该协议描述了表达细胞特异荧光标记的转基因小鼠的活体成像。活体成像提供了一种非侵入性的方法, 用于高分辨率观察活体动物使用植入窗口, 通过它的微观可视化过程是可能的。这种方法对于研究纵向过程尤其有用。
肿瘤和肿瘤血管的发展, 以及肿瘤对治疗的反应, 是高度动态的生物过程。组织学提供静态的信息, 往往是不够的, 以正确的解释。活体的评估, 在这个过程中遵循的时间, 提供额外的和往往是意想不到的信息。随着转基因动物的建立, 表达细胞特异标记物和活细胞示踪剂, 改善成像设备, 和发展的几个成像室, 活体显微镜已成为一个重要的工具, 以更好地了解生物过程。本文介绍了一种研究肿瘤血管发育和治疗效果的空间和时间的实验设计方法。利用这种设置, 血管发育阶段, 尖端细胞和流明形成, 血流, 外渗, 建立的血管床, 和血管破坏可以可视化和遵循。此外, 治疗效果, 肿瘤的命运, 和定位的化疗化合物也可以遵循。
虽然体外研究能够实现对过程的高分辨率动态成像, 但体外实验不允许在适当的上下文中进行评估。例如, 肿瘤细胞与基质间的相互作用或在肿瘤内的药物传递和分布不能在培养基中进行研究。因此, 动物模型被用来模仿人类的生理和病理。然而, 过程的纵向成像, 特别是在亚细胞的分辨率, 是具有挑战性的。分子成像方法, 如磁共振成像 (MRI), 单光子发射计算机断层扫描 (SPECT), 和正电子发射断层扫描 (PET), 具有良好的穿透深度, 但缺乏分辨率或无法说明解剖结构。光学成像提供高分辨率, 使结构成像, 但它伴随着穷人到最小的渗透1。活体显微镜结合窗室技术的应用, 如背皮或腹窗, 允许高分辨率成像在体内2,3,4。这项技术有明显的优势, 因为它允许纵向成像在数小时甚至数天, 成像的过程在适当的上下文 (例如,细胞细胞之间的相互作用的影像组织), 并在光学极限的分辨率先进的共焦和多显微镜。
引入具有细胞或蛋白质特异荧光标签的转基因动物, 为体内和体内的实验提供了过多的可能性。例如, 细胞之间的相互作用, 蛋白质的生产和对操作或疗法的反应可以在体内研究在使用这些模型的5,6,7,8。重要的是, 位置和时间可以用适当的成像设备和方法来确定。在这里, 活体显微镜的动物表达内皮标记与注射剂结合在一个肿瘤移植在一个改良背皮窗室提出。
由于肿瘤和肿瘤血管的发展, 以及肿瘤的治疗作用, 是高度动态的过程, 活体评价是一个优雅的工具, 以时间和空间依赖性的方式对这些过程进行正确的评估。随着活细胞标记的日益普及, 转基因动物的产生, 以及成像方式的进步, 活体成像越来越受到人们的欢迎。虽然组织学仍然是经常使用, 和大量的标记可以用来识别细胞和结构, 组织切片有缺点时, 调查动态过程。组织剥离是必需的, 只提供静态信息;固定影响组织质量;切片破坏细胞间的相互作用。另外, 当研究动态过程时, 组织解剖在不同的, 并且通常被推测, 时间点需要大量的动物。通过活体成像, XYZ 的空间维数和额外的时间维度可以在同一动物中进行评估, 从而使不同的玩家在空间和时间上的适当定位成为可能。因此, 最佳的时间点是没有错过的, 和动物的数量, 每个实验使用大大减少。其次, 利用活体评价建立的时间窗可以进行外推, 优化组织提取。第三, 所需的容器生长阶段可以确定 intravitally 和染色作为一个整体安装组织。
这篇手稿中提到的活体设计使用了在内皮细胞中表达荧光标签的转基因动物的组合, 改良后的背皮室模型和专用的多共聚焦显微镜。
内皮细胞在血管生成过程中经过多个阶段21,22 , 而这些阶段在肿瘤中往往可以同时看到。使用 eNOSTag-GFP 小鼠线, 可以跟踪单个的内皮细胞, 甚至可以追踪丝状动力学。因此, 研究船舶开发 intravitally 是一个很好的模型。根据现有的内在标签, 可注射荧光剂可以用来评估流明的形成, 血流量, 外渗, 和血液清除。鼠标连续成像5小时。动物的长期评估是可行的, 当关于动物的麻醉的几个预防措施被采取, 以前被描述了23。由于这项研究的重点是癌症, 肿瘤组织或细胞被植入。然而, 我们也试验了跖骨和胚胎肺。然而, 在研究中的组织的生长速度是有限的, 因为在几周后, 皮肤开始再生, 这可能是生长缓慢的肿瘤或组织的问题。
