Summary
该协议描述了表达细胞特异荧光标记的转基因小鼠的活体成像。活体成像提供了一种非侵入性的方法, 用于高分辨率观察活体动物使用植入窗口, 通过它的微观可视化过程是可能的。这种方法对于研究纵向过程尤其有用。
Abstract
肿瘤和肿瘤血管的发展, 以及肿瘤对治疗的反应, 是高度动态的生物过程。组织学提供静态的信息, 往往是不够的, 以正确的解释。活体的评估, 在这个过程中遵循的时间, 提供额外的和往往是意想不到的信息。随着转基因动物的建立, 表达细胞特异标记物和活细胞示踪剂, 改善成像设备, 和发展的几个成像室, 活体显微镜已成为一个重要的工具, 以更好地了解生物过程。本文介绍了一种研究肿瘤血管发育和治疗效果的空间和时间的实验设计方法。利用这种设置, 血管发育阶段, 尖端细胞和流明形成, 血流, 外渗, 建立的血管床, 和血管破坏可以可视化和遵循。此外, 治疗效果, 肿瘤的命运, 和定位的化疗化合物也可以遵循。
Introduction
虽然体外研究能够实现对过程的高分辨率动态成像, 但体外实验不允许在适当的上下文中进行评估。例如, 肿瘤细胞与基质间的相互作用或在肿瘤内的药物传递和分布不能在培养基中进行研究。因此, 动物模型被用来模仿人类的生理和病理。然而, 过程的纵向成像, 特别是在亚细胞的分辨率, 是具有挑战性的。分子成像方法, 如磁共振成像 (MRI), 单光子发射计算机断层扫描 (SPECT), 和正电子发射断层扫描 (PET), 具有良好的穿透深度, 但缺乏分辨率或无法说明解剖结构。光学成像提供高分辨率, 使结构成像, 但它伴随着穷人到最小的渗透1。活体显微镜结合窗室技术的应用, 如背皮或腹窗, 允许高分辨率成像在体内2,3,4。这项技术有明显的优势, 因为它允许纵向成像在数小时甚至数天, 成像的过程在适当的上下文 (例如,细胞细胞之间的相互作用的影像组织), 并在光学极限的分辨率先进的共焦和多显微镜。
引入具有细胞或蛋白质特异荧光标签的转基因动物, 为体内和体内的实验提供了过多的可能性。例如, 细胞之间的相互作用, 蛋白质的生产和对操作或疗法的反应可以在体内研究在使用这些模型的5,6,7,8。重要的是, 位置和时间可以用适当的成像设备和方法来确定。在这里, 活体显微镜的动物表达内皮标记与注射剂结合在一个肿瘤移植在一个改良背皮窗室提出。
Protocol
所有动物实验都是按照荷兰法律进行的, 荷兰鹿特丹的动物实验委员会批准了各项议定书。
1. 接收鼠标
- 当转基因小鼠出生时, 使用标准程序9筛选适合基因型的动物。
注: 在本手稿中, 提供的数据从 eNOStag-GFP 线9开发内部和购买的罗莎-mTmG (股票 007676)10行。 - 使用12周大或以上的小鼠, 超过20克。
2. 供体鼠标
注: 在背窗内植入的肿瘤片段是由非转基因供体动物获得的。根据肿瘤类型, 正常 (与体肿瘤) 或缺陷 (移植) 小鼠使用。
- 在培养基中用适当的补充剂在37° c 和 5% CO2中培养肿瘤细胞。
- 从细胞瓶中取出培养基, 用 1x PBS 清洗一次, 用0.25% 胰蛋白酶分离细胞。
- 通过添加细胞培养基使胰蛋白酶钝化。收集细胞, 旋转下来在 1200 x g 为5分钟, 并重在5毫升 PBS 的颗粒。
- 稀释20µL 的细胞悬液与20µL 的台盼蓝, 染色死细胞。使用例计算活细胞和死体细胞的数量;死细胞的数量不应超过10%。
- 再次旋转的细胞在 1200 x g 为5分钟和重的细胞团在冰冷的 PBS, 产生100万细胞每100µL. 将这些细胞输送到手术室。
- 麻醉的动物使用异氟醚/O2。打开氧气, 调节流量至0.5 毫升/分钟. 将异氟醚蒸发器调整到3%。几分钟后, 把老鼠放在麻醉室里。
注: 填充室, 以确保它已准备好使用, 以减少压力。 -
当老鼠被镇静时, 把动物带到操作的加热台, 保持在37° c, 并将鼻口放在麻醉鼻锥中。
- 注意: 当没有反应到脚捏时, 动物是适当的镇静剂。
- 剃须鼠标, 以更好地可视化注射网站。使用0.5 毫升胰岛素注射器接种疫苗;将100µL 的细胞注入老鼠的侧面, 让肿瘤发育。
- 经您的机构动物保育委员会批准, 经麻醉后的宫颈脱位安乐动物。 使用微剪刀和镊子, 切开皮肤在肿瘤的位置和解剖肿瘤。用 PBS 将肿瘤放入培养皿中。使用微剪刀和镊子, 将肿瘤切成大约 1 mm3 (图 1 a-a) 的碎片。
注: 供体小鼠的肿瘤应足够大, 以提供足够的物质, 但大的, 坏死的肿瘤应避免。对于大多数肿瘤, 平均直径10毫米就足够了。
3. 窗口室的植入
- 在无菌条件下执行所有程序。高压釜外科仪器 (图 1A) 和室材料 (图 1B)。
