Summary
ويصف هذا البروتوكول التصوير إينترافيتال من الفئران المحورة وراثيا معربا عن علامات نيون خلية على حدة. تصوير إينترافيتال يوفر طريقة غير الغازية للملاحظات ذات الدقة العالية في الحيوانات الحية باستخدام windows القابلة للغرس الممكن التصور مجهرية من العمليات من خلالها. هذا الأسلوب مفيد بشكل خاص دراسة العمليات الطولية.
Abstract
الورم والورم سفينة التنمية، فضلا عن استجابة الورم للمداواة، هي العمليات البيولوجية ديناميكية للغاية. علم الأنسجة ويوفر معلومات ثابتة وغالباً ما لا يكفي لتفسير صحيح. التقييم إينترافيتال، الذي يتبع عملية في الوقت المناسب، معلومات إضافية وغالباً غير متوقعة. مع خلق الحيوانات المحورة وراثيا معربا عن علامات خلية على حدة وتتبع الخلية الحية وإدخال تحسينات على معدات التصوير وتطوير عدة دوائر التصوير، الفحص المجهري إينترافيتال قد أصبح أداة هامة فهم أفضل العمليات البيولوجية. وتصف هذه الورقة تصميم تجريبي للتحقيق من ورم سفينة التنمية والآثار العلاجية بطريقة المكانية والزمانية. باستخدام هذا الإعداد، يمكن تصور مرحلة التنمية السفينة وتشكيل الخلية والتجويف تلميح، تدفق الدم، والتسرب، سرير الأوعية الدموية الراسخة وتدمير الأوعية الدموية واتباعها. وعلاوة على ذلك، يمكن أيضا الآثار العلاجية ومصير intratumoral وإضفاء الطابع المحلي على العلاج الكيميائي مركبات الواجب اتباعها.
Introduction
في حين أن الدراسات في المختبر يتيح التصوير عالية الدقة الحركية للعمليات، لا تمكن التجريب في المختبر التقييم في السياق الصحيح. على سبيل المثال، لا يمكن دراسة التفاعل بين الخلايا السرطانية مع مقصورات السدويه المعدية المعوية أو إيصال الأدوية وتوزيعها داخل ورم في لوحة ثقافة. ولذلك تستخدم نماذج حيوانية لتقليد الفسيولوجيا البشرية وعلم الأمراض. بيد أن التصوير الطولي للعمليات، ولا سيما في قرار سوبسيلولار، التحدي. التصوير الأساليب الجزيئية، مثل التصوير بالرنين المغناطيسي (التصوير بالرنين المغناطيسي)، انبعاث فوتون واحد تم حسابها التصوير المقطعي (SPECT)، والتصوير المقطعي بالبوزيترون (PET)، وقد عمق تغلغل جيد لكن قرار عدم أو تفشل لتوضيح البنى التشريحية. التصوير الضوئي ويوفر دقة عالية ويتيح تصوير هياكل، ولكن كان مصحوبا بالفقراء لاختراق الحد الأدنى1. التطبيق للفحص المجهري إينترافيتال في تركيبة مع نافذة غرفة التكنولوجيات، مثل الظهرية skinfold أو نافذة البطن، يسمح الاستبانة التصوير في فيفو2،،من34. هذه التكنولوجيا بمزايا واضحة، كما أنه يسمح للتصوير الطولي على مدى ساعات وحتى أيام، لتصوير العمليات في السياق الصحيح (مثلاً، تفاعلات الخلية الخلية في الأنسجة المصورة)، وقرارات في حدود بصري المجاهر المتقدمة [كنفوكل] ومولتيفوتون.
إدخال الحيوانات المحورة وراثيا مع تسميات الفلورسنت الخلية أو البروتين محددة يفتح عدد كبير احتمالات للتجريب في فيفو و السابقين فيفو . ليمكن دراسة مثيل، التفاعلات خلية خلية، وإنتاج البروتينات، والاستجابة للعلاج أو التلاعب في فيفو استخدام هذه النماذج5،6،،من78. الأهم من ذلك، ضع في مكان ووقت يمكن تحديده بمعدات التصوير السليم والمنهجية. هنا، والفحص المجهري إينترافيتال الحيوانات معربا عن علامة غشائي في تركيبة مع وكلاء القابلة للحقن في ورم مزروع في تعديل الظهرية skinfold نافذة غرفة يرد.
Protocol
أجريت جميع التجارب على الحيوانات وفقا للقانون الهولندي، وبروتوكولات وافقت عليها "اللجنة التجريب الحيوان" MC إيراسموس، روتردام، هولندا.
1-المستلم الماوس
- عندما يولد الفئران المعدلة وراثيا، شاشة الحيوانات للنمط الوراثي المناسب باستخدام إجراءات معيارية9.
ملاحظة: في هذه المخطوطة، يتم عرض البيانات التي تم الحصول عليها من خط انوستاج-بروتينات فلورية خضراء9 تطويره داخليا وخط10 روزا-متمج (الأوراق المالية 007676) التي تم شراؤها. - استخدام الفئران التي 12 أسبوعا القديمة أو كبار السن والتي فوق 20 غ.
2-الجهات المانحة الماوس
ملاحظة: يتم الحصول على جزء ورم لغرس في نافذة الظهرية من حيوانا المانحين غير المعدلة وراثيا. اعتماداً على نوع الورم، تستخدم عادي (مع الأورام سينجينيك) أو الفئران العوز (تكثيفها).
- تنمو الخلايا السرطانية في متوسط مع المكملات الغذائية المناسبة في قوارير الثقافة في شركة 37 درجة مئوية و 5%2.
- إزالة المتوسطة من قوارير الخلية ويغسل مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني 1 x، وفصل الخلايا باستخدام التربسين 0.25%.
- إلغاء تنشيط التربسين بإضافة خلية الثقافة المتوسطة. جمع الخلايا وتدور إلى أسفل في 1,200 س ز لمدة 5 دقائق، ومن ريسوسبيند بيليه في 5 مل من برنامج تلفزيوني.
- تمييع 20 ميليلتر من تعليق خلية مع 20 ميليلتر من تريبان الأزرق، الذي بقع الخلايا الميتة. حساب عدد الخلايا الحية والميتة باستخدام هيموسيتوميتير؛ يجب أن لا يتجاوز عدد الخلايا الميتة 10%.
- تدور الخلايا مرة أخرى في 1,200 س ز لمدة 5 دقائق وريسوسبيند بيليه الخلية في برنامج تلفزيوني المثلج، والخلايا 1 مليون الغلة الواحدة 100 ميليلتر. النقل الخلايا على الجليد إلى غرفة العمليات.
- تخدير الحيوان باستخدام إيسوفلوراني/س2. تحويل الأكسجين وضبط تدفق إلى 0.5 مل/دقيقة ضبط المبخر isoflurane إلى 3%. وبعد بضع دقائق، ضع الماوس في قاعة التخدير.
ملاحظة: بريفيل الدائرة التأكد من أنها جاهزة للاستخدام لتقليل الإجهاد. -
عندما يتم مخدراً الماوس، إعادة الحيوان إلى مائدة تدفئة التشغيل، أبقى على 37 درجة مئوية، ومكان الآنف في مخروط الآنف التخدير.
- ملاحظة: يتم بشكل صحيح مخدراً الحيوان عندما يلاحظ لا رد فعل على قرصه قاطع.
- يحلق الماوس لرؤية أفضل موقع الحقن. تطعيم باستخدام حقنه الأنسولين 0.5 مل؛ حقن 100 ميليلتر من الخلايا في الجناح الماوس والسماح بوجود ورم لتطوير.
- Euthanize الحيوان بخلع عنق الرحم تحت التخدير كما أقرتها الخاص بك رعاية الحيوان المؤسسية واستخدام اللجنة. باستخدام مقص الصغرى والملقط، قص فتح الجلد في مكان الورم وتشريح الورم. وضع الورم في طبق بتري مع برنامج تلفزيوني. باستخدام مقص الصغرى والملقط، قطع الورم إلى أجزاء من حوالي 1 ملم3 (الشكل 1A-أ).
