Summary
このプロトコルは細胞特異的蛍光マーカーを発現するトランスジェニック マウスの生体イメージングを説明します。生体イメージングは、プロセスの顕微可視化が可能な埋込型の windows を使用して生きている動物の高解像度観測の非侵襲的な方法を提供します。このメソッドは、特に縦方向プロセスの研究に有用です。
Abstract
腫瘍および腫瘍容器開発、腫瘍に対する治療は、非常にダイナミックな生物学的プロセスです。組織では、静的な情報提供し、正しい解釈のために十分ではない多くの場合。生体評価、プロセス、時間、続いては、余分なと多くの場合予期しない情報を提供します。いくつかの画像処理室の開発映像装置への改善と生細胞トレーサー細胞特異的マーカーを表現するトランスジェニック動物の作成、生体顕微鏡をよりよく理解する重要なツールとなっています。生物学的プロセス。時空的に腫瘍血管の開発と治療効果の調査のための実験計画について述べる.このセットアップを使用して、容器開発、先端の細胞と内腔形成、血流、血管外漏出、確立された血管床、血管破壊の段階することができます可視化し、続きます。さらに、治療効果、腫瘍の運命、そして劑のローカライズも行われます。
Introduction
生体外で研究プロセスの高分解能運動イメージングを使用すると、生体外で実験は適切なコンテキストで評価を許可されません。例えば、培養プレートで管間質コンパートメントまたは薬剤配達および腫瘍内の分布と腫瘍細胞の相互作用を検討することはできません。動物モデルは人間生理学および病理学を模倣するため。ただし、プロセス、特に細胞内の解像度の縦画像です挑戦。分子イメージング法、磁気共鳴画像 (MRI) など単一光子放射または計算された断層レントゲン写真撮影 (SPECT)、陽電子放出断層レントゲン写真撮影 (ペット)、解像度不足が良い浸透深さがある解剖学的構造を説明するために失敗します。高解像度を提供し、構造のイメージングを可能に光イメージングが、最小限の浸透1に貧しい人々 を伴っています。アプリケーション ウィンドウとの組み合わせで生体顕微鏡の皮脂、背などの技術の部屋または腹部のウィンドウは、高解像度イメージング、生体2,3,4。この技術は、(例えば細胞間相互作用イメージのティッシュで)、適切なコンテキストでプロセスの画像、解像度の光学的限界で時間と数日、上縦画像のこと明確な利点高度な共焦点と多光子顕微鏡。
細胞やタンパク質特異蛍光ラベルとトランスジェニック動物の導入は、体内と体外の実験のための可能性の茄多を開きます。インスタンス、細胞間相互作用、蛋白質の生産および操作または療法への応答を検討することができるため体内のこれらを使用してモデル5,6,7,8.重要なは、配置場所と時間を適切なイメージ投射装置および方法論を決定ことができます。ここでは、生体顕微鏡変更されるの移植腫瘍における注射剤との組み合わせで内皮マーカーを表現する動物の背側皮下脂肪ウィンドウ商工会議所が発表します。
Protocol
すべての動物実験は、オランダの法律に従って行われ、プロトコルは、エラスムス MC, ロッテルダム, オランダの動物実験委員会によって承認されました。
1. 受信者のマウス
- トランスジェニック マウスの生まれたとき、画面の標準的な手順9を使用して適切な遺伝子型の動物。
注意: 本稿では、自社開発 eNOStag GFP ライン9と購入したローザ mTmG (株 007676)10行から取得したデータが掲載されています。 - 12 週間以上経った、20 グラム以上、マウスを使用します。
2. ドナー マウス
注意: 背の] ウィンドウで注入の腫瘍片は非組み換えドナー動物から取得されます。腫瘍の種類に応じて (同系腫瘍) を標準または免疫不全 (異種) マウスを使用します。
- 37 ° C、5% CO2で培養フラスコで適切なサプリメントと媒体で腫瘍細胞を成長します。
- セル フラスコからメディアを取り出して、1 × PBS で 1 回洗浄し、0.25% トリプシンを使用してセルをデタッチします。
- 細胞培養液を追加してトリプシンを不活化します。細胞を収集、スピン ・ ダウン 5 分 1,200 x g で 5 mL の PBS でペレットを再懸濁します。
- トリパン ブルーの 20 μ L で死んだ細胞を汚すセル中断の 20 μ L を希釈します。診断; 生活と死んでいるセルの数をカウントします。死んだ細胞の数 10% を超えてはなりません。
- 5 分 1,200 x g でもう一度セルのスピンし氷冷 PBS で細胞ペレットを再懸濁します、降伏 100 万セル数 100 μ L。 トランスポート手術室に氷の上細胞。
- イソフルラン/O2を使用して動物を麻酔します。酸素を有効にし、0.5 mL/分調整 3% にイソフルラン気化器への流れを調整します。数分後に、麻酔室にマウスを配置します。
注: は、ストレスを最小限に抑えるために使用できるようになるように商工会議所を自動設定します。 -
マウスを鎮静、37 ° C で保管、オペレーティング暖房テーブルに動物をもたらすと麻酔鼻の円錐形の鼻を配置します。
- 注: 足蹠のピンチに反応が認められなかったとき、動物は鎮静適切。
- 注射部位を見やすくためにマウスを剃る。0.5 mL インスリン注射器; を使用して接種します。マウスの側面に細胞の 100 μ L を注入し、腫瘍を開発します。
- 麻酔機関動物ケアおよび使用委員会によって承認された子宮頸の転位で、動物を安楽死させます。 マイクロはさみや鉗子を使用して、腫瘍の位置で皮膚を開いてカットし、腫瘍を解剖します。腫瘍を PBS でシャーレに入れてください。マイクロはさみや鉗子、腫瘍を切る約 1 mm3 (1 a、図) の断片を使用してください。