注: 在这里使用的窗口室, 总重量为1.1 克, 是由聚醚醚酮 (PEEK), 一个光, 合成材料, 是 MRI 兼容。PEEK 是3.4 倍的打火机比钛, 这是通常用于这些窗口的文献。它对大多数化学物质都是有抵抗力的, 是惰性的, 不会引起免疫反应, 而且是坚固的。与以前发布的窗口相比, 此窗口的设计也较小。装有这个窗口的小鼠显示出完全的运动能力, 可以攀爬, 并且在没有窗室的小鼠身上增加重量。因为这只动物可以咬在窗户上, 所以合成的窗户比钛窗要短一些。然而, 它们很容易制造, 而且价格低廉。这些特殊的窗户是内部制作的, 可以根据要求获得。 - 在麻醉室中使用吸入麻醉剂 (即,异氟醚/O2) 将接收器的小鼠镇静下来。将鼠标置于37° c 的加热手术台上, 将鼻口置于麻醉鼻锥中 (见步骤 2.6)。用眼药膏避免干燥。
- 通过剃须和应用脱毛凝胶去除整个背部的头发。注意, 所有的凝胶都是通过用手暖的自来水仔细冲洗动物来去除的。用70% 乙醇对动物进行干燥和清洁皮肤。
注意: 剃须程序也可以在窗口植入前的一天完成。奶油需要用手温的水彻底清除, 因为这会引起皮肤发炎。 - 用标记标记鼠标脊柱的中线, 以确保腔室的对称定位。将鼠标重新定位, 将皮瓣拉入以中心线作为折叠位置, 并抓住襟翼中间。放置窗口, 使框架的顶部位于中心线下面至少 2 mm, 并将窗口视图区域用标记圈在皮肤上。
- 使用手术刀持有人/刀片大小15和微剪刀, 删除沿绘制循环线的皮肤。注意不要损害基础筋膜。
注意: 这创造了肿瘤移植的房间的窗口视图区域。 - 拉起皮, 并使用耳冲床打孔1毫米直径通过皮肤, 一个在视图区的两侧 (图 1 a-b)。
注意: 这些是两个螺栓的孔, 用来将窗框固定在一起。 - 使用螺栓 (图 1 b-a, 1 b-c) 放置定制的前厅架, 并将后框架 (图 1 b-b) 放在螺栓上。在螺栓的后框架处放置螺母 (图 1 b-d)。
注: 这些螺栓是用来固定在一起对皮, 并在以后用于在显微镜下评估的房间。 - 拉皮肤2-3 毫米以上的框架顶部, 并确保可移植窗口视图区域匹配的会议厅面积。将23克针通过两个小缝合孔 (图 1B, 黑色箭头) 放在框架的顶部。用微型螺丝刀 (图 1 a-c) 和夹持针固定螺母拧紧螺栓上的螺母。
注意: 采取预防措施, 以确保皮肤不扭转螺栓, 不收紧太多。 - 用缝线替换针, 从顶部开始, 将框架固定在皮肤上。对框架中的5对缝合孔 (图 1B、白色箭头) 进行此项。
- 转动鼠标, 露出窗台的背面。将厚片填充玻璃的直径为 10 mm, 厚度为 0.55 mm (图 1 b-e), 然后为 12 mm (图 1 b-f) 的标准盖玻璃。使用固定环 (图 1 b-g) 将其固定在后腔区中。
注: 填充玻璃可防止在筋膜和前侧窗之间打开空间, 用于成像。 - 水合物的窗口视图区, 其中肿瘤将插入1毫升注射器与无菌0.9% 氯化钠。允许几滴落在这个视图区域。用不育的棉签除去过量的盐水。
- 在筋膜, 创建一个口袋大到足以容纳 1 mm3肿瘤片段 (图 1 a-a) 使用 25 G 针, 其尖端是弯曲在90°角 (图 1 a-d)。使用针夹或凯利钳, 插入在这个口袋里的可移植窗口视图区中间的肿瘤片段。
- 用标准盖玻璃 12 mm 和一个固定环关闭窗口视图区域。
注: 气泡可以形成, 但会在数小时内消失。
4. 动物的产前和后处理
- 管理药物止痛 (即, 0.05 毫克/千克丁丙诺啡) 皮下注射, 经您的机构动物护理和使用委员会批准。允许鼠标在加热灯下从麻醉中恢复。
- 把小老鼠单独放在笼子里, 在一个气候控制的房间设置到32° c 和50% 湿度以上。在把水瓶放在笼子上以防止渗漏之前, 确保这些水瓶处于环境温度。使用笼子和丰富, 允许通畅的移动和获得食物和水。
注意: 由于这个窗口室是很好的耐受性, 小鼠表现出正常的行为。个人住房防止其他老鼠造成的窗户室损坏, 高温/湿度防止皮的冷却和脱水。 - 定期检查鼠标是否有咬断的缝线、松动的螺栓/螺母或破损的盖子玻璃。立即修复和更换, 当这种情况发生。用轻质材料制成的盖子可以用来保护窗户。
5. 活体成像
注: 本程序采用多显微镜和相应的控制软件。在这里, 使用显微镜提供的软件包。在主体, 任何软件包, 配备了显微镜和意味着显微镜控制和捕捉图像将套件这一目的。
- 在系统上切换: PC/显微镜, 功率到共焦控制单元, 激光功率和激光发射。例如, 使用此软件, 通过单击 "初始化表", 启动软件并初始化显微镜表 (图 1 e a和1 e-c)。打开系统并将其设置为使 PC 能够控制显微镜、xy 表、z 定位和图像捕获的模式。
- 在荧光灯上切换 (图 1 e-b)。
注: 这是用来评价荧光图像通过眼睛与明亮的领域。 - 开关在定制的, 温度控制平台 (图 1 c-c; 在讨论中描述更详细) 设置在37° c。
