Denne protokol beskriver den intravital billeddannelse af Transgene mus udtryk for celle-specifikke fluorescerende markører. Intravital imaging indeholder en ikke-invasiv metode til høj opløsning observationer hos levende dyr brug af implantabelt windows hvorigennem den mikroskopiske visualisering af processer er muligt. Denne metode er især nyttig til at studere langsgående processer.
Tumor og tumor fartøj udvikling såvel som tumor respons til therapeutics, er yderst dynamisk biologiske processer. Histologi giver statiske oplysninger og er ofte ikke tilstrækkelige til en korrekt fortolkning. Intravital evaluering, hvor en proces er fulgt i gang, giver ekstra og ofte uventede oplysninger. Med oprettelsen af transgene dyr udtrykker celle-specifikke markører og levende celle røbestoffer, forbedringer til imaging udstyr og udvikling af flere billeddiagnostiske afdelinger, er intravital mikroskopi blevet et vigtigt værktøj til bedre at forstå biologiske processer. Dette papir beskriver en eksperimenterende design for undersøgelsen af tumor fartøj udvikling og terapeutiske virkninger på en måde, rumlige og tidsmæssige. Bruger denne opsætning, kan fase af fartøjet udvikling, tip celle og lumen dannelse, blodgennemstrømning, ekstravasation, etablerede vaskulære seng og vaskulære ødelæggelse visualiseres og fulgt. Derudover kan terapeutiske virkninger, intratumoral skæbne og lokalisering af kemoterapeutiske stoffer også følges.
Mens in vitro- undersøgelser aktiverer høj opløsning kinetic imaging processer, giver in vitro- eksperimenter ikke evalueringen i den rette sammenhæng. For eksempel ikke kan samspillet mellem tumorceller og stromale rum eller medicinafgivelse og distribution inde en tumor undersøges i en kultur plade. Dyremodeller er derfor bruges til at efterligne den menneskelige fysiologi og patologi. Men den langsgående imaging processer, især på en subcellulært opløsning, er udfordrende. Molekylær billeddannelse metoder, såsom magnetisk resonans imaging (MR), single photon emission beregnet tomografi (SPECT) og positron emission tomografi (PET), har gode penetration dybder men manglende opløsning eller undlader at illustrere anatomiske strukturer. Optiske billeddannelse giver høj opløsning og gør det muligt for billeddannelse af strukturer, men det er ledsaget af fattige til minimal penetration1. Anvendelsen af intravital mikroskopi i kombination med vindue kammer teknologier, såsom en dorsal skinfold eller abdominal vindue, giver mulighed for høj opløsning billedbehandling i vivo2,3,4. Denne teknologi har klare fordele, da det giver mulighed for langsgående imaging over timer og endda dage for billeddannelse af processer i den rette sammenhæng (f.eks. celle-celle interaktioner i de afbildede væv) og for beslutninger på de optiske begrænsninger af Avanceret Konfokal og multiphoton mikroskoper.
Indførelsen af transgene dyr med celle – eller protein-specifikke fluorescerende etiketter åbner et væld af muligheder for i vivo og ex vivo eksperimenter. For forekomst, celle-celle interaktioner, produktionen af proteiner og reaktion på manipulation eller terapi kan studeres modeller i vivo ved hjælp af disse5,6,7,8. Vigtigere, position i tid og sted kan bestemmes med de rette imaging udstyr og metoder. Her, den intravital mikroskopi af dyr at udtrykke en endotel markør i kombination med injicerbar agenter i en tumor implanteret i en modificeret dorsale skinfold vindue kammer er præsenteret.