注: ドナー マウスの腫瘍は十分な材料を与えるには十分に大きい必要がありますが、大、壊死性腫瘍は避けるべきであります。ほとんどの腫瘍の平均直径 10 mm で十分します。
3. ウィンドウの部屋の注入
- 無菌条件下ですべての手順を実行します。オートクレーブ手術器具 (図 1 a)、商工会議所資料 (図 1 b)。
注: 1.1 g の総重量と、ここで使用ウィンドウ室行われますポリエーテルエーテルケトン (PEEK)、MRI は、ライト、合成材料の互換性。ピークは 3.4-fold これらのウィンドウの文献で用いられるチタンより軽いです。ほとんどの化学薬品に耐性があるし、不活性で、免疫反応を誘発しない頑丈です。このウィンドウは、以前に公開された windows に比べてデザインが小さくも。マウスの全容量このウィンドウを装備は、登ることができます、ウィンドウ チャンバーなしマウスに比較的体重運動。合成 windows 可能性があります少し短い最後の動物は、ウィンドウにかむことができる、のでチタン窓と比較してただし、彼らは、安価に簡単にしています。これらの特定の windows は、社内がなされ、リクエストに応じて取得することができます。 - 麻酔室に吸入麻酔薬 (イソフルラン/O2など) を使用して受信者のマウスを落ち着いた。37 ° C で保管温水オペレーティング テーブルにマウスを持って行くと麻酔鼻の円錐形の鼻を配置 (ステップ 2.6 参照)。乾燥を避けるために眼軟膏を適用します。
- 剃毛、髪除去ゲルを適用することにより背中全体から髪を削除します。すべてのゲルが注意深く手温かい水道水で動物を洗浄によって削除される注意してください。動物を乾燥し、70% エタノールで皮膚をきれい。
注: シェービングの手順も実行できますウィンドウ注入前に、の日。クリームは、これは皮膚の炎症を引き起こす可能性がある手暖かい水で徹底的に削除する必要があります。 - 商工会議所の対称的な位置にマーカーをマウス背骨の中心線をマークします。マウスの位置を変更、折る位置と中心線を使用して折り返しに皮膚を引っ張って、フラップの中央を持ちます。フレームの上部は少なくとも 2 mm 中心線およびサークル マーカーで肌にウィンドウ表示領域の下にウィンドウを移動します。
- 15 とマイクロのはさみのメス ホルダー/ブレード サイズを使用して、描画の円の線に沿って皮膚を削除します。基本的な筋膜を損傷しないように注意します。
注: これは腫瘍が移植される商工会議所のウィンドウの表示領域を作成します。 - プルアップ、皮下脂肪と皮膚を通して直径、1 つの表示領域 (図 1 a b) のいずれかの側に 1 mm の穴をパンチに耳パンチャーを使用します。
注: これらは一緒にウィンドウ フレームを修正する 2 つのボルトのための穴です。 - ボルト (図1 b は、 1 b c) を使用してオーダーメイドの前室フレームを配置し、ボルトに戻るフレーム (図 1 b b) を配置します。ボルトのバック フレームにナット (図 1 b d) を配置します。
注: これらのボルトに対して一緒に部屋を修正する使用、皮下脂肪、顕微鏡下で評価中にチャンバーを固定する後で使用されます。 - フレームの上の上の 2-3 mm の皮膚を引っ張るし、移植ウィンドウ表示領域が商工会議所地域を一致することを確認してください。フレームの上部に 2 つの小さな縫合穴 (図 1 b、黒矢印) を介して場所 23 G 針。マイクロ ドライバー (図 1 a c) とナットを固定するクランプ ホルダー ボルトのナットを締めます。
ボルト周り皮膚が入らないように予防の注意とあまりにも多くを締めください。 - 肌にフレームを修正する、上部から順に縫合針を交換してください。5 組のフレームの穴 (図 1 b、白矢印) を縫合のためにこれを行うには。
- 窓室の裏側を明らかにするのには、マウスの電源を入れます。10 mm の直径と厚さ 0.55 mm (図 1 b e) し、12 mm (図 1 b f) の標準的なカバー ガラス充填ガラスの厚い部分を配置します。背面チャンバー エリアで止め輪 (図 1 b g) と、これらを固定します。
メモ: フィラー ガラスは、筋膜とイメージングに使用されるフロント側でウィンドウを開くスペースをできなくなります。 - 滅菌の 0.9 %1 mL シリンジを充填で挿入される腫瘍でウィンドウの表示領域を水和物塩化ナトリウム。この表示領域の上に数滴を許可します。滅菌綿棒で余分な食塩水を削除します。
- 筋膜 (図 1 a d) 90 ° の角度で曲がっている 1 mm3腫瘍フラグメント (1 a、図)、その先端で 25 G の針を使用して保持するために十分な大きさのポケットを作成します。このポケットに移植ウィンドウ表示領域の中央に腫瘍フラグメントを挿入針ホルダーまたはケリー鉗子を使用する。
- 12 mm と止め輪の標準カバー ガラス ウィンドウの表示領域を閉じます。
注: 空気の泡を形作ることができる、しかし、それは時間以内に消えます。
4. 前と動物のアフターケア
- 痛みを軽減する (すなわち、 0.05 mg/kg、ブプレノルフィンなど) のための薬を皮下機関動物ケアおよび使用委員会によって承認された管理します。加熱ランプの下で麻酔から回復するマウスを許可します。
- ケージと 32 ° c ・湿度 50% の上の設定室温制御室で個別にマウスのウィンドウを配置します。水のボトルが漏れを防ぐためにケージにそれらを置く前に環境温度が確認します。ケージと遮るもののない動きと食料と水へのアクセスを許可する濃縮を使用します。