- 使用异氟醚/O2 (图 1 e-d) 打开麻醉装置。将麻醉管安装在显微镜阶段 (图 1 c-e)。安装在 xy 舞台上的钳固定麻醉吻片。
- 对动物进行预评价, 建立肿瘤血管发育阶段;这取决于肿瘤生长的速度, 但它可以在不同的小鼠之间变化。
- 用吸入麻醉剂 (异氟醚/O2) 在麻醉室中用镇静剂 (见步骤 2.6)。
- 将该动物置于显微镜舞台上的温度控制平台上;这可以防止动物在麻醉时冷却下来。确保鼠标的鼻子位于麻醉锥和应用眼软膏, 如果评估将花费超过5分钟。
注: 对于超过1小时的评估, 将异氟醚的流量降低到2%。 - 使用会议厅螺栓修复 (图 1 c-b, 全箭头) 在一个定制的房间持有人的会议厅 (图 1 c-a)。将此支架 (图 1 c-d, 虚线箭头) 拧至加热的平台 (图 1 c-c)。
注意: 此组合可防止在窗口视图区域移动工件, 同时仍允许动物自由呼吸。 - 请务必清洁玻璃的窗口视图区域与棉花尖蘸水, 以防止模糊的图像和干扰来自碎片的玻璃外。将平台和鼠标放在显微镜舞台上 (图 1D)。
注意: 当心尾巴不会卡在平台和显微镜阶段之间。 - 使用10X 物镜、亮场和萤光灯, 目视检查肿瘤血管的发育阶段。
注意: 荧光血管应该是焦点和血液流动应该是可见的使用明亮的领域。当血管清晰可见时, 评估肿瘤血管发育的阶段。例如, 确定是否有早期的血管生成与生长的尖端细胞或已建立的血管的药物传递。同样的动物可以再次评估, 因为肿瘤的发展是一个连续的过程。单个肿瘤可以同时观察几个阶段。- 当不能集中于血管时, 将动物从舞台上移除, 让老鼠恢复, 并将动物放回气候控制的空间。请稍后再检查。当鼠标准备好进行评估时, 请继续执行下面描述的过程。
- 在 "配置" 选项卡中单击 "激光" 和 "Ctrl 面板", 在共焦激光器和控制面板上切换
注: 建议设置激光功率低, 特别是氩激光, 以防止漂白, 组织的加热, 和光。控制面板可以设置为个人首选项。对于使用多个荧光的活体成像, 建议应用以下设置: 智能增益, 每回合100伏, "智能偏移, 10% 每回合", "缩放, 中等", "X 位置, 中等", "Y 位置, 中等" 和 "Z 位置, 100 µm 每回合"。在成像之前, 调整偏移以最小化噪声和优化信噪比。共焦变焦功能允许更高的放大率, 而不改变物镜。需要 X、Y 和 Z 控件来定位感兴趣的字段。对于活体显微镜, Z 定位应该是大约100µm 每回合作为蜱组织评估。 - 单击 "获取" 选项卡中的 "获取", 并将设置更改为: "获取模式 XYZ 或 XYZT"、"格式 (512x512 或 1024x1024)" 和 "速度 (400 hz 或 200 hz)"。点击 "针孔", 并设置为1通风单位。点击 "双向 X"。
注: 为了优化图像, 在激光功率, 增益和针孔之间的平衡应该被击中, 这是在讨论中提到的。 - 在评估多个荧光时, 请选择 "顺序扫描" 和 "帧之间" 以防止出血, 这是在讨论中提到的。 选择 "线平均 4", 以获得良好的噪音减少。
注: 根据转基因动物的内在荧光, 其他荧光标记, 如糖, 赫斯特, FITC-BSA, 荧光化疗, 和/或纳米颗粒稀释到 0.9% NaCl 所需浓度可以在肿瘤中进行管理和评估。这些注射通过尾巴或生殖器。 - 单击 "获取" 选项卡中的 "实验", 然后选择 "新建" 以制作新的数据库。
- 根据研究问题、10X、20X 或40X 物镜评估动物使用情况。通过眼睛, 找到一个位置来评估。
注意: 最好使用 NA 尽可能高的干透镜, 因为干透镜具有相对较长的工作距离, 不需要浸入式液体。在讨论中, 提到了水浸泡物镜的使用。 - 使用快速实时扫描找到适当的增益和抵消, 以防止过度曝光和优化的信噪比。此外, 如果需要进行定量比较, 在实验期间和之间保持相同的成像设置。
注: 讨论中提到了对最佳成像的进一步考虑。XYZ 位置和缩放可以在使用控制面板的实时扫描过程中完成。 - 若要制作 z 堆栈, 请在 "获取" 选项卡中选择 "z 堆栈". 使用控制面板中的 z 位置进行快速 z 扫描, 并通过单击 "开始µm" 和 "结束µm" 来设置扫描的开始和结束。设置与针孔大小相关的 Z 步大小。
- 通过单击 "开始" 来捕获图像。
注: 由于活体显微镜是所有关于动力学和因此动态过程被观察, 妥协在需要的时间之间获取图象并且生物过程的速度必须被做。一般而言, 分辨率越高, 扫描的荧光通道越多, 扫描场越大, 每个图像的像素就越多。更厚的 Z 堆叠转换成更长的成像时间。较长的成像时间增加了运动工件的几率, 并可能对组织成像造成损害。同时, 要注意扫描某些荧光标签会导致漂白和毒性, 这是受激光功率和累积染料浓度的影响。 - 通过单击 "最大投影", 可以快速地对 Z 栈进行扫描评估。Z 堆栈自动保存在数据库中, 可以重命名。