ملاحظة: يجب أن يكون الورم الماوس المانحة كبيرة بما يكفي لإعطاء مادة كافية، ولكن ينبغي تجنب الأورام الكبيرة، نخرية. لمعظم الأورام، يكفي متوسط قطرها 10 مم.
3-غرس الدائرة النافذة
- تنفيذ كافة الإجراءات تحت ظروف معقمة. اﻷوتوكﻻف بالأدوات الجراحية (الشكل 1A) ومواد الدائرة (الشكل 1B).
ملاحظة: إطار الدائرة المستخدمة هنا، بإجمالي وزن 1.1 غ، مصنوعة من إيثر البروم ثنائي الفينيل كيتون (نظرة خاطفة)، مواد الخفيفة، الاصطناعية التي يتم التصوير بالرنين المغناطيسي متوافقة. نظرة خاطفة 3.4-fold أخف من التيتانيوم، والذي يستخدم عادة في الأدب لهذه الإطارات. هو مقاوم لمعظم المواد الكيميائية، خامل، لا تثير ردود فعل المناعة، وهو قوي. هذا الإطار أيضا أصغر في التصميم مقارنة بويندوز المنشورة سابقا. الفئران مزودة بإظهار نافذة هذه القدرات الكاملة للحركة ويمكن تسلق، وزيادة الوزن نسبيا للفئران دون دائرة نافذة. لأنه يمكن أن يعض الحيوان على النافذة، windows الاصطناعية قد يدوم أقصر قليلاً بالمقارنة مع ويندوز التيتانيوم؛ ومع ذلك، فسهلة وهي غير مكلفة. هذه النوافذ الخاصة الداخلية ويمكن الحصول عليها عند الطلب. - رصانة الماوس المستلم باستخدام المسكنات استنشاق (أي، إيسوفلوراني/س2) في تشكيل غرفة تخدير. إعادة الماوس إلى طاولة التشغيل ساخنة أبقى على 37 درجة مئوية والأنف في مخروط الآنف التخدير (راجع الخطوة 2، 6). تطبيق مرهم العين لتجنب جفاف.
- إزالة الشعر من الكامل مرة أخرى بحلق وتطبيق جل إزالة الشعر. الحرص على أن تتم إزالة جميع هلام بدهن الحيوان بعناية مع الاستفادة من المياه الدافئة من ناحية. الجاف للحيوان، وتنظيف الجلد مع الإيثانول 70%.
ملاحظة: هذا الإجراء الحلاقة يمكن أيضا أن يتم في اليوم قبل غرس نافذة. الكريم تحتاج إلى إزالتها تماما مع المياه الحارة من ناحية أن هذا يمكن أن يسبب تهيج الجلد. - علامة خط الوسط على العمود الفقري الماوس مع علامة لضمان تحديد المواقع متناظرة من الدائرة. تغيير موضع الماوس وسحب الجلد إلى رفرف استخدام خط الوسط كموقف قابلة لطي، وفهم وسط رفرف. تعيين موضع الإطار يكون الجزء العلوي من الإطار على الأقل 2 ملم تحت خط الوسط ودائرة منطقة عرض نافذة على الجلد مع علامة.
- استخدام حجم حامل/شفرة المبضع مقص 15 والمتناهية الصغر، إزالة الجلد على طول الخط الدائري مرسومة. احرص على عدم تلف لفافة الكامنة.
ملاحظة: وهذا يخلق مساحة عرض إطار الدائرة التي يتم زرعها الورم. - سحب ما يصل skinfold واستخدام تثقيب إذن لكمه ثقوب 1 ملم في القطر من خلال الجلد، وواحد على جانبي منطقة عرض (الشكل 1A-ب).
ملاحظة: هذه ثقوب البراغي اثنين لإصلاح أطر النوافذ معا. - ضع الإطار غرفة استقبال مصنوعة خصيصا باستخدام مسامير (الأرقام 1B-أ، ج 1B) وتعيين موضع الإطار الخلفي (الشكل 1B-ب) على البراغي. ضع المكسرات (الشكل 1B-د) من الإطار الخلفي على البراغي.
ملاحظة: تستخدم هذه البراغي لإصلاح الدوائر معا ضد skinfold وتستخدم في وقت لاحق شل الدائرة أثناء التقييم تحت المجهر. - سحب الجلد 2-3 مم فوق أعلى الإطارات وتأكد من أن منطقة عرض النافذة الأولى يطابق مساحة الدائرة. 23 مكان ز الإبر من خلال ثقبين خياطة صغيرة (الشكل 1B، السهم الأسود) في الجزء العلوي من الإطار. تشديد المكسرات على البراغي مع مفك براغي صغيرة (الشكل 1 أ-ج) وحامل إبرة لقط شل المكسرات.
ملاحظة: اتخاذ الاحتياطات اللازمة لضمان أن الجلد لا يستدير المسامير، ولا تشديد كثيرا. - استبدال الإبر بخياطة الجروح، بدءاً من الأعلى، لإصلاح الإطارات ضد الجلد. القيام بهذا لأزواج 5 ثقوب خياطة (الشكل 1B، السهم الأبيض) في الإطار.
- تشغيل الماوس لتكشف عن المؤخر الدائرة النافذة. ضع قطعة سميكة من الزجاج حشو مع قطرها 10 ملم وسمك 0.55 مم (الشكل 1B-e) ومن ثم كوب غطاء قياسية من 12 مم (الشكل 1B-f). تأمين هذه مع عصابة الاحتفاظ (الشكل 1B-ز) في منطقة الدائرة مرة أخرى.
ملاحظة: يمنع الزجاج حشو مساحة لفتح بين اللفافة والنافذة في الجانب الأمامي، الذي يستخدم للتصوير. - هيدرات ناحية عرض الإطار الذي سيتم إدراج الورم عن طريق ملء حقنه 1 مل مع العقيمة 0.9% كلوريد الصوديوم. تسمح بضع قطرات تقع في هذا المجال عرض. إزالة الملوحة الزائدة مع تلميح القطن معقمة.
- في اللفافة، إنشاء جيب كبيرة بما يكفي لعقد 1 مم3 ورم الجزء (الشكل 1A-أ) باستخدام إبرة ز 25 مع طرفها عازمة بزاوية 90 درجة (الشكل 1A-د). استخدام حامل الإبرة أو الملقط كيلي، إدراج الجزء ورم في وسط منطقة عرض النافذة الأولى في هذا الجيب.
- قم بإغلاق نافذة عرض المنطقة مع كوب غطاء قياسية من 12 مم، وحلقة من الاحتفاظ.
ملاحظة: يمكن أن تشكل فقاعة هواء، بل أنها سوف تختفي في غضون ساعات.
4-قبل والرعاية اللاحقة للحيوان
- إدارة المخدرات لتخفيف الألم (أي، البوبرينورفين 0.05 مغ/كغ) تحت الجلد كما أقرتها الخاص بك رعاية الحيوان المؤسسية واستخدام اللجنة. تسمح الماوس للتعافي من التخدير تحت مصباح تدفئة.
- ضع الفئران الحاملة لنافذة منفردة في قفص وفي غرفة التحكم في المناخ إلى 32 درجة مئوية وأعلى رطوبة 50%. تأكد من أن زجاجات المياه في درجة الحرارة البيئية قبل وضعها في القفص لمنع التسرب. استخدام الأقفاص والإثراء التي تسمح بالحركة دون عائق والوصول إلى الغذاء والماء.
ملاحظة: ما هو جيد جداً التغاضي عن هذه الدائرة النافذة، تظهر الفئران السلوك العادي. الإسكان الفردية يمنع الضرر إلى الدائرة النافذة الناتجة عن الفئران الأخرى، ويمنع ارتفاع درجة الحرارة/الرطوبة في التبريد لأسفل والجفاف skinfold. - تحقق من الماوس بشكل منتظم تمضغ قبالة خيوط، البراغي فضفاضة/المكسرات، أو كسر زجاج الغطاء. فورا إصلاح واستبدال عندما يحدث هذا. يمكن استخدام غطاء مصنوعة من مواد خفيفة لحماية الإطار.