注: このウィンドウの商工会議所が許容される非常によく、マウスは、正常な動作を表示します。個々 の住宅は、他のマウスによるウィンドウ室に損傷を防ぐし、高温多湿を防ぐ冷却ダウンとの脱水症状、皮下脂肪。 - かんだオフ縫合、緩いボルト/ナット、またはカバーのガラスを定期的にマウスを確認してください。すぐに修理し、このときを取り替えます。軽い素材で作られたカバーは、ウィンドウを保護するために使用することがあります。
5. 生体イメージング
注: この手順で多光子顕微鏡と適切な制御ソフトウェア使用されます。ここでは、顕微鏡に用意されているソフトウェア パッケージが使用されます。プリンシパル、付属して顕微鏡、顕微鏡コントロール、および画像のキャプチャは、任意のソフトウェア パッケージは、この目的をスイート。
- システムの電源: PC/顕微鏡、共焦点コントロール ユニットに電源電力、レーザーし、レーザー放出。たとえば、このソフトウェアでソフトウェアを起動し、「テーブルを初期化」をクリックして (図、 1E は 1E c) 顕微鏡テーブルの初期化システムに切り替え、顕微鏡、xy テーブル、z 位置、およびイメージのキャプチャを制御する PC を有効にするモードに設定します。
- 蛍光灯 (図 1E b) に切り替えます。
注: これは明視野とともに眼を蛍光画像が評価されます。 - カスタムメイド、温度制御プラットフォームのスイッチ (図 1 C c; 詳しく説明で説明した) 37 ° C で設定
- イソフルラン/O2 (図 1E d) を使用して麻酔ユニットの切り替えます。顕微鏡ステージ (図 1 C e) に麻酔のチューブをマウントします。麻酔の鼻の部分を修正する xy ステージにクランプをインストールします。
- 腫瘍血管の開発の段階を確立する動物を事前に評価します。これは腫瘍の成長の速度に依存しますがそれは、個体によって異なります。
- 麻酔室に吸入麻酔薬 (イソフルラン/O2) を使用してマウスを落ち着いた (2.6 の手順を参照してください)。
- 顕微鏡ステージ上にマウントされている温度制御プラットフォームへ動物を配置します。これは、冷却、動物の場合は麻酔を防ぎます。マウスの鼻に麻酔の円錐形であることを確認し、評価が 5 分よりも長くかかる場合は、眼軟膏を適用します。
注: 1 h 以上の評価のためには、2% にイソフルラン流れを減らします。 - 特注チャンバー ホルダー (図1 C に) 商工会議所 (図 1 C b、完全な矢印) を修正するのに商工会議所のボルトを使用します。温水のプラットフォーム (図 1 C c) (図 1 C d、破線の矢印) このホルダーをネジします。
注: この組み合わせは自由に呼吸する動物を許可しながらウィンドウの表示領域の運動成果物を防ぎます。 - ぼやけたイメージとガラスの外側の残骸から干渉を防ぐために水に浸した綿棒でウィンドウの表示領域のガラスをきれいにすることを確認します。顕微鏡ステージ (図 1) のプラットフォームとマウスを配置します。
注: こと尾スタックしている得ないプラットフォームと顕微鏡ステージの間世話をします。 - 10 X 対物レンズ、明視野と蛍光ライトを用いた腫瘍容器開発の段階を視覚的に確認してください。
注: 蛍光血管にフォーカスする必要があり、血流は、明るいフィールドに表示する必要があります。血管がはっきり見える、腫瘍血管の開発の段階を評価します。例えば、先端細胞または薬物送達のためのすでに確立された血管の成長による早期発症の血管新生があるかどうかを決定します。同じ動物をもう一度、評価できるし、腫瘍としての開発は継続的なプロセス。いくつかの段階を同時に単一の腫瘍に観察できます。- 血管系に焦点を当てる、ステージから動物を削除することが可能でない場合は、マウスのリカバリ、および動物は、気候制御空間に戻って配置をしましょう。後でもう一度確認してください。マウスが評価の準備ができて、下記の手順を続行します。
- 共焦点レーザーと「レーザー」をクリックしてコントロール パネル「Ctrl パネル」[設定] タブに切り替える
注: 低く、特に漂白剤、症状や組織の加熱を防ぐために、アルゴン レーザーのレーザー出力を設定することをお勧めします。コントロール パネルは、個人の好みに設定することができます。複数の同時を使用して生体イメージングの次の設定を適用することは勧め: オフセット、ターンごとに 10% を「ゲイン、1 ターンに 100 V スマート」「スマート」「ズーム、中」「X 位置、中、」「Y 位置、媒体」と「Z の位置、1 ターンに 100 μ m」画像、前にノイズを最小限に抑え、信号対雑音比を最適化するオフセットを調整します。共焦点ズーム機能は、倍率が高いほど、対物レンズを変更することがなくX、Y、および Z のコントロールは、関心のある分野を検索する必要です。生体顕微鏡用 Z 位置決めする必要があります毎ターン約 100 μ m ティック組織が評価されます。 - [取得] タブの「取得」をクリックして、設定を変更します:「アクイジション ・ モード XYZ や XYZT、」"形式 (512 x 512 または 1024 x 1024)"と「スピード (400 の Hz または 200 Hz)」「ピンホール」をクリックし、、1 の広々 としたユニットに設定。"双方向 X"をクリックします。
注: 画像を最適化するためのレーザー出力、ゲイン、およびピンホール間のバランスする必要があります打たれる議論に記載されています。 - 複数の fluorophores が付いて、「シーケンシャル スキャン"の選択を評価するとき、"フレーム"の間に写り、議論に記載されているを防ぐために。 「ライン平均 4」を選択良い雑音低減を取得しますします。
注: 遺伝子組換え動物の存在の本質的な蛍光によって他の蛍光マーカーのような dextrans、ヘキスト、FITC BSA、蛍光化学療法および/または 0.9% 塩化ナトリウムがすることができます希望の濃度に希釈してナノ粒子投与し、腫瘍の評価。これらは尾や陰茎の静脈を通じて注入されます。 - [取得] タブの「実験」をクリックし、新しいデータを基本に"New"を選択します。