6. 数据分析
- 根据原始研究问题, 使用多个软件程序之一, 如 ImageJ5、Matlab11或阿米拉, 用于数据分析。正确的分析是至关重要的。
Representative Results
活体成像的主要属性是细胞过程的纵向可视化, 没有侵入性干预。为此, 使用了在感兴趣的细胞中表达本构或诱导荧光标记的转基因动物。图 2说明了荧光标签在 eNOStag 绿色荧光蛋白 (GFP)9和罗莎-mTmG 鼠标线10中的表达。eNOStag-gfp 是一个鼠标线, 是在内部生产使用一个截短的 eNOS 基因作为一个标签的 gfp。重要的是, eNOS 是高度表达的内皮细胞, 和 GFP 的信号清楚地看到在 th eGolgi 和细胞膜 (图 2A)。mTmG 小鼠有一种膜靶向双色荧光法。这条线表达 mTomato 荧光在广泛的细胞和 mGFP 在重组表达的细胞, 并广泛用于血统追踪。由于肿瘤片是从非转基因供体移植的, 红色荧光主要由肿瘤中的基质部分表达 (例如,在血管细胞、循环细胞、浸润血细胞和肿瘤相关成纤维细胞 (图 2B))。
血管形成严密调控, 并且一个优秀模型研究这是开发的视网膜12,13。另外, 肿瘤血管的生长是一种与视网膜血管发育原理相似的动力学过程。然而, 肿瘤血管缺乏组织和, 因为肿瘤是不断重塑, 所以是肿瘤相关的血管。这可以有它的优势, 当使用肿瘤作为血管生成模型, 因为所有阶段的血管开发往往可以发现在同一肿瘤的同时。其中包括血管内皮生长前部的肿瘤 (图 2C);损坏的容器 (图 2D);和已建立的血管床 (图 2 e I), 具有成熟的分支容器 (图 2 e-II)。然而, 血管内皮细胞也可以在这些地区找到。当血管生成刺激时, 内皮细胞凸出丝状 (图 2 e-III), 并可以进入尖端细胞, 使用这些丝状扫描和定向迁移 (图 2 e-IV)。这个尖端细胞迁移到肿瘤间, 然后是分裂的茎细胞。一个单一的内皮尖细胞有几个丝状扩展, 缩回和更新在任何时候, 并可以跟踪使用活体显微镜 (图 2F)。
其次, 活体显微镜可以用来确定血管生成前的腔形成, 血流贯穿肿瘤, 和外渗。根据现有的内在荧光信号在动物, 不同的萤光化合物可以被管理。血流和外渗可以使用赫斯特, 荧光糖, 或 FITC-BSA 可视化。对于血流和颗粒外渗的扩展研究, 可采用长循环荧光标记的乙二醇纳米粒子100纳米。有关这些纳米颗粒的制备细节, 请参阅以前的出版物5。在图 3中演示了这些化合物的使用情况。mTmG 小鼠的内皮尖细胞可以明显的侵入肿瘤组织。功能性血流是由系统注入的纳米微粒在血管管腔内的紫荧光 (图 3 a-I) 显示的。纳米粒子紧密接触内皮细胞, 说明在茎细胞区形成一个流明 (图 3 a-II)。交付的系统管理的化疗依赖于一个功能的血管, 以达到肿瘤间, 如图3B 所示, 注射剂, 独立于其大小, 不穿透区域与被破坏的船只,压缩血管或有血瘀的血管。
在大多数器官中, 内皮细胞在血液和底层组织之间形成一个功能屏障, 分子的通道受到严密的调节。肿瘤相关的血管, 然而, 已知是漏的, 和毛孔大小切断取决于大肿瘤类型14。可以注射不同大小的荧光共轭糖, 以评估血液流动、通透性和外渗。赫斯特 (615 Da) 迅速扩散到肿瘤组织, 并被周围的细胞 (图 3 c-I) 所占用。注射后不久, 在血液中发现 10 KDa (图 3CII) 和 2 MDa (图 3 c-III) 的葡聚糖。然而, 右旋糖酐 10 KDa 也见于肿瘤间, 表明内皮内膜的通透性较小的分子, 这是一个特点归因于肿瘤血管。注射后40分钟 (图 3 c-IV), 右旋糖酐 10 KDa 从血流中清除 (图 3 c-V), 右旋糖酐2MDa 的荧光强度也降低 (图 3 c-VI)。然而, 在肿瘤间中没有发现大的糖, 这表明在这个时间框架内对大分子分子缺乏渗透性。
肿瘤病理生理学, 其高度增殖, 坏死, 和非血管的地区, 可以相当丰富的信息时, 使用肿瘤作为血管生成模型。然而, 这为有效的治疗和调查提出了一个问题。肿瘤相关血管的异质性导致了药物的异质分布, 使整个地区无药物15。为了改善药物的传递, 可以应用一些策略15,16,17, 使用此活体设计可以检查治疗进展。肿瘤相关的血管可以使用血管活性药物进行操作, 以改善药物的传递17。肿瘤血管操作的结果使用肿瘤坏死α (TNF) 作为血管活性剂结合 Doxil, 包膜脂质体制剂的阿霉素, 作为一种化疗药物在本手稿5,18,19. 与糖不同的是, 乙二醇纳米粒子在血液循环中被制成数小时, 如果不是几天, 则在20中循环。
