाओं । इस कागज ट्यूमर पोत विकास की जांच के लिए एक प्रायोगिक डिजाइन का वर्णन और उपचारात्मक प्रभाव के एक स्थानिक और लौकिक तरीके से । इस सेटअप का उपयोग करना, पोत विकास के चरण, टिप सेल और लुमेन गठन, रक्त प्रवाह, extravasation, एक की स्थापना की संवहनी बिस्तर, और संवहनी विनाश कल्पना और पीछा किया जा सकता है । इसके अलावा, चिकित्सीय प्रभाव, intratumoral भाग्य, और कीमोथेरेपी यौगिकों के स्थानीयकरण भी पीछा किया जा सकता है ।
जबकि इन विट्रो में अध्ययन प्रक्रियाओं के उच्च संकल्प काइनेटिक इमेजिंग सक्षम करें, इन विट्रो प्रयोग उचित संदर्भ में मूल्यांकन सक्षम नहीं है । उदाहरण के लिए, एक ट्यूमर के अंदर stromal डिब्बों या दवा वितरण और वितरण के साथ ट्यूमर कोशिकाओं की बातचीत एक संस्कृति की थाली में अध्ययन नहीं किया जा सकता है । पशु मॉडल इसलिए मानव शरीर क्रिया विज्ञान और विकृति की नकल करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं । हालांकि, प्रक्रियाओं की अनुदैर्ध्य इमेजिंग, विशेष रूप से एक सेलुलर संकल्प पर, चुनौतीपूर्ण है । आणविक इमेजिंग तरीकों, जैसे चुंबकीय अनुनाद इमेजिंग (एमआरआई), एकल फोटॉन उत्सर्जन गणना टोमोग्राफी (SPECT), और पोजीट्रान उत्सर्जन टोमोग्राफी (पीईटी), अच्छी पैठ गहराई है, लेकिन अभाव संकल्प या संरचनात्मक संरचनाओं वर्णन करने के लिए असफल । ऑप्टिकल इमेजिंग उच्च संकल्प प्रदान करता है और संरचनाओं के इमेजिंग सक्षम बनाता है, लेकिन यह ंयूनतम प्रवेश के लिए गरीब के साथ है1। इस तरह के एक पृष्ठीय skinfold या उदर खिड़की के रूप में खिड़की चैंबर प्रौद्योगिकियों के साथ संयोजन में intravital माइक्रोस्कोपी के आवेदन, vivo2,3,4 मेंउच्च संकल्प इमेजिंग के लिए अनुमति देता है. यह तकनीक विशिष्ट लाभ है, के रूप में यह घंटे और भी दिन पर अनुदैर्ध्य इमेजिंग के लिए अनुमति देता है, उचित संदर्भ में प्रक्रियाओं की इमेजिंग के लिए (जैसे, कक्ष-छवि ऊतक में सेल बातचीत), और प्रस्तावों के लिए ऑप्टिकल सीमा पर उंनत फोकल और multiphoton सूक्ष्मदर्शी ।
सेल के साथ ट्रांसजेनिक जानवरों की शुरूआत-या प्रोटीन विशेष फ्लोरोसेंट लेबल vivo में और पूर्व vivo प्रयोगों के लिए संभावनाओं के ढेर सारे खोलता है । उदाहरण के लिए, सेल सेल बातचीत, प्रोटीन के उत्पादन, और हेरफेर या चिकित्सा के लिए प्रतिक्रिया इन मॉडलों का उपयोग vivo में अध्ययन किया जा सकता है5,6,7,8। महत्वपूर्ण बात, स्थान और समय में स्थिति उचित इमेजिंग उपकरण और पद्धति के साथ निर्धारित किया जा सकता है । यहां, एक संशोधित पृष्ठीय skinfold खिड़की चैंबर में प्रत्यारोपित ट्यूमर में इंजेक्शन एजेंटों के साथ संयोजन में एक endothelial मार्कर व्यक्त पशुओं की intravital माइक्रोस्कोपी प्रस्तुत की है ।