- 動物の使用を評価、研究課題によっては、10 倍、20 倍、または 40 × 対物レンズします。眼を評価する位置を見つけます。
注: それは NA の最大は、可能な限り乾燥レンズが比較的長作動距離、ない必要な浸漬液と乾燥のレンズを使用するが最適です。議論では、水浸対物レンズの使用が記載されています。 - 高速ライブ スキャンを使用して、適切なゲインとオフセットの露出オーバーを防ぐために、信号対雑音比を最適化するを見つけます。また、定量的な比較が必要な場合の実験との間には、同じイメージング設定を維持します。
注: 最適なイメージングのための他の考慮事項の説明で記載されています。コントロール パネルを使用してライブ スキャン中に XYZ 位置とズームを終了できます。 - Z スタックをするためには、"z"で選択、[取得] タブを高速 Z スキャンの制御パネルの Z 位置を使用して、"開始 μ m"と「終了 μ m.」をクリックしてスキャンの前後を設定ピンホールの大きさに関連する Z ステップ サイズを設定します。
- 「スタート」をクリックして、画像をキャプチャします。
注: 生体顕微鏡はすべてに約したがってダイナミックなプロセスの動態が観察される、イメージを取り込むために必要な時間の間の妥協、生物的プロセスの速度を行う必要があります。一般に、解像度が高いほどより蛍光チャネルは、スキャンし、スキャンの大きなフィールド、画像あたりより多くのピクセル。厚い Z スタックは、長く撮像時間に変換します。もう撮像時間はアーチファクトの可能性が高くなります、イメージ化組織に損傷を与える可能性があります。また、漂白とレーザー パワーと蓄積された染料の濃度によって影響される毒性を引き起こす特定の蛍光ラベルをスキャンこと注意してください。 - Z スタックをスキャンした後すぐに評価できる「最大投射」をクリック。Z スタックは自動的にデータベースに保存し、名前を変更できます。
6. データの分析
- 元の研究の質問に応じてデータ分析の ImageJ5、Matlab11アミラなど、いくつかのソフトウェア プログラムのいずれかを使用します。正しい分析が重要です。
Representative Results
生体イメージングの主要な属性は、侵襲的介入なしの細胞プロセスの縦方向の可視化です。これは、興味のセルの構成または誘導蛍光マーカーを発現するトランスジェニック動物が使用されます。図 2は、eNOStag 緑の蛍光蛋白質 (GFP)9とローザ mTmG マウス行10で蛍光ラベルの表現を示しています。ENOStag GFP は、GFP をタグとして切り捨てられた eNOS 遺伝子を利用して生産されたマウス ラインです。重要なは、血管内皮細胞の eNOS を高度に発現し、GFP シグナルは th eGolgi と細胞膜 (図 2 a) に示されています。ローザ mTmG マウス 2 色蛍光の膜をターゲットとした Cre 記者の対立遺伝子があります。この行は、広範な細胞 mTomato 蛍光と Cre リコンビナーゼ発現細胞の mGFP を表現し、トレースする血統の使用が大幅に。腫瘍部分は、非組み換えのドナーから移植は、赤い蛍光性主にによって表されます、腫瘍間質部分 (例えば、循環細胞、血管の細胞の膜に血液細胞を浸透し、腫瘍関連線維芽細胞 (図 2 b))。
血管の形成が堅く調整され、これを調査する優秀なモデルは発展途上の網膜12,13。また、腫瘍血管の成長は、網膜血管の開発の原則に近いキネティック プロセスです。しかし、腫瘍血管組織を欠いているし、腫瘍は改造継続的にので、腫瘍関連血管。その利点は、血管新生モデルとして腫瘍を使用する場合、容器開発のすべての段階は、同時に同じ腫瘍でしばしば見つけることが、これには持つことができます。これらが含まれます (図 2); 腫瘍の非血管部分に成長している内皮発芽前には壊れた血管 (図 2 D);確立された血管ベッド (図 2E-私) と成熟し、分岐血管 (図 2 e II)。ただし、血管内皮細胞は、これらの分野でまた見つけることが。血管新生刺激によって刺激され、血管内皮細胞は突出する糸状 (図 2 e III) とスキャンおよび方向の移行 (図 2 e-IV) のこれらの実験を使用して先端のセルに進むことができます。この先端のセルは腫瘍間質に移行し、茎細胞分裂が続きます。単一内皮先端セル、いくつか実験を拡大して、取り消し、随時更新と生体顕微鏡観察 (図 2 f) を使用して追跡することができます。
第二に、新生前部の管腔形成を決定、血液腫瘍、血管外漏出流れ生体顕微鏡を使用できます。既に現在、動物における内因性蛍光シグナル、に応じて異なる蛍光物質を管理できます。血流や血管外漏出は、ヘキスト、蛍光 dextrans または FITC BSA を使用して視覚化できます。血液の流れと粒子の漏出の拡張に関する長い循環が 100 の peg 化ナノ粒子を蛍光ラベル nm を使用ことができます。これらのナノ粒子の調製については、以前の文書5を参照してください。これらの化合物の雇用は、図 3に示されています。ローザ mTmG マウス内皮端細胞は腫瘍組織に侵入はっきり見ることができます。機能的な血流は血管の管の内腔で全身注入されたナノ粒子の紫の蛍光によって示されて (図 3A-私)。ナノ粒子は、茎セル領域 (図 3 a II) 腔の形成を示す血管内皮細胞を密接に達する。全身投与化学療法の配信によって異なります機能血管系腫瘍間質に達するために、図 3B に示すとおり、注射剤、自分のサイズの独立した破壊された血管領域に浸透しません。船を圧縮、または血液うっ滞船。