如前所述, 肿瘤区可以预先扫描, 以确定正确的肿瘤区域, 根据研究问题。药物的命运可以评估在功能性血管与区域已经受损的血管床 (数据没有显示) 的地区。为了研究不受细胞毒干扰的化疗药物的去向, 与治疗剂相同的纳米颗粒可以作为模型药物使用。eNOStag-GFP 动物用这些纳米微粒进行静脉注射, 并在24小时后进行影像处理。纳米粒子仍然存在于血管中, 最小的外渗到肿瘤间 (图 4 a-I)。然而, 当纳米粒子与 TNF 结合使用时, 从血流中观察到肿瘤间 (图 4 a-II), 增加了瘤内药物的传递。通过使用高分辨率物镜, 可以识别化合物的胞内定位, 如赫斯特在绿色内皮细胞和肿瘤间细胞中的核位置 (图 4B) 所示。此外, 由于许多化疗药物, 如阿霉素, 1583年与 DNA, 这些化合物的定位可以评估。阿霉素具有红色的荧光特性, nanocarrier 可以标记, 例如, tetramethylindotricarbocyanine 高氯酸盐 (没有)。eNOStag-GFP 动物注射静脉注射 Doxil-与 TNF 结合, 并在治疗后采取24小时的图像。Doxil-淤血从血管中取出, 被周围的肿瘤组织 (图 4 c-I) 所占。对单个细胞的更详细的评估 (图 4 c-II) 表明, 载体可以在细胞质中发现, 而释放的阿霉素在细胞细胞核内观察到。
图 1: 仪器、背皮室和程序所需的设备设置.(a) 肿瘤片段 (a) 和植入所需的手术器械。非标准仪器是耳冲孔机 (b)、微螺钉驱动 (c) 和弯曲针 (d)。(B) 背皮窗室。前面 (a) 和后面 (b) 窗口 (箭头: 用于缝合的孔; 箭头: 螺栓孔), 2 螺栓 (c), 2 螺母 (d), 1 填充玻璃 (e), 2 盖眼镜 (f) 和2挡圈 (g)。此外, 在需要时可以使用无钩 (白色箭头) 的护环。(C) 定制的室架 (a), 用于腔室保持架 (b) 的螺栓, 温度控制平台 (C), 螺栓, 以固定室持有人的平台 (d), 和持有人与麻醉管 (e)。(D) 安装在平台上的室内支架上的动物。B16BL6 肿瘤 (箭头) 在窗口视图区域可见。(E) 活体评估所需的设备。计算机与成像和显微镜控制软件 (a), 标准荧光灯 (b) 和显微镜。多共焦是使用 (c) 与麻醉单位 (d)。请单击此处查看此图的较大版本.
图 2: 转基因动物的固有荧光.此处显示的所有图像都是 Z 堆栈投影, 介于50和70µm 之间。(A) 在 eNOSGFP 标记线中, GFP 是用内皮细胞的高尔基体 (星号) 和细胞膜 (箭头) 表示的。缩放条 = 100 µm. (B) mTomato 在罗莎-mTmG 线的肿瘤表达主要见于血管细胞 (箭头) 和血细胞 (星号) 的细胞膜上。缩放条 = 100 µm. (C) 一项对血管生长前血管肿瘤的预测。标尺 = 100 µm. (D) 肿瘤部分的投射与被建立的和损坏的船 (星号)。(E) 预测已建立的肿瘤血管 (EI) 显示成熟的蜱血管 (EII);血管内皮尖细胞与丝状 (iii, 箭头);和一个成熟的血管, 其中一个单一的内皮细胞延伸 filopodium (EIV, 箭头) 到间。缩放条形图 = 100 µm (F) 丝状的移动, 后跟1小时。每15分钟, 采取一个 Z 堆栈;这里给出了一个最大投影。丝状是延伸 (白色箭头), 停滞 (=), 缩回 (红色箭头), 甚至完全消失 (-)。缩放栏 = 25 µm.请单击此处查看此图的较大版本.
图 3: 注射用标签的管理, 以说明外渗和血流.(a) 用紫色荧光纳米粒子注入 mTmG 小鼠, 并在10分钟后 (AI) 上取一个入侵尖端细胞前端的 Z 栈。一个投影显示大多数的内皮芽有一个功能腔 (所有, 箭头)。只有很少能看到内皮芽不流 (所有, 箭头)。缩放条 = 250 µm. (B) 此 Z 叠加投影显示在治疗前 eNOStag-GFP 动物的肿瘤血管区被破坏 (BI)。该动物注射了纳米颗粒 (紫色, BII) 和赫斯特 (蓝色, 比尔)。纳米微粒和赫斯特不到达被毁坏的区域, 表明由粒状细胞残骸仍然表达 GFP。缩放条 = 250 µm. (C) eNOStag-GFP 小鼠注射了两个不同大小的糖 (红 = 葡聚糖 2 MDa; 紫色 = 葡聚糖 10 KDa) 和赫斯特 (蓝色 = 615 Da), 和单平面图像在这里介绍。注射后10分钟, 出现在血液和外渗是在同一图像。赫斯特 extravasates 几乎立即出了血管, 并被周围的细胞 (CI) 占用。右旋糖酐 10 KDa (CII) 可见于血管和肿瘤间。葡聚糖 2 MDa (CIII) 可以在血管中找到。注射后40分钟 (文明), 葡聚糖 10 KDa 从血液中消失 (CV), 葡聚糖 2 MDa 的荧光强度也降低 (CVI)。缩放栏 = 100 µm.请单击此处查看此图的较大版本.