5-إينترافيتال التصوير
ملاحظة: في هذا الإجراء، مجهر مولتيفوتون والبرنامج عنصر التحكم المناسب وتستخدم. هنا، يتم استخدام حزم البرامج التي تم توفيرها مع المجاهر. الرئيسية، أي حزمة البرامج التي تأتي مع مجهر والمقصود مجهر المراقبة والتقاط الصور سوف جناح هذا الغرض.
- التبديل على النظام: PC/المجهر، الطاقة لوحدة التحكم [كنفوكل]، ليزر للطاقة، والانبعاثات بالليزر. على سبيل المثال، مع هذا البرنامج، بدء تشغيل البرنامج وتهيئة جدول المجهر (الشكل 1E-أ و 1E-ج) عن طريق النقر فوق "تهيئة جدول." التبديل على النظام وتعيين فإنه إلى وضع تمكين جهاز الكمبيوتر للتحكم في المجهر، س ص-الجدول، z--لتحديد المواقع، والتقاط الصور.
- التبديل على ضوء الفلورسنت (الشكل 1E-ب).
ملاحظة: وهذا يستخدم لتقييم الصور الأسفار عن طريق العين إلى جانب حقل مشرق. - التبديل على منصة مصنوعة خصيصا، والتحكم في درجة الحرارة (الشكل ج 1-ج؛ وصف في المناقشة بمزيد من التفصيل) في 37 درجة مئوية.
- قم بالتبديل في وحدة التخدير باستخدام إيسوفلوراني/س2 (الشكل 1E-د). جبل أنبوب التخدير في مرحلة مجهر (الشكل ج 1-e). تثبيت المشبك المرحلة التي س وص لإصلاح قطعة آنف التخدير.
- تقييم ما قبل الحيوان تحديد مرحلة الورم سفينة التنمية؛ وهذا يعتمد على سرعة نمو الورم، ولكن فإنه يمكن أن تختلف بين الفئران الفردية.
- رصانة الماوس باستخدام المسكنات استنشاق (إيسوفلوراني/س2) في تشكيل غرفة تخدير (راجع الخطوة 2، 6).
- ضع الحيوان على منصة التحكم في درجة الحرارة التي شنت على مرحلة المجهر؛ وهذا ما يمنع تهدئة الحيوان عندما أنه تم تخديره. تأكد من الآنف الماوس يقع في المخروط التخدير وتطبيق مرهم العين إذا كان التقييم سوف يستغرق وقتاً أطول من 5 دقائق.
ملاحظة: لتقييم أطول من ح 1، الحد من تدفق isoflurane إلى 2%. - استخدم البراغي الدائرة لإصلاح (الشكل ج 1-ب، السهم كامل) الدائرة على حامل مصنوعة خصيصا دائرة (الشكل ج 1-أ). المسمار هذا الحامل (الشكل ج 1-د، سهم متقطع) إلى منصة ساخنة (الشكل ج 1-ج).
ملاحظة: يمنع هذا الجمع التحف الحركة في منطقة عرض النافذة بينما لا تزال تسمح للحيوان التنفس بحرية. - تأكد من تنظيف زجاج ناحية عرض الإطار مع تلميح القطن مغموسة في الماء لمنع صورة ضبابية والتدخل القادمة من الحطام على السطح الخارجي للزجاج. وضع منهاج والماوس على مرحلة مجهر (الشكل 1).
ملاحظة: العناية بأن الذيل لا تتعثر بين النظام الأساسي وفي مرحلة المجهر. - التحقق بصريا مرحلة التنمية السفينة الورم باستخدام 10 X عدسة الهدف، مشرق-حقل، والضوء الفلورسنت.
ملاحظة: يجب أن تكون السفن الفلورسنت في التركيز وتدفق الدم يجب أن تكون مرئية باستخدام حقل مشرق. عندما ينظر المفرج بشكل واضح، تقييم مرحلة الورم سفينة التنمية. على سبيل المثال، تحديد ما إذا كان هناك الأوعية بداية مبكرة مع نمو الخلايا تلميح أو المفرج تم إنشاؤها بالفعل لإيصال الأدوية. ويمكن تقييم الحيوان نفسه مرة أخرى، ورم التنمية عملية مستمرة. ويمكن ملاحظة عدة مراحل في ورم واحد في نفس الوقت.- عندما لا يكون من الممكن للتركيز على المفرج، إزالة الحيوان من المرحلة، السماح باسترداد الماوس، ومكان الحيوان مرة أخرى في مساحة التحكم في المناخ. التحقق من ذلك مرة أخرى في وقت لاحق. عندما يكون الماوس جاهزة للتقييم، تواصل العملية الموضحة أدناه.
- التبديل الليزر [كنفوكل] ولوحة التحكم عن طريق النقر فوق "الليزر" الفريق "Ctrl" في علامة التبويب التكوين
ملاحظة: من المستحسن تعيين قوة الليزر منخفضة، خاصة بالنسبة لليزر الأرجون، لمنع تبييض، التدفئة من الأنسجة، ود. يمكن تعيين لوحة التحكم إلى تفضيلاتك الشخصية. للتصوير إينترافيتال باستخدام فلوروفوريس متعددة من المستحسن لتطبيق الإعدادات التالية: "ذكية" مكسب، 100 V كل بدوره، "ذكية" الإزاحة، 10% لكل دورة، "تكبير/تصغير، متوسطة،" "موضع س، متوسطة،" "موقف Y، متوسط،" و "موقف Z، 100 ميكرومتر كل بدوره". قبل التصوير، وضبط الإزاحة لتقليل الضوضاء وتحسين نسبة الإشارة إلى الضجيج. وظيفة التكبير [كنفوكل] يسمح لتكبير العالي دون تغيير العدسات والهدف. مراقبة X و Y و Z ضروري لتحديد المجالات ذات الاهتمام. للفحص المجهري إينترافيتال، ينبغي Z--تحديد المواقع حوالي 100 ميكرومتر كل بدوره كما يتم تقييم الأنسجة القراد. - انقر على "شراء" في علامة التبويب اكتساب وتغيير الإعداد إلى: "اكتساب وضع XYZ أو إكسيزت," "تنسيق (512 × 512 أو 1024 × 1024)"، و "السرعة (400 أو 200 هرتز)." انقر فوق "الثقب" وتعيينه إلى 1 وحدة متجددة الهواء. انقر فوق "ثنائي الاتجاه" X ".
ملاحظة: لتحسين الصور، بين طاقة الليزر، والكسب، والثقب يجب أن توازن، مما هو مذكور في المناقشة. - عند تقييم متعددة فلوروفوريس، حدد "التفحص متسلسلة" و "بين الإطارات" لمنع التسييل من خلال، مما هو مذكور في المناقشة. اختر "خط متوسط 4" للحصول على تخفيض الضوضاء جيدة.
ملاحظة: اعتماداً على الأسفار الجوهرية الموجودة في الحيوانات المحورة وراثيا، علامات مضيئة أخرى، مثل ديكسترانس، هويشت، فيتك-جيش صرب البوسنة، وتشريعات الفلورسنت، و/أو جسيمات نانوية المخفف للتركيز المطلوب في 0.9% كلوريد الصوديوم يمكن أن تكون إدارة وتقييم في الورم. هذه هي حقن عن طريق الوريد القضيب أو الذيل. - انقر على "التجربة" في علامة التبويب الاكتساب واختر "جديد" لقاعدة بيانات جديدة.
- تقييم استخدام الحيوان، اعتماداً على السؤال البحثي، 10 X 20 X أو 40 س الهدف العدسات. عن طريق العين، إيجاد موقف لتقييم.
ملاحظة: من الأفضل استخدام عدسات الجافة مع نا عالية كما العدسات الممكنة، كما الجافة قد عمل طويلة نسبيا عن بعد ولا عدم الحاجة إلى غمر السائل. في المناقشة، استخدام العدسات الهدف غمر المياه المذكورة. - استخدام مسح حية سريعة للعثور على كسب السليم وإزاحة لمنع التعرض المفرط وتحسين نسبة الإشارة إلى الضجيج. أيضا، الحفاظ على نفس إعدادات التصوير أثناء وبين التجارب إذا كانت هناك حاجة لمقارنة كمية.