ほとんどの器官に内皮細胞膜が血と基になる組織の機能的なバリアを形成し、分子の通過が堅く調整されます。しかし、腫瘍関連血管は漏れに知られて、細孔径カットオフは、腫瘍の種類14に大きく依存します。サイズの異なる蛍光共役 dextrans を注入して、血流、透磁率、血管外漏出を評価することができます。ヘキスト (615 Da) 腫瘍組織に急速に拡散させるし、周囲の細胞によってとられる (図 3-私)。注入直後後の 10 KDa (図 3CII) と 2 MDa (図 3 C III) デキストランは血液で発見されます。ただし、10 KDa は、またより小さい分子の機能である内皮細胞膜の透過性を示す腫瘍間質で見られるデキストランは、腫瘍血管に生得的地位。40 分後注入 (図 3 C-IV) デキストラン 10 KDa が血流 (図 3 C V) とデキストラン 2MDa の蛍光強度からオフになって減少 (図 3 C VI) では同様。ただし、大規模な dextrans は、この時間枠の内で大きな分子の透過性の欠如を示す腫瘍の間質が見つかりません。
腫瘍病態、その高い増殖、壊死と非血管分野では血管新生モデルとして腫瘍を使用する場合に非常に有益できます。ただし、これは効果的な療法および調査のための問題を示します。腫瘍関連血管系の不均一性により、全体エリア薬物無料15を残して、投与薬の不均質分布です。ドラッグデリバリー システムを改善するために適用される15,16,17, をすることができますいくつかの戦略と治療の進行は、この生体の設計を使用して調べることができます。腫瘍関連血管は、血管作動物質を使用して薬物配信17を向上させる操作できます。Doxil との組み合わせで血管作動性のエージェントとして腫瘍壊死アルファ (TNF) を用いた腫瘍血管操作の結果、化学療法剤として、ドキソルビシンのカプセル化されたリポソーム製剤は原稿5,で表示されます。18,19. いくつか時間、そうでない場合に血液循環20日循環する dextrans と対照をなしてペグインターフェロン ナノ粒子が作られています。
前述したように、腫瘍領域は事前研究の質問に応じて正しい腫瘍領域を特定するスキャンすることができます。薬物の運命は、既に破損した血管床 (データは示されていない) と区域対機能血管分野で評価できます。細胞傷害性干渉することがなく抗癌剤の運命を調べるためには、治療上のエージェントと同じ組成を持つナノ粒子をモデル薬物として使用できます。ENOStag GFP 動物これらのナノ粒子に扱われた静脈、後 24 h をイメージします。ナノ粒子は腫瘍間質に最小限の血管外漏出と、血管内に存在していた (図 4 a-私)。しかし、ナノ粒子は、TNF との組み合わせで管理された、血管外漏出が増加腫瘍薬物送達腫瘍間質 (図 4 a II) に血流から観察されました。高分解能対物レンズを使用して、化合物の細胞内局在化することができます認識ヘキスト緑内皮細胞と腫瘍間質 (図 4 b) の細胞の核の位置によって次のよう。また、ドキソルビシンのような多くの化学療法薬は、DNA にインターカ レート、としてこれらの化合物の局在を評価できます。ドキソルビシン赤の蛍光特性があり、ナノキャリアが例えば、tetramethylindotricarbocyanine 過塩素酸塩 (でした) でラベル付けできます。ENOStag GFP 動物は Doxil を点滴を注射された-TNF との組み合わせでは、治療後 24 時間に撮影されました。Doxil-血管からバリウムしたしたし、取られた周囲の腫瘍組織を (図 4-私)。個々 の細胞 (図 4 C II) のより詳細な評価は、リリースされたドキソルビシンは細胞の核に認められた間質でキャリアを見つけることができることを示した。
図 1: 楽器、背側プロシージャに必要な皮下脂肪の商工会議所と機器のセットアップ。(A) 腫瘍片 (、)、注入に必要な手術器械。標準計測器が耳パンチャー (b)、(c) マイクロ スクリュー ドライバー、曲がった針 (d)。(B) 背皮下脂肪ウィンドウ商工会議所。表 (a) と (b) ウィンドウを裏 (矢印: 縫合の穴; 矢印: ボルト用の穴)、2 ボルト (c)、2 ナット (d)、1 充填ガラス (e)、2 カバー ・ メガネ (f)、および保持リング (g) 2。また、止め輪なしフック (白い矢印) を必要がある場合で使用できます。(C) 特注チャンバー ホルダー (a)、商工会議所・ チャンバー ホルダー (b)、ボルト温度制御プラットフォーム (c)、プラットフォーム (d)、商工会議所のホルダーを固定するボルトし、麻酔のホルダー チューブ (e)。(D) 動物はプラットフォームでチャンバー ホルダーにマウントされています。B16BL6 腫瘍 (矢印) は、ウィンドウの表示領域に表示されます。(E) 生体評価に必要な装置。イメージング顕微鏡制御ソフトウェア (a) 標準的な蛍光ライト (b) と、顕微鏡とコンピューター。多光子共焦点だった麻酔ユニット (d) と (c) を使用。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: トランスジェニック動物の本質的な蛍光します。ここで示されているすべての画像は、50 〜 70 μ m 厚の間 Z スタック予測をされます。(A) eNOSGFP のタグラインで GFP はゴルジ (アスタリスク) と内皮細胞の細胞膜 (矢印) で表されます。スケールバー = 100 μ m。 (B) 腫瘍発現ローザ mTmG ラインの mTomato が血管細胞 (矢印) と (アスタリスク) の血液細胞の細胞膜で主に見られます。スケールバー = 100 μ m。 (C) A への投影成長血管前面の非血管腫瘍。