ट्यूमर और ट्यूमर पोत विकास के रूप में के रूप में अच्छी तरह से ट्यूमर उपचारात्मक प्रभाव, अत्यधिक गतिशील प्रक्रियाओं हैं, intravital मूल्यांकन एक समय में इन प्रक्रियाओं का सही आकलन करने के लिए एक सुरुचिपूर्ण उपकरण है और स्थानिक-निर्भर तरीके से । लाइव सेल मार्कर की बढ़ती उपलब्धता के साथ, ट्रांसजेनिक जानवरों के निर्माण, और इमेजिंग मोडलों की उन्नति, intravital इमेजिंग अधिक से अधिक लोकप्रिय होता जा रहा है । हालांकि प्रोटोकॉल अभी भी नियमित रूप से इस्तेमाल किया जाता है, और मार्करों की एक भीड़ कोशिकाओं और संरचनाओं की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता, गतिशील प्रक्रियाओं की जांच करते समय ऊतक अनुभाग नुकसान है । ऊतक विच्छेदन की आवश्यकता है, केवल स्थिर जानकारी प्रदान; निर्धारण ऊतक की गुणवत्ता को प्रभावित करता है; और हर्जाना सेलुलर बातचीत टुकड़ा करने की क्रिया । इसके अलावा, जब गतिशील प्रक्रियाओं की जांच, अलग पर ऊतक विच्छेदन, और अक्सर माना, समय अंक जानवरों की एक बड़ी मात्रा की आवश्यकता है । intravital इमेजिंग के साथ, XYZ स्थानिक आयामों और समय के अतिरिक्त आयाम एक ही जानवर में मूल्यांकन किया जा सकता है, अंतरिक्ष और समय में संभव विभिन्न खिलाड़ियों की उचित स्थिति बना रही है । इसलिए, इष्टतम समय अंक याद नहीं हैं, और प्रयोग प्रति जानवर संख्या काफी कम है । दूसरा, intravital मूल्यांकन के साथ स्थापित समय खिड़की ऊतक निष्कर्षण का अनुकूलन करने के लिए extrapolated जा सकता है । तीसरा, पोत विकास के वांछित चरण intravitally की पहचान की जा सकती है और एक पूरे माउंट ऊतक के रूप में दाग ।
इस पांडुलिपि में वर्णित intravital डिजाइन endothelial कोशिकाओं, एक संशोधित पृष्ठीय skinfold कक्ष मॉडल, और एक समर्पित multiphoton-फोकल माइक्रोस्कोप में एक फ्लोरोसेंट लेबल व्यक्त ट्रांसजेनिक जानवरों का एक संयोजन का उपयोग करता है ।
Endothelial कोशिकाओं angiogenesis के दौरान21चरणों,22 के एक नंबर के माध्यम से जाना है, और इन चरणों अक्सर एक ट्यूमर में एक साथ देखा जा सकता है. eNOSTag-GFP माउस लाइन का प्रयोग, व्यक्तिगत endothelial कोशिकाओं का पालन किया जा सकता है, और यहां तक कि filopodia गतिशीलता का पता लगाया जा सकता है । इसलिए यह पोत विकास intravitally का अध्ययन करने के लिए एक अच्छा मॉडल है । पहले से मौजूद आंतरिक लेबल पर निर्भर करता है, इंजेक्शन फ्लोरोसेंट एजेंटों लुमेन गठन, रक्त प्रवाह, extravasation, और रक्त निकासी का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । माउस के लिए लगातार imaged है अप करने के लिए 5 ज । एक जानवर के दीर्घकालिक मूल्यांकन संभव है जब पशु के संज्ञाहरण के बारे में कई सावधानियों लिया जाता है, जो पहले से ही वर्णित किया गया है23। के रूप में इस शोध कैंसर पर ध्यान केंद्रित है, ट्यूमर ऊतक या कोशिकाओं प्रत्यारोपित किया गया । हालांकि, हम भी metatarsals और भ्रूण फेफड़ों के साथ प्रयोग । हालांकि, अध्ययन के तहत ऊतक की वृद्धि दर सीमित है, के रूप में कुछ हफ़्ते के बाद, त्वचा को फिर से विकसित करने के लिए शुरू होता है, जो धीमी गति से बढ़ ट्यूमर या ऊतकों के साथ एक समस्या हो सकती है.