ملاحظة: اعتبارات أخرى للتصوير المثلى هي المذكورة في المناقشة. يمكن الانتهاء من موقف XYZ والتكبير أثناء الفحص حية باستخدام لوحة التحكم. - لجعل Z-كومة، حدد "Z-المكدس" في التبويب الحصول على جعله Z-مسح سريعة استخدام Z-الموقف في "لوحة التحكم" وتعيين بداية ونهاية للفحص بواسطة النقر فوق "بدء ميكرومتر" و "نهاية ميكرومتر." تعيين حجم Z-الخطوة المتصلة بحجم الثقب.
- التقاط الصور بواسطة النقر فوق "ابدأ".
ملاحظة: الفحص المجهري إينترافيتال كل شيء عن حركية والعمليات الحيوية ولذلك يلاحظ، حلاً وسطا بين الوقت اللازم للحصول على صورة ويجب أن يتم السرعة للعمليات البيولوجية. وبوجه عام، ارتفاع القرار، قنوات أكثر الفلورسنت الممسوحة ضوئياً وأكبر في المسح الميداني، البكسل أكثر في الصورة. ترجمة سمكا Z-مداخن لوقت أطول من تصوير. يزيد من فرصة للتحف الحركة وقتاً أطول من تصوير وقد تسبب ضررا للأنسجة تصويرها. أيضا، أن تدرك أن مسح بعض التسميات الفلورسنت يسبب ابيضاض وسمية، التي تتأثر بقوة الليزر وتركيز الصبغة المتراكمة. - بعد مسح Z-المكدس يمكن بسرعة تقييمه بواسطة النقر فوق "إسقاط القصوى". ض-المكدس يتم حفظها تلقائياً في قاعدة البيانات، ويمكن إعادة تسميته.
6-بيانات التحليل
- اعتماداً على مسألة البحث الأصلي، استخدام واحدة من عدة برامج، مثل إيماجيج5, Matlab11، أو أميرة، لتحليل البيانات. التحليل الصحيح أمر حاسم.
Representative Results
السمة الرئيسية لتصوير إينترافيتال هو التصور طولية من العمليات الخلوية دون تدخل الغازية. لهذا، تستخدم الحيوانات المحورة وراثيا معربا عن علامة نيون التأسيسي أو إيندوسيبلي في خلايا فائدة. ويبين الشكل 2 التعبير عن تسميات الفلورسنت في انوستاج-أخضر نيون البروتين (بروتينات فلورية خضراء)9 وروزا متمج الماوس خطوط10. بروتينات فلورية خضراء-انوستاج هو خط ماوس التي تم إنتاجها داخليا باستخدام جينات انوش مبتوراً كعلامة للتجارة والنقل. الأهم من ذلك، هو الغاية أعرب عن انوش في خلايا بطانية، وينظر إشارة بروتينات فلورية خضراء بشكل واضح في ال اجولجي والغشاء الخلوي (الشكل 2A). وقد متمج روزا الفئران اليل مراسل لجنة المساواة العرقية المستهدفة للغشاء fluorescence اللونين. هذا الخط تعرب عن متوماتو fluorescence في انتشار الخلايا ومجفب في خلايا معربا عن ريكومبيناسي لجنة المساواة العرقية وإلى حد كبير يستخدم لتتبع النسب. كما يتم زرع قطعة ورم من المانحين غير المعدلة وراثيا، ومضان أحمر غالباً يعبر عن الأجزاء اللحمية في الورم (مثلاً في غشاء الخلايا والأوعية الدموية، وتعميم خلايا، تسلل خلايا الدم، والمرتبطة بورم الليفية (الشكل 2)).
أحكام تنظم تشكيل السفينة، ونموذجا رائعا لدراسة هذا ال12،الشبكية النامية13. أيضا، هو نمو الورم السفينة عملية حركية التي تشبه من حيث المبدأ للتنمية السفينة الشبكية. بيد أن السفن الورم تفتقر إلى المنظمة وكما يعيد البناء ورم بشكل مستمر، وذلك هو المفرج المرتبطة بالورم. هذا يمكن أن يكون لها مزايا عند استخدام الورم كنموذج الأوعية، كما يمكن غالباً ما توجد جميع مراحل التنمية السفينة في الورم نفسه في نفس الوقت. وتشمل هذه جبهة تبرعم غشائي ينمو إلى الأمم المتحدة فاسكولاريزيد جزء من الورم (الشكل 2)؛ الأوعية التالفة (الشكل 2D)؛ وسرير الأوعية الدموية المتبعة (الشكل 2E-أنا) مع ناضجة، تشعبت السفن (الشكل 2E-ثانيا). ومع ذلك، يمكن أيضا الاطلاع على الأوعية خلايا بطانية في هذه المجالات. عندما يحفزه المحفزات الأوعية، خلية غشائي يبرز فيلوبوديا (الشكل 2E-الثالث) ويمكن المضي قدما في خلية تلميح، باستخدام هذه فيلوبوديا للمسح واتجاهات الهجرة (الشكل 2E-الرابع). هذه الخلية نصيحة تهاجر إلى إينتيرستيتيوم الورم وتبعتها تقسيم خلايا ساق. خلية تلميح غشائي واحد عدة توسيع فيلوبوديا وتراجعه وتجديد في أي وقت، ويمكن أن يتم تعقب استخدام الفحص المجهري إينترافيتال (الشكل 2 واو).
ثانيا، يمكن استخدام الفحص المجهري إينترافيتال لتحديد تشكيل التجويف في جبهة الأوعية، والدم تدفق طوال الورم، والتسرب. اعتماداً على الفعل حتى الآن إشارات الفلورسنت المتأصلة في الحيوان، يمكن إدارة المركبات الفلورية مختلفة. تدفق الدم والتسرب يمكن تصور استخدام هويشت، ديكسترانس نيون أو فيتك-جيش صرب البوسنة. الدراسات الموسعة في التسرب الدم تدفق والجسيمات، المسمى دوران طويلة فلوريسسينتلي سي جسيمات نانوية من 100 نانومتر يمكن استخدامها. للحصول على مزيد من التفاصيل المتعلقة بإعداد هذه الجسيمات النانوية، انظر منشور سابق5. ويتجلى توظيف هذه المركبات في الشكل 3. نصيحة غشائي الخلايا في ماوس متمج روزا يمكن رؤيتها بوضوح غزو أنسجة الورم. ويتجلى تدفق الدم الوظيفية fluorescence الأرجواني لجسيمات نانوية حقن عناصره في تجويف الأنابيب والأوعية الدموية (الشكل 3 ألف--أنا). عن كثب إلى جسيمات نانوية نصيحة غشائي الخلايا التي توضح تشكيل التجويف في منطقة الخلية ساق (الشكل 3A-ثانيا). تقديم تشريعات تدار النظامية يعتمد على المفرج فنية بغية التوصل إلى إينتيرستيتيوم الورم، وكما هو موضح في الشكل 3، وكلاء القابلة للحقن، مستقلة عن حجمها، لا تخترق المناطق مع السفن المدمرة، سفن مضغوطة، أو السفن مع ركود الدم.
في معظم الأجهزة، بطانة غشائي يشكل حاجزاً وظيفية بين الدم والأنسجة الكامنة، وأحكام تنظم مرور الجزيئات. المفرج المرتبطة بورم، ولكن من المعروف أن راشح، ووقف إنتاج حجم المسام يتوقف إلى حد كبير على نوع الورم14. يمكن حقن ديكسترانس نيون مترافق مع أحجام مختلفة لتقييم تدفق الدم، النفاذية، والتسرب. هويشت (615 دا) ينشر سريعاً في أنسجة الورم ويتم تناولها بالخلايا المحيطة بها (الشكل 3-أنا). بعد وقت قصير من الحقن، توجد ديكستران كاتشين 10 (الشكل 3CII) و 2 نجمة داود الحمراء (الشكل ج 3-الثالث) في الدم. ومع ذلك، المسند ديكستران كاتشين 10 يعتبر أيضا في إينتيرستيتيوم الورم، مما يشير إلى نفاذية بطانة بطانية للجزيئات الصغيرة، التي سمة من سمات سفن الورم. كذلك انخفضت 40 دقيقة بعد الحقن (الشكل ج 3-رابعا)، يتم مسح كاتشين 10 من مجرى الدم (الشكل ج 3-V)، وشدة الفلورسنت 2MDa ديكستران ديكستران (الشكل ج 3-السادس). ومع ذلك، لا توجد ديكسترانس كبيرة في إينتيرستيتيوم الورم، مما يدل على عدم نفاذية للجزيئات الكبيرة داخل هذا الإطار الزمني.