图 4: 调查化疗药物的去向.(A) eNOStag-GFP 动物被注射了纳米颗粒并在24小时后成像。纳米粒子仍然存在于血管中, 在肿瘤间 (AI) 中有最小的外渗。当纳米粒子与 TNF 结合时, 从血流中观察到肿瘤间 (全部) 的外渗。缩放条 = 250 µm. (B) 使用高分辨率镜片, 可以识别单个细胞的内皮细胞胞浆 (绿色) 和细胞核 (蓝色)。缩放条 = 50 µm. (C) eNOStag-GFP 动物注射静脉注射 Doxil-与 TNF 结合, 并在24小时后拍摄的图像。在这里, Doxil 的外渗--从血管进入肿瘤间是明显的 (CI)。对单个细胞 (CII) 的更详细的评估表明, 紫色的载体可以在细胞质中找到 (箭头), 而释放的阿霉素 (红色) 在细胞细胞核 (箭头) 中观察到。缩放栏 = 50 µm.请单击此处查看此图的较大版本.
Discussion
由于肿瘤和肿瘤血管的发展, 以及肿瘤的治疗作用, 是高度动态的过程, 活体评价是一个优雅的工具, 以时间和空间依赖性的方式对这些过程进行正确的评估。随着活细胞标记的日益普及, 转基因动物的产生, 以及成像方式的进步, 活体成像越来越受到人们的欢迎。虽然组织学仍然是经常使用, 和大量的标记可以用来识别细胞和结构, 组织切片有缺点时, 调查动态过程。组织剥离是必需的, 只提供静态信息;固定影响组织质量;切片破坏细胞间的相互作用。另外, 当研究动态过程时, 组织解剖在不同的, 并且通常被推测, 时间点需要大量的动物。通过活体成像, XYZ 的空间维数和额外的时间维度可以在同一动物中进行评估, 从而使不同的玩家在空间和时间上的适当定位成为可能。因此, 最佳的时间点是没有错过的, 和动物的数量, 每个实验使用大大减少。其次, 利用活体评价建立的时间窗可以进行外推, 优化组织提取。第三, 所需的容器生长阶段可以确定 intravitally 和染色作为一个整体安装组织。
这篇手稿中提到的活体设计使用了在内皮细胞中表达荧光标签的转基因动物的组合, 改良后的背皮室模型和专用的多共聚焦显微镜。
内皮细胞在血管生成过程中经过多个阶段21,22 , 而这些阶段在肿瘤中往往可以同时看到。使用 eNOSTag-GFP 小鼠线, 可以跟踪单个的内皮细胞, 甚至可以追踪丝状动力学。因此, 研究船舶开发 intravitally 是一个很好的模型。根据现有的内在标签, 可注射荧光剂可以用来评估流明的形成, 血流量, 外渗, 和血液清除。鼠标连续成像5小时。动物的长期评估是可行的, 当关于动物的麻醉的几个预防措施被采取, 以前被描述了23。由于这项研究的重点是癌症, 肿瘤组织或细胞被植入。然而, 我们也试验了跖骨和胚胎肺。然而, 在研究中的组织的生长速度是有限的, 因为在几周后, 皮肤开始再生, 这可能是生长缓慢的肿瘤或组织的问题。
在验证阶段, 与经典模型4相比, 背皮窗室被大大修改。该框架是由产品合成材料, 是轻型和小, 有一个大的窗口景观区。固定环的钩 (图 1Bg, 白色箭头) 只用于容易去除的环。当这些干扰图像时, 不带挂钩的固定环可以使用。皮肤不伸展太多, 放松不发生在这个模型, 并且传染很少被看见。这些修改减少动物不适和改进动物程序显着。此外, 金属零件可以很容易地去除时, 成像的肿瘤使用 MRI24。
任何显微镜都可以采用 intravitally 图像背皮室。主要要求是显微镜阶段和物镜之间的可用空间。影响成像的一个重要方面是运动。为了防止运动工件, 一个平台, 适合在显微镜表 (后删除所有插入) 和支持的鼠标应使用。在麻醉下, 不需要对小鼠进行抑制, 最好是让老鼠自由呼吸。然而, 窗口被栓在平台上, 给视野的最佳的固定 (即,肿瘤是可看见的通过窗口房间)。该平台使用电子加热垫加热, 用于动物加热。这个平台是内部制作的, 可以根据要求获得具体的信息。高分辨率物镜是评估细胞内过程的必要条件, 并能区分细胞质和细胞核。使用的锥形透镜具有良好的光学分辨率 (高 NA), 但相对较长的工作距离 (最好是2毫米或以上) 建议。在成像的局限性是穿透深度和荧光强度的标签。此外, 在成像过程中必须避免漂白、光和饱和度。
在这里, 使用了一个综合共焦-多和共聚焦显微镜。多是直立的, 而共焦是倒置显微镜。直立显微镜的优点是易于使用水浸透镜。这些镜片有很高的 NA 和很长的工作距离, 甚至在高 (例如, 20 或 40X) 放大倍数。具体来说, 它是建议获得一个 20X NA 1.0 水浸透镜, 这是由几家公司出售。请注意, 当使用浸入式镜片时, 物镜和浸入式液体需要加热到37° c。对于最好的图像, 建议使用最佳共焦设置 (即,针孔在1通风的单位, 激光功率尽可能低, 增益不太高 (特别是如果增益引入噪声), 线速度在最大值, 并没有平均扫描)。过度曝光、饱和度和图像之间的强度差会损害数据质量。建议防止饱和度和过度曝光。这可以通过获取不同增益设置的图像来规避。更改增益是改变图像亮度的最简单方法。如果需要, 可以调整激光功率。为了使图像质量标准化, 可以使用具有固定荧光强度的幻灯片。我们必须牢记, 即使在显微镜设置最佳的情况下, 图像质量在很大程度上取决于窗口室和组织的质量
当同时扫描多个荧光标记时, 必须避免在另一条通道中检测到一个荧光的出血。通过使用荧光与最小重叠频谱和帧之间的顺序扫描的组合来避免出血。这里提出的图像扫描使用3顺序扫描 (轨道 1: GFP, 做或 fluor647 与488和633激光; 轨道 2: 罗丹明, Doxil, 或 mTomato 与543激光; 和轨道 3: 赫斯特与405激光)。
有可能评估肿瘤血管发展的几个阶段, 提示细胞动力学, 流明形成, 外渗, 和血管损伤在这里显示。使用 eNOStag-gfp 线, 肿瘤区与破坏血管床很容易检测到颗粒状细胞残留物仍然表达 GFP。在这些地区没有检测到注射剂, 表明缺乏流动。这意味着, 管理的化疗药物也不会到达这些地区。然而, 船只的破坏也可以是一个治疗的结果。肿瘤的预评价, 检查前处理血管破坏, 是准确的治疗评价的先决条件, 可以很容易地使用这种实验设计。