मांयता चरण के दौरान, पृष्ठीय skinfold खिड़की चैंबर काफी शास्त्रीय मॉडल4की तुलना में संशोधित किया गया था । फ्रेम autoclavable सिंथेटिक सामग्री का निर्माण कर रहे है और प्रकाश और छोटे हैं, एक बड़ी खिड़की से देखने के क्षेत्र के साथ । बनाए रखने की अंगूठी के हुक (चित्रा 1Bg, सफेद ऐरोहेड) केवल अंगूठी के आसान हटाने के लिए प्रयोग किया जाता है । हुक के बिना बनाए रखने के छल्ले इस्तेमाल किया जा सकता है जब इन इमेजिंग के साथ हस्तक्षेप । त्वचा बहुत ज्यादा फैला नहीं है, ढीला इस मॉडल में नहीं होती है, और संक्रमण केवल शायद ही कभी देखा जाता है । इन संशोधनों जानवर असुविधा को कम करने और पशु प्रक्रिया काफी परिष्कृत । इसके अलावा, धातु भागों को आसानी से हटाया जा सकता है जब इमेजिंग एमआरआई24का उपयोग कर ट्यूमर ।
किसी भी खुर्दबीन intravitally छवि पृष्ठीय skinfold कक्षों को अपनाया जा सकता है । मुख्य आवश्यकता माइक्रोस्कोप स्टेज और उद्देश्य लेंस के बीच उपलब्ध जगह है । एक महत्वपूर्ण पहलू है कि इमेजिंग को प्रभावित करता है गति है । गति कलाकृतियों को रोकने के लिए, एक मंच है कि खुर्दबीन टेबल में फिट बैठता है (सभी आवेषण के हटाने के बाद) और माउस का समर्थन करता है इस्तेमाल किया जाना चाहिए । यह संज्ञाहरण के तहत है जब माउस को नियंत्रित करने के लिए आवश्यक नहीं है, और यह माउस सांस स्वतंत्र रूप से जाने के लिए बेहतर है । हालांकि, खिड़की के मंच पर बोल्ट, देखने के क्षेत्र (यानी, ट्यूमर खिड़की चैंबर के माध्यम से दिखाई है) के इष्टतम निर्धारण दे रही है । मंच एक इलेक्ट्रॉनिक हीटिंग पैड का उपयोग कर गर्म है, के रूप में पशु हीटिंग के लिए इस्तेमाल किया । इस मंच में घर बनाया गया था, और विशेष अनुरोध पर प्राप्त किया जा सकता है । एक उच्च संकल्प उद्देश्य लेंस जब intracellular प्रक्रियाओं का मूल्यांकन और यह कोशिका और नाभिक के बीच भेदभाव करने के लिए संभव बनाता है एक आवश्यकता है । एक अच्छा ऑप्टिकल संकल्प के साथ एक पतला लेंस का उपयोग करें (उच्च एनए) लेकिन एक अपेक्षाकृत लंबे काम दूरी (अधिमानतः 2 मिमी या ऊपर) की सिफारिश की है । इमेजिंग में सीमा प्रवेश गहराई और लेबल की फ्लोरोसेंट तीव्रता है । इसके अलावा, photobleaching, phototoxicity, और संतृप्ति इमेजिंग के दौरान से बचा जाना चाहिए ।
यहां, एक एकीकृत फोकल-multiphoton और एक फोकल माइक्रोस्कोप का इस्तेमाल किया गया । multiphoton ईमानदार है, जबकि फोकल एक उल्टे माइक्रोस्कोप है । एक ईमानदार माइक्रोस्कोप का लाभ पानी विसर्जन लेंस का आसान उपयोग है । ये लेंस एक उच्च एनए और एक लंबी काम की दूरी पर है, यहां तक कि एक उच्च पर (उदा, 20 या 40X) आवर्धन । विशेष रूप से, यह एक 20X NA १.० जल विसर्जन लेंस, जो कई कंपनियों द्वारा बेचा जाता है प्राप्त करने के लिए सिफारिश की है । ध्यान रखें कि, जब विसर्जन लेंस का उपयोग किया जाता है, उद्देश्य लेंस और विसर्जन द्रव ३७ ° c करने के लिए गरम किया जा करने की आवश्यकता है । सबसे अच्छा चित्र के लिए, यह इष्टतम फोकल सेटिंग्स का उपयोग करने की सिफारिश की है (यानी, 1 हवादार इकाई पर pinhole, संभव के रूप में कम के रूप में लेजर शक्ति, लाभ भी उच्च नहीं (विशेष रूप से अगर लाभ शोर का परिचय), अधिकतम लाइन गति, और स्कैन