スケールバー = 100 μ m。 (D) A (アスタリスク) 確立され、破損した血管と腫瘍の部分の投影。(確立された悪性腫瘍血管 (EI) 船舶 (EII); 成熟した目盛りを表示 E) の投影糸状 (EIII、矢印) と新生血管内皮細胞元単一内皮細胞拡張 (EIV、アローヘッド) filopodium 間に成熟した容器。スケールバー = 100 μ m、糸状の (F) 動き続いて 1 時間。15 分毎に、Z スタックを取られた;最大投影がここで表示されます。(白い矢印) を拡張している、糸状停滞 (=)、後退 (赤矢印)、または完全に消える (-)。スケール バー = 25 μ m.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: 血管外漏出と血液の流れを説明するために投与注射ラベル。(A) A ローザ mTmG マウスは、紫の蛍光ナノ粒子を注入した、侵略の先端細胞前部の z は、10 分後 (AI) を取られました。最も血管内皮を示す投影もやし機能ルーメン (AII、矢印) があります。(AII、矢印) の流れのない、内皮もやしを稀だけ見ることができます。スケール バー = 250 μ m。 この Z スタック投影法 (B) 前処理 (BI) eNOStag GFP 動物に破壊された腫瘍血管領域を示しています。動物は、ナノ粒子 (紫、BII) とヘキスト (ブルー、BIII) 注入しました。ナノ粒子とヘキストは、顆粒細胞の残骸がまだ gfp によって示されている破壊された領域に到達しません。スケール バー = 250 μ m。 (C) eNOStag GFP マウスは、異なるサイズの 2 つの dextrans と注入された (赤 = デキストラン 2 MDa; 紫 = デキストラン 10 KDa) とヘキスト (青 = 615 ダ)、単一平面画像をご紹介し。注入後 10 分、血液や血管外漏出の存在は、同じイメージで見られています。ヘキストは血管からほとんどすぐに extravasates し、周囲の細胞 (CI) で取り上げられています。デキストラン 10 KDa (CII) は、血管と腫瘍間質で見ることができます。デキストラン 2 MDa (CIII) は、血管で見つけることができます。注射 (CIV) 後 40 分デキストラン 10 KDa が血 (CV) から消え、デキストラン 2 MDa の蛍光強度も低下 (CVI) だった。スケールバー = 100 μ m.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4: 化学療法の代理店の運命を調査します。ENOStag GFP 動物 (A) ナノ粒子と扱われた静脈、後で 24 h のイメージを作成します。ナノ粒子は、腫瘍間質 (AI) 最小限の血管外漏出、船舶にまだある存在。ナノ粒子は TNF と組み合わせれば、血管外漏出が血流から腫瘍間質 (AII) に観察されます。スケール バー = 250 μ m。 (B) による高解像度レンズ、内皮細胞質 (緑)、個々 のセルの核 (青) を認識することができます。スケールバー = 50 μ m。 (C) eNOStag GFP 動物だった Doxil と点滴を注入-TNF との組み合わせでは、画像が 24 h 後で撮影されました。ここでは、Doxil の血管外漏出-でした、腫瘍に血管から間質は明らか (CI)。個々 のセル (CII) のより詳細な評価は、リリースされたドキソルビシン (赤) は細胞の核 (矢印) で観察される間、(矢印)、細胞質に、紫のキャリアを見つけることができますを示しています。スケールバー = 50 μ m.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
Discussion
腫瘍治療効果と同様、腫瘍と腫瘍血管の開発は非常にダイナミックなプロセスであると生体評価は時間と空間依存的にこれらのプロセスの正しい評価をするための洗練されたツールです。生細胞マーカー、トランスジェニック動物の作成と画像診断法の進歩の増加する供給、生体イメージングは、ますます人気になっています。組織がまだ日常的に使用されているし細胞や構造を識別するために使用できるマーカーの数多く、ティッシュが不利な点ダイナミックなプロセスを調査するとき。組織の郭清が必要、静的な情報のみを提供します。固定組織の品質に影響を与える細胞間相互作用を損なうスライスします。また、ダイナミックなプロセスを調査するとき異なっているとしばしば推定時点で組織郭清動物の大規模な量が必要です。生体イメージングと XYZ 空間次元や時間の余分な次元を作る別の選手の適切な位置決め可能な空間と時間、同じ動物で評価できます。したがって、最適な時間ポイントが逃されない、実験ごとに使用される動物の数を大幅に削減します。第二に、組織抽出を最適化するために生体の評価と確立期間を推定できます。第三に、容器の成長の目的の段階を intravitally 識別して全体マウント組織としてステンド グラスします。
本稿に記載されている生体の設計は、皮下脂肪の溜まりモデルと専用の多光子共焦点顕微鏡背血管内皮細胞、変更された蛍光ラベルを表現するトランスジェニック動物の組み合わせを使用します。
血管内皮細胞は、血管新生中、ステージ21,22の数を通過し、腫瘍のこれらの段階が同時に見る多くの場合ことができます。ENOSTag GFP マウスの線を使用して、個々 の内皮細胞は続くことができるとも糸状のダイナミクスをたどることができます。したがって、intravitally 容器開発を勉強する良いモデルです。既に現在の固有のラベルによって注射蛍光剤は、管腔形成、血流、血管外漏出、および血のクリアランスを評価するために使えます。マウスは 5 h まで継続的に視覚化されます。動物の長期的な評価が可能な動物の麻酔に関するいくつかの注意事項が取られるときで前述されている23。この研究は癌に焦点を当てて、腫瘍組織や細胞が移植されました。しかし、我々 はまた中足骨および萌芽期の肺を試しました。ただし、調査の下で組織の成長速度は制限、肌が再生するを開始する数週間後、成長の遅い腫瘍または組織に問題になることができます。