有大量的可能性, 活体显微镜可以使用, 并详细讨论超出了本出版物的范围。为了给出一个简单的见解, 可能的应用包括研究化疗在肿瘤组织中的积累, 血管的发育 (例如,血管、分支和交叉路口的数量) 和血流, 细胞间的相互作用,细胞靶向和胞内处理, 以及上面提到的例子和这里显示。由于分析是基于荧光, 知道强度波动, 由于质量的窗口或组织。此外, 由于肿瘤组织相对较厚, 因此, 视平面上方或下方的荧光对图像中的信号有影响。将定量图像分析与客观测量相结合是最好的方法。例如, 如果对药物浓度感兴趣, 在活体显微镜下从窗口取出肿瘤组织, 用 HPLC 法测定药物含量, 并与共聚焦图像进行比较。
使用该模型可以对肿瘤的反应进行评价, 但应采取一些预防措施。人们必须认识到, 肿瘤也生长向内, 进入皮肤。如果穿透深度足以覆盖整个肿瘤, 可以进行3D 测量。在这种情况下, 应使用远红色染料。这里所描述的窗口室处理的是皮肤环境中的肿瘤, 重要的是要指出窗户保持一个比正常的鼠标体温略低的温度。因此, 最好在右侧微环境中研究肿瘤, 以证实活体皮窗室的研究。重要的是, 背皮室提供了对过程和机制的动力学的洞察, 为改善治疗提供了一个工具基础。此外, 还可以获得关于分布和药代动力学的额外信息。经典的, 这些分布的研究是通过治疗肿瘤动物和解剖肿瘤/器官来测量药物摄取量来进行的。使用这种活体模型, 药物的肿瘤位置 (即,血管内, 肿瘤, 细胞内, 或核) 可以提供5,25,26。不仅是药物的位置显示, 而且也是时间窗口的最佳摄取机会。
利用本文所描述的实验设计, 可以在时间和空间环境中对各种参数进行评估。具体来说, 我们在这里表明, 活体显微镜提供了重要的洞察力的动力学肿瘤血管的发展和治疗反应。
Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
我们要感谢园 van Haperen 和里尼 de 先生为他们的发展和捐赠 eNOSTag-GFP 线, Joost 美联社 ren 为他的技术协助与动物工作和动物管理员为他们的帮助。使用的显微镜设施是伊兹斯光学成像中心的一部分, 我们要感谢伊斯兰会议组织工作人员的服务。这项研究得到了荷兰癌症协会的赠款 DDHK 2000-2224 的支持, 《鹿特丹大学 Vereniging Trustfonds 》和《 Stichting 伊兹 Heelkundig Kankeronderzoek 》, 我们感谢委员会成员的慷慨捐助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Sigma | D1145 | Supplemented with 10% FCS |
| Trypsin-versene (EDTA) | Lonza | BE17-161E | Make a 0.1% solution in PBS, sterile |
| PBS | |||
| Window frames | Costum made | ||
| Filler glass 10 mm, 0.55 mm | Abrisia technologies | ||
| Cover glass 12mm, #1 thickness | Thermo Scientific/VWR | 631-0713 | |
| Hear removal gel (veet) | for sensitive skin | ||
| Eye ointment | |||
| Buprenorfine hydrochloride | use 0.05 mg/kg | ||
| Anesthesia unit | O2/Isoflurane inhalation unit with an chamber and tubeing+cone | ||
| insulin syringe 0.5ml x 12.7mm 29g, green | BD | 324824 | |
| Needles 23G 1 1/4" | Braun | 4657640 | |
| Needles 25G 5/8" | Braun | 4657853 | |
| Sutures silkan 0.7 | Braun | 1134019 | |
| Nuts | Jeveka | 934 A2 1 | |
| Bolts | Jeveka | 84 A2 1 10 | |
| 0.9% NaCl | |||
| Microscope + software | The space between table and objective need to be wide enough to hold the animal | ||
| Heated temperature controlled platform | Costum made | ||
| Window holder | Costum made | ||
| tetramethylrhodamine 2,000,000 MW dextran | Invitrogen | D7139 | 100 µg/mouse |
| Alexa-fluor 647 10,000 MW dextran | Invitrogen | D22914 | 100 µg/mouse |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | H1399 | 25 µg/mouse |
| Pegulated nanoparticles | ref 5 | ||
| LEICA TCS SP5 Multiphoton Microscope | Leica | ||
| LAS AF Software | Leica |
References
- Massoud, T. F., Gambhir, S. S. Molecular imaging in living subjects: seeing fundamental biological processes in a new light. Genes Dev. 17, 545-580 (2003).