का कोई औसत). जोखिम, संतृप्ति, और अंतर में छवियों के बीच तनाव डेटा की गुणवत्ता समझौता । यह संतृप्ति और जोखिम को रोकने के लिए सिफारिश की है । यह अलग लाभ सेटिंग्स पर छवियों को प्राप्त करने से दरकिनार किया जा सकता है । लाभ बदलने छवि चमक को बदलने के लिए सबसे आसान तरीका है । अगर जरूरत पड़ी तो लेजर पावर को एडजस्ट किया जा सकता है । छवि गुणवत्ता का मानकीकरण करने के लिए, एक निश्चित प्रतिदीप्ति तीव्रता के साथ स्लाइड इस्तेमाल किया जा सकता है । एक ध्यान में रखना है कि जब भी सूक्ष्मदर्शी बेहतर सेट है, छवि गुणवत्ता विंडो चैंबर और ऊतक की गुणवत्ता के द्वारा एक काफी हद तक निर्धारित किया जाता है चाहिए
जब एक साथ कई फ्लोरोसेंट मार्करों स्कैनिंग, खून के माध्यम से, जिसमें एक fluorophore एक दूसरे के चैनल में पाया जाता है, से बचा जाना चाहिए । कम अतिव्यापी स्पेक्ट्रा और फ्रेम के बीच अनुक्रमिक स्कैनिंग के साथ fluorophores का एक संयोजन का उपयोग करके खून से बचें । यहां प्रस्तुत चित्र 3 अनुक्रमिक स्कैन का उपयोग कर स्कैन किया गया (1 ट्रैक: GFP, किया था या ४८८ और ६३३ लेजर के साथ fluor647; ट्रैक 2: rhodamine, Doxil, या ५४३ लेजर के साथ mTomato; और ट्रैक 3: Hoechst के साथ ४०५ लेजर) ।
ट्यूमर पोत विकास के कई चरणों के मूल्यांकन की संभावना, टिप सेल गतिशीलता, लुमेन गठन, extravasation, और संवहनी क्षति यहाँ दिखाया गया है । eNOStag-GFP लाइन, एक नष्ट संवहनी बिस्तर के साथ ट्यूमर क्षेत्रों का उपयोग आसानी से दानेदार सेलुलर अवशेष अभी भी GFP व्यक्त द्वारा पता चला रहे हैं । इन क्षेत्रों में कोई इंजेक्शन एजेंट नहीं पाया गया, जो प्रवाह की कमी को दर्शाता है । इसका मतलब यह है कि प्रशासित कीमोथेरेपी एजेंटों इन क्षेत्रों या तो नहीं पहुंच जाएगा । हालांकि, पोत विनाश भी एक चिकित्सीय परिणाम हो सकता है । ट्यूमर के पूर्व मूल्यांकन, पूर्व उपचार पोत विनाश के लिए जांच करने के लिए, सटीक चिकित्सकीय मूल्यांकन के लिए एक शर्त है और आसानी से इस प्रयोगात्मक डिजाइन का उपयोग किया जा सकता है ।
इसमें ढेर सारी संभावनाएं हैं जिनके लिए intravital माइक्रोस्कोपी का इस्तेमाल किया जा सकता है, और विस्तृत चर्चा इस प्रकाशन के दायरे से बाहर है । एक संक्षिप्त अंतर्दृष्टि देने के लिए, संभव अनुप्रयोगों के ट्यूमर के ऊतकों में chemotherapeutics के संचय पर अध्ययन शामिल हैं, जहाजों के विकास (जैसे, जहाजों, शाखाओं, और चौराहों की संख्या) और रक्त प्रवाह, सेल सेल बातचीत, सेल लक्ष्यीकरण, और intracellular प्रसंस्करण, और साथ ही उदाहरण के ऊपर उल्लेख किया और यहां दिखाया गया है । के रूप में विश्लेषण प्रतिदीप्ति पर आधारित है, खिड़की या ऊतक की गुणवत्ता के कारण तीव्रता उतार चढ़ाव के बारे में पता है । इसके अलावा, के रूप में ट्यूमर ऊतक अपेक्षाकृत मोटी है, ऊपर या देखने के विमान के नीचे से प्रतिदीप्ति छवि में संकेत पर एक प्रभाव है । यह उद्देश्य माप के साथ मात्रात्मक छवि विश्लेषण गठबंधन करने के लिए सबसे अच्छा है । उदाहरण के लिए, यदि दवा सांद्रता में रुचि, intravital माइक्रोस्कोपी के बाद खिड़की से ट्यूमर ऊतक निकालने के लिए और HPLC के साथ का उपयोग कर दवा सामग्री का निर्धारण करने के लिए फोकल छवियों के साथ तुलना.