検証フェーズでは、背の皮下脂肪ウィンドウ商工会議所が大幅に変更された古典的なモデル4と比較。フレームはオートクレーブ合成材料の組み立てられる、光と小さく、大規模なウィンドウ-表示領域で。(図 1Bg、白矢印) 止め輪のフックは、リングを簡単に除去の使用だけです。フックなしリテーナー リングは、これらのイメージングと干渉するときに使用できます。皮膚があまり伸長しないゆるみ、このモデルでは発生しませんし、感染症はまれにしか見られます。これらの変更は動物の不快感を軽減し、動物のプロシージャを大幅に絞り込みます。また、MRI24を使用して腫瘍をイメージングするときは、金属部品は簡単に削除できます。
Intravitally イメージの背に顕微鏡を採用できる皮下脂肪の部屋。主な要件は、顕微鏡ステージと対物レンズの間利用可能なスペースです。画像に影響を与える重要な側面は、運動です。動きの人工物を防ぐためには、(すべての挿入の除去) 後顕微鏡テーブルにフィットし、マウスをサポートするプラットフォームを使用してください。麻酔下では、マウスの呼吸を自由にできるように優れているときマウスを抑制する必要はありません。ただし、ウィンドウはビューのフィールドの最適な固定を与えるプラットフォーム上にボルトで固定 (すなわち腫瘍がウィンドウ チャンバーを介して表示されます)。家畜暖房用電子加熱パッドを使用してプラットフォームを加熱します。このプラットフォームは社内でつくられ、リクエストの詳細を得ることができます。高分解能対物レンズは不可欠な細胞内プロセスを評価するとき、細胞質と核の間で区別することが可能になります。優れた光学分解能 (高 NA) しかし、比較的長いテーパー レンズの使用作動距離 (できれば 2 mm 以上) をお勧めします。溶込み深さおよびラベルの蛍光イメージングの制限です。さらに、退色、光毒性、および彩度は、イメージ投射の間避けなければなりません。
ここでは、統合された共焦点多光子と共焦点顕微鏡は使用されました。多光子は直立、共焦点は倒立顕微鏡です。正立型顕微鏡の利点は、水浸漬レンズの使いです。これらのレンズがある高 NA と長作動距離、(例えば、 20 または 40 倍) の高倍率でも。具体的には、いくつかの企業が販売されている、20 の X NA 1.0 水浸漬レンズを取得することをお勧めします。浸漬のレンズを使用すると、対物レンズと浸漬液が 37 ° C まで加熱する必要ということに注意してください。最高の画像は勧め最適な共焦点設定を使用する (すなわちピンホール 1 風通しの良いユニットでレーザー出力可能なゲイン高すぎない限り低く (特に利得には、ノイズが導入されています) 場合、回線速度最大、およびスキャンの平均で)。露出、彩度、およびイメージの強度の違いは、データの品質を妥協します。彩度、露出オーバーを防ぐためにそれをお勧めします。これは、異なるゲイン設定で画像を取得することによって回避できます。ゲインの変更は、画像の明るさを変更する最も簡単な方法です。必要な場合は、レーザー パワーを調整できます。画像の品質を標準化するには、固定の蛍光強度を持つスライドを使用できます。顕微鏡が最適な状態に設定されている場合でも画質がウィンドウ商工会議所と組織の品質によってのかなりの程度まで決定は念頭にしておかなければなりません。
複数の蛍光マーカーを同時にスキャンするとき裁ち落としを通じて、もう 1 つのチャネルで 1 つの蛍光体が検出されたを避けなければなりません。裁ち落としを通じて最小重複スペクトルと蛍光物質の組み合わせを使用して、シーケンシャル スキャン フレーム間は避けてください。紹介画像は 3 連続したスキャンを使用してスキャンされた (トラック 1: GFP、DID や 488 と 633 レーザー; fluor647 トラック 2: 543 レーザー; mTomato や Doxil、ローダミン トラック 3 と: 405 レーザー ヘキスト)。
腫瘍血管の開発や先端細胞ダイナミクス、管腔形成、血管外漏出、血管損傷のいくつかの段階を評価する可能性を示しています。ENOStag GFP ラインを使用して、破壊された血管床と腫瘍エリア簡単にまだ gfp 粒状の細胞残り物によって検出されます。注射剤は見つかりませんでした、これらの分野の流れの欠如を示します。つまり、化学療法剤を投与では、これらの領域をどちらか届きません。ただし、容器破壊には治療の結果することができます。前処理容器破壊をチェックするため、腫瘍の前評価は、正確な治療評価のための前提条件で、この実験的なデザインを使用して簡単に実行できます。
生体顕微鏡を使える可能性の茄多があるし、詳細な議論はこの文書の範囲を超えています。可能なアプリケーションには簡単な洞察力を与えるためには、腫瘍組織の血管 (例えば船舶、分岐や交差の数) と血流、細胞間相互作用の開発化学療法の蓄積に関する研究が含まれますターゲットし細胞内処理と上記のここに示されている例をセルします。分析は、蛍光に基づいている、ウィンドウまたは組織の品質による強度変動の注意してください。また、腫瘍組織は比較的厚く、上下ビューの平面からの蛍光は画像の信号に影響を及ぼします。客観的な測定と定量画像解析法を結合することをお勧めします。例えば、薬物濃度に興味がある、生体顕微鏡観察後ウィンドウから腫瘍を削除してコンテンツ高速液体クロマトグラフィーを用いた共焦点の画像と比較するための薬剤を調べます。