ورم الفيزيولوجيا المرضية، مع مجالات عالية المتكاثرة ونخريه و vascularized الأمم المتحدة، يمكن أن تكون مفيدة جداً عند استخدام الورم كنموذج للأوعية. بيد أن هذا يمثل مشكلة بالنسبة لفعالية العلاج والتحقيق. عدم تجانس المفرج المرتبطة بورم يسبب توزيع غير متجانسة من المخدرات التي تدار، ترك كامل المناطق خالية من المخدرات15. لتحسين إيصال المخدرات، عدة استراتيجيات يمكن أن تطبق15،،من1617، ويمكن أن يتم فحص التقدم العلاجي باستخدام هذا التصميم إينترافيتال. يمكن التلاعب بها المفرج المرتبطة بالورم باستخدام وكلاء فعال في الأوعية لتحسين إيصال المخدرات17. نتائج التلاعب سفينة الورم باستخدام ألفا نخر الورم (تنف) كعامل فعال في الأوعية في تركيبة مع دوكسيل، ترد صياغة الاسمافرون مغلفة ميتوتريكسات، كعامل العلاج الكيميائي في هذه المخطوطة5، 18 , 19-وعلى النقيض من ديكسترانس، مصنوعة جسيمات نانوية سي أن تعمم لعدة ساعات، أن لم يكن يوما، في دوران الدم20.
كما ذكر سابقا، يمكن أن تكون منطقة الورم الممسوحة مسبقاً لتحديد مجالات الورم الصحيحة اعتماداً على السؤال البحثي. ويمكن تقييم مصير المخدرات في المناطق مع المفرج فنية مقابل المجالات مع سرير واحد الأوعية الدموية تالفة الفعل (البيانات لا تظهر). للتحقيق في المصير وكلاء العلاج الكيميائي دون تدخل السامة للخلايا، يمكن استخدام الجسيمات النانوية مع نفس تكوين وكيل العلاجية كدواء نموذجي. حيوان انوستاج-بروتينات فلورية خضراء رابعا تعامل مع هذه الجسيمات النانوية وتصويرها 24 ساعة في وقت لاحق. جسيمات نانوية كانت لا تزال موجودة في المفرج، مع الحد الأدنى من التسرب إلى إينتيرستيتيوم الورم (الشكل 4A-أنا). ولكن، عندما كانت تدار جسيمات نانوية في تركيبة مع تنف، لوحظ التسرب من مجرى الدم إلى الورم إينتيرستيتيوم (الشكل 4A-ثانيا)، زيادة إيصال الأدوية إينتراتومورال. باستخدام الدقة الهدف العدسات، التعريب داخل الخلايا من مركب يمكن التعرف عليه، كما هو موضح هنا بالموقع النووي من هويشت في خلايا بطانية الأخضر وخلايا من ورم إينتيرستيتيوم (الشكل 4 باء). وعلاوة على ذلك، كما العديد من وكلاء العلاج الكيميائي، مثل ميتوتريكسات، إينتيركالاتي مع الحمض النووي، يمكن تقييم الترجمة لهذه المركبات. ميتوتريكسات خصائص الفلورسنت الأحمر، ويمكن أن يكون المسمى في nanocarrier مع، على سبيل المثال، فوق كلورات تيتراميثيليندوتريكاربوسيانيني (فعلت). تم حقن حيوان انوستاج-بروتينات فلورية خضراء رابعا مع دوكسيل-هل في تركيبة مع تنف، وتم أخذ صور 24 ساعة بعد العلاج. دوكسيل-اكسترافاساتيد من الأوعية الدموية، وقد اتخذ بورم الأنسجة المحيطة (الرقم 4--أنا). إجراء تقييم أكثر تفصيلاً للخلايا المفردة (الشكل 4 ج-ثانيا) أظهرت أنه يمكن الاطلاع على الناقل في السيتوبلازم، بينما لوحظ ميتوتريكسات المفرج عنهم في النواة الخلوية.
رقم 1: الصكوك، الظهرية skinfold الدائرة، وإعداد المعدات اللازمة لهذا الإجراء. (أ) الورم شظايا (أ) والأدوات الجراحية اللازمة لغرس. هي صكوك غير قياسي تثقيب إذن (ب)، وسائق المسمار الصغير (ج)، وابرة بنت (د). (ب) الظهرية skinfold إطار الدائرة. الجانب الأمامي (أ) والخلفي (ب) الإطار (السهم: ثقوب لخياطة الجروح؛ ورأس السهم: ثقوب البراغي)، مسامير 2 (ج)، المكسرات 2 (د)، وزجاج حشو 1 (ه) و 2 غطاء النظارات (f) و 2 الاحتفاظ بالخواتم (ز). أيضا، الاحتفاظ بالحلقات دون خطاطيف (السهم الأبيض) يمكن استخدامها عند الحاجة. (ج) الدائرة مصنوعة خصيصا حامل (أ)، مسامير لحامل الدائرة للدائرة (ب)، منصة التحكم في درجة الحرارة (ج)، مسامير لتأمين صاحب الدائرة على منصة (د)، وأنبوب حامل مع التخدير (ه). الحيوان (د) شنت في حامل الدائرة على المنصة. ورم B16BL6 (السهم) مرئياً في منطقة عرض النافذة. (ﻫ) المعدات اللازمة للتقييم إينترافيتال. الكمبيوتر مع التصوير ومجهر مراقبة البرمجيات (أ) معيار الفلورية الخفيفة (ب) والمجهر. وكان مولتيفوتون [كنفوكل] (ج) المستخدمة مع وحدة تخدير (د). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 2: fluorescence الجوهرية للحيوانات المحورة وراثيا- كل الصور المعروضة هنا إسقاطات Z-المكدس بين 50 و 70 ميكرومتر سميكة. (أ) في السطر العلامة انوسجفب، يعبر عن التجارة والنقل في غولجي (العلامة النجمية) وغشاء الخلية (السهم) من خلايا بطانية. شريط المقياس = 100 ميكرومتر-(ب) الإعراب Intratumoral متوماتو في السطر متمج روزا في الأغلب في غشاء خلية من خلايا الأوعية الدموية (سهم) وخلايا الدم (العلامة النجمية). شريط المقياس = 100 ميكرومتر. (ج) بإسقاط جبهة الأوعية المتزايد إلى الورم فاسكولاريزيد الأمم المتحدة. شريط المقياس = 100 ميكرومتر. (د) بإسقاط جزء من الورم مع السفن المنشأة والتالفة (العلامة النجمية). (ﻫ) إسقاطاً للورم المنشأة المفرج (الصناعات الاستخراجية) تظهر علامة النضج السفن (برايم)؛ الأوعية نصيحة غشائي الخلايا مع فيلوبوديا (آيي، رأس السهم)؛ وسفينة ناضجة، التي يمتد خلية بطانية واحدة فيلوبوديوم (إيف، رأس السهم) إلى إينتيرستيتيوم. شريط المقياس = 100 ميكرومتر. (و) حركة فيلوبوديا، اتباعها ح 1. واتخذ كل 15 دقيقة، كدسة Z؛ ويرد هنا إسقاطاً كحد أقصى. يتم توسيع فيلوبوديا (السهم الأبيض)، ركود (=)، التراجع (السهم الأحمر)، أو تختفي تماما حتى (-). شريط المقياس = 25 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 3: إدارة تسميات القابلة للحقن لتوضيح التسرب وتدفق الدم. تم حقن (A) A روزا متمج الماوس مع الأرجواني جسيمات نانوية الفلورسنت، واتخذ Z-كومة جبهة خلية تلميح الغازية 10 دقيقة في وقت لاحق (منظمة العفو الدولية). إسقاط تبين أن معظم غشائي قد براعم تجويف وظيفية (أخي، السهم). إلا في حالات نادرة يمكن رؤية براعم غشائي دون تدفق (أخي، رأس