ट्यूमर प्रतिक्रिया के मूल्यांकन के रूप में अच्छी तरह से इस मॉडल का उपयोग किया जा सकता है, लेकिन कुछ सावधानियों के साथ. एक एहसास होना चाहिए कि ट्यूमर भी आवक बढ़ती है, त्वचा में । 3 डी माप किया जा सकता है अगर प्रवेश काफी गहरा पूरे ट्यूमर को कवर है । ऐसी स्थिति में अब तक लाल रंगों का प्रयोग करना चाहिए । विंडो चैंबर के रूप में यहां वर्णित एक त्वचा के वातावरण में ट्यूमर के साथ सौदों, और यह कहना है कि खिड़की एक तापमान सामांय माउस शरीर के तापमान से थोड़ा कम रखता है महत्वपूर्ण है । इसलिए, यह सही माइक्रो पर्यावरण की स्थापना के लिए पृष्ठीय skinfold खिड़की चैंबर के साथ intravital अध्ययन की पुष्टि में ट्यूमर का अध्ययन करने के लिए सबसे अच्छा है । महत्वपूर्ण बात, पृष्ठीय skinfold चैंबर प्रक्रियाओं और तंत्र के कैनेटीक्स में अंतर्दृष्टि प्रदान करता है, चिकित्सा के सुधार के लिए एक वाद्य आधार प्रदान । साथ ही, अधिक वितरण और फार्माकोकाइनेटिक्स पर अतिरिक्त जानकारी प्राप्त की जा सकती है । शास्त्रीय रूप से, इन वितरण अध्ययनों ट्यूमर असर जानवरों और विदारक ट्यूमर के इलाज के द्वारा प्रदर्शन कर रहे है के लिए दवा को मापने के लिए अंगों/। इस intravital मॉडल का प्रयोग करते हुए किसी औषध का intratumoral स्थान (अर्थात, intravascular, intratumoral, intracellular या नाभिकीय)५,२५,२६प्रदान किया जा सकता है. न केवल दवा का स्थान पता चला है, लेकिन यह भी समय खिड़की के सबसे इष्टतम लेने के लिए अवसर ।
इस लेख में वर्णित प्रयोगात्मक डिजाइन का प्रयोग, मानकों की एक विस्तृत श्रृंखला एक लौकिक और स्थानिक सेटिंग में मूल्यांकन किया जा सकता है । विशेष रूप से, यहां हम बताते है कि intravital माइक्रोस्कोपी ट्यूमर पोत विकास और चिकित्सीय प्रतिक्रिया की गतिशीलता में महत्वपूर्ण अंतर्दृष्टि प्रदान करता है ।
The authors have nothing to disclose.
हम उनके विकास और eNOSTag के दान के लिए रीें वान Haperen और रिणी de Crom का शुक्रिया अदा करना चाहूंगा-GFP लाइन, पशु काम के साथ उनकी तकनीकी सहायता के लिए Joost एपी Rens, और उनकी मदद के लिए पशु कार्यवाहियों । इस्तेमाल की जाने वाली माइक्रोस्कोपिक सुविधाएं इरास्मस ऑप्टिकल इमेजिंग सेंटर का हिस्सा हैं, और हम उनकी सेवा के लिए ओआईसी के कर्मचारियों को धन्यवाद देना चाहते हैं । इस अध्ययन के डच कैंसर सोसायटी से अनुदान DDHK 2000-2224 द्वारा समर्थित किया गया था, “Vereniging Trustfonds” इरास्मस विश्वविद्यालय रॉटरडैम, और “Stichting इरास्मस Heelkundig Kankeronderzoek,” और हम उनके उदार दान के लिए समितियों के सदस्यों को धंयवाद ।
DMEM | Sigma | D1145 | Supplemented with 10% FCS |
Trypsin-versene (EDTA) | Lonza | BE17-161E | Make a 0.1% solution in PBS, sterile |
PBS | |||
Window frames | Costum made | ||
Filler glass 10 mm, 0.55 mm | Abrisia technologies | ||
Cover glass 12mm, #1 thickness | Thermo Scientific/VWR | 631-0713 | |
Hear removal gel (veet) | for sensitive skin | ||
Eye ointment | |||
Buprenorfine hydrochloride | use 0.05 mg/kg | ||
Anesthesia unit | O2/Isoflurane inhalation unit with an chamber and tubeing+cone | ||
insulin syringe 0.5ml x 12.7mm 29g, green | BD | 324824 | |
Needles 23G 1 1/4" | Braun | 4657640 | |
Needles 25G 5/8" | Braun | 4657853 | |
Sutures silkan 0.7 | Braun | 1134019 | |
Nuts | Jeveka | 934 A2 1 | |
Bolts | Jeveka | 84 A2 1 10 | |
0.9% NaCl | |||
Microscope + software | The space between table and objective need to be wide enough to hold the animal | ||
Heated temperature controlled platform | Costum made | ||
Window holder | Costum made | ||
tetramethylrhodamine 2,000,000 MW dextran | Invitrogen | D7139 | 100 µg/mouse |
Alexa-fluor 647 10,000 MW dextran | Invitrogen | D22914 | 100 µg/mouse |
Hoechst 33342 | Invitrogen | H1399 | 25 µg/mouse |
Pegulated nanoparticles | ref 5 | ||
LEICA TCS SP5 Multiphoton Microscope | Leica | ||
LAS AF Software | Leica |