まあこのモデルを使用して、いくつかの注意事項と、腫瘍の反応の評価を実行できます。1 つは、腫瘍が皮膚にで、内側も成長することを実現する必要があります。普及率は全体の腫瘍をカバーするために十分に深い場合、3 D 計測が可能です。このような場合、遠赤色染料を使用してください。としてウィンドウ チャンバーは肌環境の腫瘍にお得な情報をここで説明し、指摘するウィンドウが通常のマウスの体温よりも若干低い温度を維持することが重要です。そのため、皮下脂肪のウィンドウの商工会議所、背と生体研究を確認する右マイクロ環境設定で腫瘍を勉強することをお勧めします。重要なは、背側皮下脂肪室プロセスおよび療法の改善のため機器の基礎を提供するメカニズムの動力学への洞察力。また、体内分布および薬物動態に関する追加情報を取得できます。従来、これらの体内研究は担腫瘍動物の治療と薬剤の吸収を測定する腫瘍/臓器の解剖によって実行されます。この生体モデルを使用して (すなわち、血管内、腫瘍、細胞内、または核) 薬の腫瘍の場所が5,25,26提供できます。だけでなくは、明らかにされるも、時間ウィンドウ--機会の最適な吸収のため薬の場所です。
この資料に記載されている実験的なデザインを使用して、広範なパラメーターを時空設定で評価できます。具体的には、ここでその生体顕微鏡による腫瘍血管の開発と治療反応の動態に重要な洞察を提供していますを紹介します。
Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
我々 は開発の eNOSTag GFP ライン、Joost 兼 Ren の動物の仕事と彼のテクニカル サポートおよび彼らの助けのための動物の介護の寄付なし・ ヴァン ・ Haperen、リニ ・ デ ・ Crom を感謝したいです。顕微鏡施設エラスムス光イメージング センターの一部であるし、我々 は彼らのサービスの OIC のスタッフに感謝したいと思います。この研究はオランダのがん学会、「Vereniging Trustfonds」エラスムス大学ロッテルダム、"スティヒティング エラスムス Heelkundig Kankeronderzoek"から DDHK 2000-2224 の助成金によって支えられた、我々 は彼らの寛大な寄付のための委員会メンバーに感謝。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Sigma | D1145 | Supplemented with 10% FCS |
| Trypsin-versene (EDTA) | Lonza | BE17-161E | Make a 0.1% solution in PBS, sterile |
| PBS | |||
| Window frames | Costum made | ||
| Filler glass 10 mm, 0.55 mm | Abrisia technologies | ||
| Cover glass 12mm, #1 thickness | Thermo Scientific/VWR | 631-0713 | |
| Hear removal gel (veet) | for sensitive skin | ||
| Eye ointment | |||
| Buprenorfine hydrochloride | use 0.05 mg/kg | ||
| Anesthesia unit | O2/Isoflurane inhalation unit with an chamber and tubeing+cone | ||
| insulin syringe 0.5ml x 12.7mm 29g, green | BD | 324824 | |
| Needles 23G 1 1/4" | Braun | 4657640 | |
| Needles 25G 5/8" | Braun | 4657853 | |
| Sutures silkan 0.7 | Braun | 1134019 | |
| Nuts | Jeveka | 934 A2 1 | |
| Bolts | Jeveka | 84 A2 1 10 | |
| 0.9% NaCl | |||
| Microscope + software | The space between table and objective need to be wide enough to hold the animal | ||
| Heated temperature controlled platform | Costum made | ||
| Window holder | Costum made | ||
| tetramethylrhodamine 2,000,000 MW dextran | Invitrogen | D7139 | 100 µg/mouse |
| Alexa-fluor 647 10,000 MW dextran | Invitrogen | D22914 | 100 µg/mouse |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | H1399 | 25 µg/mouse |
| Pegulated nanoparticles | ref 5 | ||
| LEICA TCS SP5 Multiphoton Microscope | Leica | ||
| LAS AF Software | Leica |
References
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