السهم). شريط المقياس = 250 ميكرومتر. (ب) هذا الإسقاط Z-المكدس يظهر منطقة سفينة دمرت ورم في حيوان انوستاج-التجارة والنقل قبل المعالجة (مرتين). تم حقن الحيوان بجسيمات نانوية (الأرجواني، BII) وهويشت (أزرق، بيي). جسيمات نانوية وهويشت لا تصل إلى المناطق المدمرة، يتبين من الحطام خلية حبيبات لا تزال تعرب عن التجارة والنقل. شريط مقياس = 250 ميكرومتر. (ج) تم حقن ماوس انوستاج-التجارة والنقل مع ديكسترانس اثنين من مختلف الأحجام (أحمر = "ديكستران 2 نجمة داود الحمراء"؛ والأرجواني = ديكستران 10 كاتشين) وهويشت (الأزرق = دا 615)، ويتم عرض صور طائرة واحدة هنا. وتعتبر 10 دقيقة بعد الحقن، والوجود في الدم والتسرب في نفس الصورة. هويشت اكسترافاساتيس على الفور تقريبا من الأوعية الدموية، ويتم تناولها بالخلايا المحيطة بها (CI). يمكن رؤية كاتشين ديكستران 10 (الاتحاد) في السفن وفي إينتيرستيتيوم الورم. يمكن الاطلاع على ديكستران 2 "نجمة داود الحمراء" (سيي) في الأوعية الدموية. 40 دقيقة بعد الحقن (العاجي)، يختفي كاتشين ديكستران 10 من الدم (CV)، وشدة الفلورسنت "ديكستران 2 جمعية نجمة داود الحمراء" أيضا تقلص (السيدا). شريط المقياس = 100 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4: التحقيق في مصير وكلاء العلاج الكيميائي- (أ) حيوان انوستاج-بروتينات فلورية خضراء رابعا تعامل مع جسيمات نانوية وتصويرها 24 ساعة في وقت لاحق. جسيمات نانوية لا تزال موجودة في السفن، مع الحد الأدنى من التسرب في ورم إينتيرستيتيوم (منظمة العفو الدولية). عندما يتم الجمع بين جسيمات نانوية تنف، لوحظ التسرب من مجرى الدم إلى الورم إينتيرستيتيوم (أخي). شريط المقياس = 250 ميكرومتر. (ب) استخدام عدسات ذات الدقة العالية، والسيتوبلازم غشائي (الأخضر)، ونواة (الأزرق) من خلية مفردة يمكن التعرف عليه. شريط المقياس = 50 ميكرومتر. (ج) حيوان انوستاج-التجارة والنقل تم حقن الرابع مع دوكسيل-هل في تركيبة مع تنف، وتم أخذ صور 24 ساعة في وقت لاحق. هنا، والتسرب من دوكسيل-هل الخروج من السفن إلى الورم إينتيرستيتيوم هو واضح (CI). إجراء تقييم أكثر تفصيلاً للخلايا المفردة (الاتحاد) يبين أن الناقل الأرجواني يمكن العثور في السيتوبلازم (السهم)، بينما يلاحظ ميتوتريكسات المفرج عنهم (أحمر) في النواة الخلوية (رأس السهم). شريط المقياس = 50 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Discussion
كما الورم والورم سفينة التنمية، فضلا عن الآثار العلاجية الورم، عمليات ديناميكية للغاية، التقييم إينترافيتال أداة أنيقة لجعل تقييم صحيح لهذه العمليات بطريقة تعتمد الزمنية ومكانية. مع زيادة توافر علامات خلية حية وخلق الحيوانات المحورة وراثيا، والنهوض بأساليب التصوير، تصوير إينترافيتال أصبحت أكثر وأكثر شعبية. على الرغم من أن علم الأنسجة بشكل روتيني لا يزال يستخدم، ويمكن استخدام العديد من علامات تحديد الخلايا والهياكل، تقطيع الأنسجة له العيوب عند التحقيق في العمليات الحيوية. مطلوب تشريح الأنسجة، توفير معلومات ثابتة فقط؛ تثبيت يؤثر على نوعية النسيج؛ وتقطيع الأضرار التفاعلات الخلوية. أيضا، عند التحقيق في العمليات الحيوية، يتطلب تشريح الأنسجة في نقاط زمنية مختلفة، وكثيراً ما يفترض، كمية كبيرة من الحيوانات. مع التصوير إينترافيتال، يمكن تقييم الأبعاد المكانية XYZ وبعدا إضافيا من الزمن في الحيوان نفسه، مما يجعل تحديد المواقع المناسبة لمختلف اللاعبين الممكن في المكان والزمان. ولذلك، لا غاب عن النقاط الزمنية المثلى، وإلى حد كبير هو خفض عدد الحيوانات المستخدمة لكل تجربة. ثانيا، يمكن استقراء النافذة الزمنية المنشأة مع التقييم إينترافيتال لتحسين استخراج الأنسجة. ثالثا، يمكن تحديدها إينترافيتالي مرحلة النمو السفينة المطلوب والملون كنسيج كل جبل.
تصميم إينترافيتال المذكورة في هذه المخطوطة يستخدم مزيجاً من الحيوانات المحورة وراثيا معربا عن تسمية فلورسنت في خلايا بطانية، تعديل الظهرية skinfold الدائرة النموذجية، ومجهر مولتيفوتون [كنفوكل] مخصصة.
خلايا بطانية الذهاب من خلال عدد من المراحل21،22 خلال الأوعية، وهذه المراحل غالباً ما يتبين في وقت واحد في ورم. استخدام السطر الماوس انوستاج-التجارة والنقل، يمكن اتباعها من خلايا بطانية الفردية، ويمكن تتبع حتى فيلوبوديا ديناميات. ومن ثم نموذجا جيدا لدراسة التنمية السفينة إينترافيتالي. اعتماداً على التسميات مضمن مسبقاً إلى الوقت الحاضر، يمكن استخدام وكلاء الفلورية القابلة للحقن لتقييم تشكيل التجويف وتدفق الدم، والتسرب، وتطهير الدم. يتم تصويرها الماوس باستمرار ليصل إلى 5 س. من الممكن تقييم طويلة الأجل للحيوان عندما يتم اتخاذ احتياطات عدة فيما يتعلق بتخدير الحيوان، الذي كان وصف سابقا23. كما تركز هذه الأبحاث على السرطان، تم زرع أورام الأنسجة أو الخلايا. ومع ذلك، نحن أيضا جربت الامشاط والرئتين الجنينية. ومع ذلك، معدل نمو الأنسجة قيد الدراسة هو الحد، بعد بضعة أسابيع، يبدأ الجلد لتنمو، الذي يمكن أن يكون مشكلة مع الأورام بطيئة النمو أو الأنسجة.
أثناء مرحلة التحقق، الظهرية skinfold نافذة غرفة تعديل إلى حد كبير مقارنة ب النموذج التقليدي4. الإطارات هي التي شيدت من المواد الاصطناعية أوتوكلافابل والخفيفة والصغيرة، مع مساحة لعرض نافذة كبيرة. هوك للحلقة من الاحتفاظ (الشكل 1Bg، رأس السهم الأبيض) يستخدم فقط لإزالة سهلة من الطوق. يمكن استخدام الحلقات التجنيب دون خطاطيف عند هذه تتداخل مع التصوير. الجلد لا تمتد كثيرا، والتيسير لا يحدث في هذا النموذج، والالتهابات إلا نادراً. هذه التعديلات الحد من إزعاج الحيوانات وتحسين الإجراء الحيوانية إلى حد كبير. أيضا، يمكن إزالة الأجزاء المعدنية بسهولة عند التصوير الورم باستخدام التصوير بالرنين المغناطيسي24.