在验证阶段, 与经典模型4相比, 背皮窗室被大大修改。该框架是由产品合成材料, 是轻型和小, 有一个大的窗口景观区。固定环的钩 (图 1Bg, 白色箭头) 只用于容易去除的环。当这些干扰图像时, 不带挂钩的固定环可以使用。皮肤不伸展太多, 放松不发生在这个模型, 并且传染很少被看见。这些修改减少动物不适和改进动物程序显着。此外, 金属零件可以很容易地去除时, 成像的肿瘤使用 MRI24。
任何显微镜都可以采用 intravitally 图像背皮室。主要要求是显微镜阶段和物镜之间的可用空间。影响成像的一个重要方面是运动。为了防止运动工件, 一个平台, 适合在显微镜表 (后删除所有插入) 和支持的鼠标应使用。在麻醉下, 不需要对小鼠进行抑制, 最好是让老鼠自由呼吸。然而, 窗口被栓在平台上, 给视野的最佳的固定 (即,肿瘤是可看见的通过窗口房间)。该平台使用电子加热垫加热, 用于动物加热。这个平台是内部制作的, 可以根据要求获得具体的信息。高分辨率物镜是评估细胞内过程的必要条件, 并能区分细胞质和细胞核。使用的锥形透镜具有良好的光学分辨率 (高 NA), 但相对较长的工作距离 (最好是2毫米或以上) 建议。在成像的局限性是穿透深度和荧光强度的标签。此外, 在成像过程中必须避免漂白、光和饱和度。
在这里, 使用了一个综合共焦-多和共聚焦显微镜。多是直立的, 而共焦是倒置显微镜。直立显微镜的优点是易于使用水浸透镜。这些镜片有很高的 NA 和很长的工作距离, 甚至在高 (例如, 20 或 40X) 放大倍数。具体来说, 它是建议获得一个 20X NA 1.0 水浸透镜, 这是由几家公司出售。请注意, 当使用浸入式镜片时, 物镜和浸入式液体需要加热到37° c。对于最好的图像, 建议使用最佳共焦设置 (即,针孔在1通风的单位, 激光功率尽可能低, 增益不太高 (特别是如果增益引入噪声), 线速度在最大值, 并没有平均扫描)。过度曝光、饱和度和图像之间的强度差会损害数据质量。建议防止饱和度和过度曝光。这可以通过获取不同增益设置的图像来规避。更改增益是改变图像亮度的最简单方法。如果需要, 可以调整激光功率。为了使图像质量标准化, 可以使用具有固定荧光强度的幻灯片。我们必须牢记, 即使在显微镜设置最佳的情况下, 图像质量在很大程度上取决于窗口室和组织的质量
当同时扫描多个荧光标记时, 必须避免在另一条通道中检测到一个荧光的出血。通过使用荧光与最小重叠频谱和帧之间的顺序扫描的组合来避免出血。这里提出的图像扫描使用3顺序扫描 (轨道 1: GFP, 做或 fluor647 与488和633激光; 轨道 2: 罗丹明, Doxil, 或 mTomato 与543激光; 和轨道 3: 赫斯特与405激光)。
有可能评估肿瘤血管发展的几个阶段, 提示细胞动力学, 流明形成, 外渗, 和血管损伤在这里显示。使用 eNOStag-gfp 线, 肿瘤区与破坏血管床很容易检测到颗粒状细胞残留物仍然表达 GFP。在这些地区没有检测到注射剂, 表明缺乏流动。这意味着, 管理的化疗药物也不会到达这些地区。然而, 船只的破坏也可以是一个治疗的结果。肿瘤的预评价, 检查前处理血管破坏, 是准确的治疗评价的先决条件, 可以很容易地使用这种实验设计。
有大量的可能性, 活体显微镜可以使用, 并详细讨论超出了本出版物的范围。为了给出一个简单的见解, 可能的应用包括研究化疗在肿瘤组织中的积累, 血管的发育 (例如,血管、分支和交叉路口的数量) 和血流, 细胞间的相互作用,细胞靶向和胞内处理, 以及上面提到的例子和这里显示。由于分析是基于荧光, 知道强度波动, 由于质量的窗口或组织。此外, 由于肿瘤组织相对较厚, 因此, 视平面上方或下方的荧光对图像中的信号有影响。将定量图像分析与客观测量相结合是最好的方法。例如, 如果对药物浓度感兴趣, 在活体显微镜下从窗口取出肿瘤组织, 用 HPLC 法测定药物含量, 并与共聚焦图像进行比较。
使用该模型可以对肿瘤的反应进行评价, 但应采取一些预防措施。人们必须认识到, 肿瘤也生长向内, 进入皮肤。如果穿透深度足以覆盖整个肿瘤, 可以进行3D 测量。在这种情况下, 应使用远红色染料。这里所描述的窗口室处理的是皮肤环境中的肿瘤, 重要的是要指出窗户保持一个比正常的鼠标体温略低的温度。因此, 最好在右侧微环境中研究肿瘤, 以证实活体皮窗室的研究。重要的是, 背皮室提供了对过程和机制的动力学的洞察, 为改善治疗提供了一个工具基础。此外, 还可以获得关于分布和药代动力学的额外信息。经典的, 这些分布的研究是通过治疗肿瘤动物和解剖肿瘤/器官来测量药物摄取量来进行的。使用这种活体模型, 药物的肿瘤位置 (即,血管内, 肿瘤, 细胞内, 或核) 可以提供5,25,26。不仅是药物的位置显示, 而且也是时间窗口的最佳摄取机会。