- Ellenbroek, S. I., van Rheenen, J. Imaging hallmarks of cancer in living mice. Nat Rev Cancer. 14, 406-418 (2014).
- Brown, E., Munn, L. L., Fukumura, D., Jain, R. K. In vivo imaging of tumors. Cold Spring Harb Protoc. 2010 (7), pdb prot5452 (2010).
- Palmer, G. M., et al. In vivo optical molecular imaging and analysis in mice using dorsal window chamber models applied to hypoxia, vasculature and fluorescent reporters. Nat. Protocols. 6, 1355-1366 (2011).
- Seynhaeve, A. L., et al. Tumor necrosis factor alpha mediates homogeneous distribution of liposomes in murine melanoma that contributes to a better tumor response. Cancer Res. 67, 9455-9462 (2007).
- Schiffelers, R. M., et al. Ligand-targeted liposomes directed against pathological vasculature. J Liposome Res. 12, 129-135 (2002).
- Straetemans, T., et al. T-cell receptor gene therapy in human melanoma-bearing immune-deficient mice: human but not mouse T cells recapitulate outcome of clinical studies. Hum Gene Ther. 23, 187-201 (2012).
- Pittet, M. J., Weissleder, R. Intravital imaging. Cell. 147, 983-991 (2011).
- van Haperen, R., et al. Functional expression of endothelial nitric oxide synthase fused to green fluorescent protein in transgenic mice. Am J Pathol. 163, 1677-1686 (2003).
- Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 45, 593-605 (2007).
- Manzoor, A. A., et al. Overcoming limitations in nanoparticle drug delivery: triggered, intravascular release to improve drug penetration into tumors. Cancer Res. 72, 5566-5575 (2012).
- Pitulescu, M. E., Schmidt, I., Benedito, R., Adams, R. H. Inducible gene targeting in the neonatal vasculature and analysis of retinal angiogenesis in mice. Nat Protoc. 5, 1518-1534 (2010).
- Tual-Chalot, S., Allinson, K. R., Fruttiger, M., Arthur, H. M. Whole mount immunofluorescent staining of the neonatal mouse retina to investigate angiogenesis in vivo. J Vis Exp. , e50546 (2013).
- Hobbs, S. K., et al. Regulation of transport pathways in tumor vessels: role of tumor type and microenvironment. Proc Natl Acad Sci U S A. 95, 4607-4612 (1998).
- Minchinton, A. I., Tannock, I. F. Drug penetration in solid tumours. Nat Rev Cancer. 6, 583-592 (2006).
- Koning, G. A., Eggermont, A. M., Lindner, L. H., Hagen, ten, L, T. Hyperthermia and thermosensitive liposomes for improved delivery of chemotherapeutic drugs to solid tumors. Pharm Res. 27, 1750-1754 (2010).
- Seynhaeve, A. L., Eggermont, A. M., ten Hagen, T. L. TNF and manipulation of the tumor cell-stromal interface: "ways to make chemotherapy effective". Front Biosci. 13, 3034-3045 (2008).
- Brouckaert, P., et al. Tumor necrosis factor-alpha augmented tumor response in B16BL6 melanoma-bearing mice treated with stealth liposomal doxorubicin (Doxil) correlates with altered Doxil pharmacokinetics. Int J Cancer. 109, 442-448 (2004).
- Hoving, S., Seynhaeve, A. L., van Tiel, S. T., Eggermont, A. M., ten Hagen, L. T. Addition of low-dose tumor necrosis factor-alpha to systemic treatment with STEALTH liposomal doxorubicin (Doxil) improved anti-tumor activity in osteosarcoma-bearing rats. Anticancer Drugs. 16, 667-674 (2005).
- Gabizon, A., et al. Prolonged circulation time and enhanced accumulation in malignant exudates of doxorubicin encapsulated in polyethylene-glycol coated liposomes. Cancer Res. 54, 987-992 (1994).
- Bergers, G., Benjamin, L. E. Tumorigenesis and the angiogenic switch. Nat Rev Cancer. 3, 401-410 (2003).
- Eilken, H. M., Adams, R. H. Dynamics of endothelial cell behavior in sprouting angiogenesis. Curr Opin Cell Biol. 22, 617-625 (2010).
- Nakasone, E. S., Askautrud, H. A., Egeblad, M. Live imaging of drug responses in the tumor microenvironment in mouse models of breast cancer. J Vis Exp. , e50088 (2013).
- van Vliet, M., et al. MR angiography of tumor-related vasculature: from the clinic to the micro-environment. Radiographics. 25, Suppl 1. S85-S97 (2005).
- Dicheva, B. M., et al. Cationic thermosensitive liposomes: a novel dual targeted heat-triggered drug delivery approach for endothelial and tumor cells. Nano Lett. 13, 2324-2331 (2013).
- Li, L., et al. Improved intratumoral nanoparticle extravasation and penetration by mild hyperthermia. J Control Release. 167, 130-137 (2013).