يمكن اعتماد أي مجهر إينترافيتالي الصورة الظهرية الدوائر skinfold. الشرط الرئيسي هو المساحة المتوفرة بين مرحلة مجهر وعدسة الهدف. من جوانب هامة التي تؤثر على تصوير الحركة. لمنع حركة القطع الأثرية، وينبغي استخدام منصة التي تناسبها في الجدول المجهر (بعد إزالة جميع إدراجات) ويدعم الماوس. فإنه ليس من الضروري لكبح جماح الماوس عندما يكون تحت التخدير، وأنه من الأفضل ترك الماوس التنفس بحرية. ومع ذلك، هو انسحب النافذة إلى ساحة، إعطاء التثبيت الأمثل لمجال الرؤية (أي الورم مرئياً من خلال الدائرة النافذة). يتم تسخين المنهاج باستخدام منصة إلكترونية تدفئة، كما تستخدم لتدفئة الحيوان. هذا المنهاج داخل المنظمة، ويمكن الحصول على التفاصيل عند الطلب. عدسة الهدف عالية الدقة هو ضرورة عند تقييم العمليات داخل الخلية، ويجعل من الممكن لتميز بين السيتوبلازم والنواة. استخدام عدسة مدبب مع الدقة بصرية جيدة (نا عالية) لكن طويلة نسبيا العمل عن بعد (يفضل أن يكون 2 مم أو أعلاه) ينصح. القيد في التصوير من الاختراق عمق وكثافة فلوري من بطاقات العنونة. وعلاوة على ذلك، يجب تجنب فوتوبليتشينج، الضيائية، وتشبع أثناء التصوير.
واستخدمت هنا، متكاملة من [كنفوكل] مولتيفوتون ومجهر [كنفوكل]. مولتيفوتون تستقيم، في حين [كنفوكل] مجهر مقلوب. ميزة المجهر تستقيم هي سهلة الاستخدام للعدسات غمر المياه. هذه العدسات لها نا عالية وطويلة المسافة العمل، حتى في تكبير عالية (مثلاً 20 أو 40 س). على وجه التحديد، من المستحسن الحصول على عدسة غمر مياه 1.0 نا س 20، الذي يباع في عدة شركات. أن ندرك أنه عندما يتم استخدام عدسات الغمر، عدسة الهدف وغمر السائل تحتاج إلى يتم تسخينها إلى 37 درجة مئوية. لأفضل الصور، من المستحسن استخدام الإعدادات المثلى [كنفوكل] (أي الثقب في 1 وحدة متجددة الهواء، الليزر طاقة منخفضة قدر المكاسب المحتملة، ليست عالية جداً (لا سيما إذا كان الكسب يدخل الضوضاء)، خط السرعة كحد أقصى، ولا في المتوسط من الأشعة). التعرض المفرط والتشبع، والفرق بين الصور في كثافة خرق نوعية البيانات. من المستحسن لمنع التعرض المفرط والتشبع. وهذا يمكن التحايل عليها بالحصول على الصور في اكتساب مختلف الإعدادات. تغيير الكسب هو أسهل طريقة لتغيير سطوع الصورة. إذا لزم الأمر، يمكن تعديل قوة الليزر. لتوحيد جودة الصورة، ويمكن استخدام الشرائح بكثافة fluorescence ثابتة. واحد يجب أن نضع في اعتبارنا أن حتى عندما يتم تعيين المجهر على النحو الأمثل، يتم تحديد جودة الصورة إلى حد كبير بنوعية الدائرة النافذة والأنسجة
عند مسح علامات مضيئة متعددة في وقت واحد، التسييل خلال، التي تم الكشف عن فلوروفوري واحد في قناة واحدة أخرى، ويجب تجنب. تجنب التسييل خلال باستخدام مزيج من فلوروفوريس مع الحد الأدنى من أطياف متداخلة ومتتابعة المسح بين الإطارات. تم تفحص الصور المعروضة هنا باستخدام عمليات التفحص متسلسلة 3 (المسار 1: التجارة والنقل، فعلت أو fluor647 مع الليزر 488 و 633؛ المسار 2: والرودامين، دوكسيل أو متوماتو مع الليزر 543؛ وتتبع 3: هويشت مع الليزر 405).
ويرد هنا إمكانية تقييم عدة مراحل الورم سفينة التنمية ونصيحة خلية حيوية، وتشكيل التجويف، والتسرب، وتلف الأوعية الدموية. استخدام خط انوستاج-التجارة والنقل، وتكتشف مناطق الورم مع سرير الأوعية الدموية مدمرة بسهولة بحبيبات بقايا الخلوية لا تزال تعرب عن التجارة والنقل. تم الكشف عن لا عامل عن طريق الحقن في هذه المناطق، مما يشير إلى عدم وجود تدفق. وهذا يعني أن إدارة وكلاء العلاج الكيميائي سوف لا تصل إلى هذه المناطق أما. ومع ذلك، يمكن تدمير السفينة أيضا نتيجة علاجية. التقييم المسبق للورم، للتحقق من تدمير السفينة قبل المعالجة، هو شرط أساسي لتقييم علاجية دقيقة ويمكن بسهولة إجراء استخدام هذا التصميم التجريبي.
وهناك عدد كبير احتمالات التي يمكن استخدام الفحص المجهري إينترافيتال، ومناقشة مفصلة خارج نطاق هذا المنشور. لإعطاء فكرة موجزة، والتطبيقات الممكنة تشمل دراسات عن تراكم تشريعات في أنسجة الورم، وتطوير السفن (مثلاً، العدد من السفن، والفروع، وتقاطعات) وتدفق الدم، والتفاعلات خلية خلية، خلية الاستهداف، وتجهيز داخل الخلايا، فضلا عن الأمثلة المذكورة أعلاه وهو موضح هنا. كما يستند التحليل إلى الأسفار، أن ندرك شدة تقلبات بسبب نوعية الإطار أو الأنسجة. الأسفار من أعلى أو أسفل الطائرة من العرض أيضا، ورم الأنسجة سميكاً نسبيا، له تأثير على الإشارة في الصورة. فمن الأفضل الجمع بين التحليل الكمي الصورة مع القياسات موضوعية. على سبيل المثال، إذا كانت مهتمة بتركيزات المخدرات، إزالة ورم الأنسجة من النافذة بعد الفحص المجهري إينترافيتال وتحديد الدواء المحتوى باستخدام مع [هبلك] لمقارنتها بالصور [كنفوكل].
يمكن إجراء تقييم استجابة الورم بشكل جيد باستخدام هذا النموذج، ولكن مع بعض الاحتياطات. يجب أن يدرك المرء أن ينمو أيضا الأورام إلى الداخل، في الجلد. ويمكن إجراء قياسات ثلاثية الأبعاد إذا كان الاختراق العميق ما يكفي لتغطية كامل الورم. وفي هذه حالة، يجب استخدام الأصباغ استعملنا. قاعة نافذة كالموضحة هنا يتعامل مع الأورام في بيئة جلد، ومن المهم أن نشير إلى أن الإطار يحافظ على درجة حرارة أقل قليلاً من درجة حرارة الجسم الماوس العادية. ولذلك، فمن الأفضل لدراسة الأورام في الإعداد البيئي الصغير حق إلى تأكيد الدراسات إينترافيتال مع الظهرية skinfold إطار الدائرة. الأهم من ذلك، الظهرية الدائرة skinfold يقدم نظرة ثاقبة حركية العمليات والآليات، يوفر أساسا مفيداً لتحسين العلاج. أيضا، يمكن الحصول على معلومات إضافية بشأن بيوديستريبوشن والدوائية. تقليديا، يتم تنفيذ هذه الدراسات بيوديستريبوشن بعلاج الحيوانات الحاملة للورم وتشريح الأورام/أجهزة لقياس الإقبال على المخدرات. باستخدام هذا النموذج إينترافيتال، ويمكن توفير موقع إينتراتومورال للمخدرات (أي داخل الأوعية، إينتراتومورال، داخل الخلايا، أو النووية)5،،من2526. ليس فقط هو موقع المخدرات كشفت، ولكن أيضا الوقت النافذة-من-الفرصة للاستفادة المثلى.