利用本文所描述的实验设计, 可以在时间和空间环境中对各种参数进行评估。具体来说, 我们在这里表明, 活体显微镜提供了重要的洞察力的动力学肿瘤血管的发展和治疗反应。
The authors have nothing to disclose.
我们要感谢园 van Haperen 和里尼 de 先生为他们的发展和捐赠 eNOSTag-GFP 线, Joost 美联社 ren 为他的技术协助与动物工作和动物管理员为他们的帮助。使用的显微镜设施是伊兹斯光学成像中心的一部分, 我们要感谢伊斯兰会议组织工作人员的服务。这项研究得到了荷兰癌症协会的赠款 DDHK 2000-2224 的支持, 《鹿特丹大学 Vereniging Trustfonds 》和《 Stichting 伊兹 Heelkundig Kankeronderzoek 》, 我们感谢委员会成员的慷慨捐助。
DMEM | Sigma | D1145 | Supplemented with 10% FCS |
Trypsin-versene (EDTA) | Lonza | BE17-161E | Make a 0.1% solution in PBS, sterile |
PBS | |||
Window frames | Costum made | ||
Filler glass 10 mm, 0.55 mm | Abrisia technologies | ||
Cover glass 12mm, #1 thickness | Thermo Scientific/VWR | 631-0713 | |
Hear removal gel (veet) | for sensitive skin | ||
Eye ointment | |||
Buprenorfine hydrochloride | use 0.05 mg/kg | ||
Anesthesia unit | O2/Isoflurane inhalation unit with an chamber and tubeing+cone | ||
insulin syringe 0.5ml x 12.7mm 29g, green | BD | 324824 | |
Needles 23G 1 1/4" | Braun | 4657640 | |
Needles 25G 5/8" | Braun | 4657853 | |
Sutures silkan 0.7 | Braun | 1134019 | |
Nuts | Jeveka | 934 A2 1 | |
Bolts | Jeveka | 84 A2 1 10 | |
0.9% NaCl | |||
Microscope + software | The space between table and objective need to be wide enough to hold the animal | ||
Heated temperature controlled platform | Costum made | ||
Window holder | Costum made | ||
tetramethylrhodamine 2,000,000 MW dextran | Invitrogen | D7139 | 100 µg/mouse |
Alexa-fluor 647 10,000 MW dextran | Invitrogen | D22914 | 100 µg/mouse |
Hoechst 33342 | Invitrogen | H1399 | 25 µg/mouse |
Pegulated nanoparticles | ref 5 | ||
LEICA TCS SP5 Multiphoton Microscope | Leica | ||
LAS AF Software | Leica |