استخدام التصميم التجريبي الموضحة في هذه المقالة، يمكن تقييم مجموعة واسعة من المعلمات في إعداد الزماني والمكاني. على وجه التحديد، نعرض هنا أن إينترافيتال المجهري يوفر أفكاراً هامة في ديناميات التنمية السفينة الورم والاستجابة العلاجية.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
نود أن نشكر هابيرين فإن رين وكروم دي ريني لتنميتها والتبرع بخط انوستاج-التجارة والنقل، جوست أ فب Rens لمساعدته التقنية مع عمل الحيوان، والقائمين على رعاية الحيوان للمساعدة. مرافق الفحص المجهري المستخدمة جزء من مركز التصوير الضوئي إيراسموس، ونود أن نشكر موظفي منظمة المؤتمر الإسلامي لخدمتهم. هذه الدراسة كانت تدعمها منحة 2000 دك-2224 من جمعية السرطان الهولندية، "Vereniging تروستفوندس" جامعة إيراسموس في روتردام، و "Stichting إيراسموس هيلكونديج كانكيرونديرزوك"، ونحن نشكر أعضاء اللجان على التبرع السخي.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Sigma | D1145 | Supplemented with 10% FCS |
| Trypsin-versene (EDTA) | Lonza | BE17-161E | Make a 0.1% solution in PBS, sterile |
| PBS | |||
| Window frames | Costum made | ||
| Filler glass 10 mm, 0.55 mm | Abrisia technologies | ||
| Cover glass 12mm, #1 thickness | Thermo Scientific/VWR | 631-0713 | |
| Hear removal gel (veet) | for sensitive skin | ||
| Eye ointment | |||
| Buprenorfine hydrochloride | use 0.05 mg/kg | ||
| Anesthesia unit | O2/Isoflurane inhalation unit with an chamber and tubeing+cone | ||
| insulin syringe 0.5ml x 12.7mm 29g, green | BD | 324824 | |
| Needles 23G 1 1/4" | Braun | 4657640 | |
| Needles 25G 5/8" | Braun | 4657853 | |
| Sutures silkan 0.7 | Braun | 1134019 | |
| Nuts | Jeveka | 934 A2 1 | |
| Bolts | Jeveka | 84 A2 1 10 | |
| 0.9% NaCl | |||
| Microscope + software | The space between table and objective need to be wide enough to hold the animal | ||
| Heated temperature controlled platform | Costum made | ||
| Window holder | Costum made | ||
| tetramethylrhodamine 2,000,000 MW dextran | Invitrogen | D7139 | 100 µg/mouse |
| Alexa-fluor 647 10,000 MW dextran | Invitrogen | D22914 | 100 µg/mouse |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | H1399 | 25 µg/mouse |
| Pegulated nanoparticles | ref 5 | ||
| LEICA TCS SP5 Multiphoton Microscope | Leica | ||
| LAS AF Software | Leica |
References
- Massoud, T. F., Gambhir, S. S. Molecular imaging in living subjects: seeing fundamental biological processes in a new light. Genes Dev. 17, 545-580 (2003).
- Ellenbroek, S. I., van Rheenen, J. Imaging hallmarks of cancer in living mice. Nat Rev Cancer. 14, 406-418 (2014).
- Brown, E., Munn, L. L., Fukumura, D., Jain, R. K. In vivo imaging of tumors. Cold Spring Harb Protoc. 2010 (7), pdb prot5452 (2010).
- Palmer, G. M., et al. In vivo optical molecular imaging and analysis in mice using dorsal window chamber models applied to hypoxia, vasculature and fluorescent reporters. Nat. Protocols. 6, 1355-1366 (2011).
- Seynhaeve, A. L., et al. Tumor necrosis factor alpha mediates homogeneous distribution of liposomes in murine melanoma that contributes to a better tumor response. Cancer Res. 67, 9455-9462 (2007).
- Schiffelers, R. M., et al. Ligand-targeted liposomes directed against pathological vasculature. J Liposome Res. 12, 129-135 (2002).
- Straetemans, T., et al. T-cell receptor gene therapy in human melanoma-bearing immune-deficient mice: human but not mouse T cells recapitulate outcome of clinical studies. Hum Gene Ther. 23, 187-201 (2012).
- Pittet, M. J., Weissleder, R. Intravital imaging. Cell. 147, 983-991 (2011).
- van Haperen, R., et al. Functional expression of endothelial nitric oxide synthase fused to green fluorescent protein in transgenic mice. Am J Pathol. 163, 1677-1686 (2003).
- Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 45, 593-605 (2007).
- Manzoor, A. A., et al. Overcoming limitations in nanoparticle drug delivery: triggered, intravascular release to improve drug penetration into tumors. Cancer Res. 72, 5566-5575 (2012).
- Pitulescu, M. E., Schmidt, I., Benedito, R., Adams, R. H. Inducible gene targeting in the neonatal vasculature and analysis of retinal angiogenesis in mice. Nat Protoc. 5, 1518-1534 (2010).
- Tual-Chalot, S., Allinson, K. R., Fruttiger, M., Arthur, H. M. Whole mount immunofluorescent staining of the neonatal mouse retina to investigate angiogenesis in vivo. J Vis Exp. , e50546 (2013).
- Hobbs, S. K., et al. Regulation of transport pathways in tumor vessels: role of tumor type and microenvironment. Proc Natl Acad Sci U S A. 95, 4607-4612 (1998).
- Minchinton, A. I., Tannock, I. F. Drug penetration in solid tumours. Nat Rev Cancer. 6, 583-592 (2006).
- Koning, G. A., Eggermont, A. M., Lindner, L. H., Hagen, ten, L, T. Hyperthermia and thermosensitive liposomes for improved delivery of chemotherapeutic drugs to solid tumors. Pharm Res. 27, 1750-1754 (2010).
- Seynhaeve, A. L., Eggermont, A. M., ten Hagen, T. L. TNF and manipulation of the tumor cell-stromal interface: "ways to make chemotherapy effective". Front Biosci. 13, 3034-3045 (2008).
- Brouckaert, P., et al. Tumor necrosis factor-alpha augmented tumor response in B16BL6 melanoma-bearing mice treated with stealth liposomal doxorubicin (Doxil) correlates with altered Doxil pharmacokinetics. Int J Cancer. 109, 442-448 (2004).
- Hoving, S., Seynhaeve, A. L., van Tiel, S. T., Eggermont, A. M., ten Hagen, L. T. Addition of low-dose tumor necrosis factor-alpha to systemic treatment with STEALTH liposomal doxorubicin (Doxil) improved anti-tumor activity in osteosarcoma-bearing rats. Anticancer Drugs. 16, 667-674 (2005).
- Gabizon, A., et al. Prolonged circulation time and enhanced accumulation in malignant exudates of doxorubicin encapsulated in polyethylene-glycol coated liposomes. Cancer Res. 54, 987-992 (1994).
- Bergers, G., Benjamin, L. E. Tumorigenesis and the angiogenic switch. Nat Rev Cancer. 3, 401-410 (2003).
- Eilken, H. M., Adams, R. H. Dynamics of endothelial cell behavior in sprouting angiogenesis. Curr Opin Cell Biol. 22, 617-625 (2010).
- Nakasone, E. S., Askautrud, H. A., Egeblad, M. Live imaging of drug responses in the tumor microenvironment in mouse models of breast cancer. J Vis Exp. , e50088 (2013).
- van Vliet, M., et al. MR angiography of tumor-related vasculature: from the clinic to the micro-environment. Radiographics. 25, Suppl 1. S85-S97 (2005).
- Dicheva, B. M., et al. Cationic thermosensitive liposomes: a novel dual targeted heat-triggered drug delivery approach for endothelial and tumor cells. Nano Lett. 13, 2324-2331 (2013).
- Li, L., et al. Improved intratumoral nanoparticle extravasation and penetration by mild hyperthermia. J Control Release. 167, 130-137 (2013).