Som tumor og tumor fartøj udvikling samt tumor terapeutiske virkninger, er meget dynamiske processer, er intravital evaluering et elegant værktøj til at foretage en korrekt vurdering af disse processer på et tidspunkt – og rumlige-afhængige måde. Med den øgede tilgængelighed af levende celle markører, oprettelsen af transgene dyr og udviklingen af imaging modaliteter, bliver intravital imaging mere og mere populære. Selvom histologi bruges stadig rutinemæssigt, og et væld af markører kan bruges til at identificere celler og strukturer, har væv skæring ulemper når undersøge dynamiske processer. Væv dissektion er påkrævet, giver kun statiske oplysninger; fiksering påvirker væv kvalitet; og udskæring skader cellulære vekselvirkninger. Også, når undersøge dynamiske processer, væv dissektion på forskellige og ofte formodede, tidspunkter kræver en stor mængde af dyr. Med intravital imaging, kan XYZ rumlige dimensioner og den ekstra dimension af tid evalueres i de samme dyr, gør den korrekte placering af forskellige spillere muligt i tid og rum. Derfor er ikke gå glip af optimale tidspunkter, og animalske antallet bruges pr. eksperiment reduceres betydeligt. For det andet kan tidsvinduet etableret med intravital evaluering ekstrapoleres til at optimere væv udvinding. For det tredje kan den ønskede fase af fartøjet vækst identificeret intravitally og farves som et hele-mount væv.
Intravital design er nævnt i dette manuskript bruger en kombination af transgene dyr at udtrykke en fluorescerende etiket i endothelial celler, en modificeret dorsale skinfold kammer model, og en dedikeret multiphoton-Konfokal mikroskop.
Endotelceller gå gennem en række stadier21,22 under angiogenese, og disse faser kan ofte ses samtidig i en svulst. Bruger eNOSTag-NGL mus linje, individuelle endotelceller kan følges, og selv filopodia dynamics kan spores. Det er derfor en god model til at studere fartøj udvikling intravitally. Afhængigt af de allerede-nuværende iboende etiketter, kan injicerbare fluorescerende agenter bruges til at vurdere lumen dannelse, blodgennemstrømning, ekstravasation og blod clearance. Musen er afbildet kontinuerligt for op til 5 h. Den langsigtede evaluering af et dyr er muligt når der træffes flere forholdsregler vedrørende bedøvelse af dyret, der har været beskrevet tidligere23. Da denne forskning er fokuseret på kræft, blev tumorer væv eller celler implanteret. Men vi også eksperimenteret med mellemfodsknogler og embryonale lunger. Dog vækst af væv under undersøgelse er en begrænsning, som efter et par uger, huden begynder at regrow, som kan være et problem med langsomt voksende tumorer eller væv.
I valideringsfasen sammenlignet den dorsale skinfold vindue kammer var betydeligt ændret med den klassiske model4. Rammerne er konstrueret af autoklaverbart syntetisk materiale og er lette og små, med et stort vindue-se område. Krog af låseringen (figur 1Bg, hvid pilespids) bruges kun til nem fjernelse af ringen. Holderen ringe uden kroge kan bruges, når disse forstyrrer billeddannelse. Huden er ikke strakt alt for meget, løsne forekommer ikke i denne model, og infektioner ses kun sjældent. Disse ændringer reducere dyrs ubehag og forfine den animalske procedure betydeligt. Også, de metal dele let kan fjernes når imaging tumor ved hjælp af Mr24.
Enhver mikroskop kan vedtages til intravitally billede dorsale skinfold kamre. Det vigtigste krav er den tilgængelige plads mellem mikroskop fase og mål linse. Et vigtigt aspekt, der påvirker imaging er motion. For at forhindre bevægelse artefakter, bør en platform, der passer i tabellen mikroskop (efter fjernelse af alle skær) og understøtter musen anvendes. Det er ikke nødvendigt at begrænse musen, når det er under bedøvelse, og det er bedre at lade musen ånde frit. Men vinduet er boltet fast til den platform, giver optimal fiksering af synsfelt (dvs. tumor er synlige gennem vinduet). Platformen er opvarmet ved hjælp af en elektronisk varmepude, som anvendes til dyr varme. Denne platform blev lavet in-house, og detaljerne kan fås efter anmodning. En høj opløsning mål linse er en nødvendighed ved evaluering af intracellulær processer og gør det muligt at forskelsbehandle cytoplasma og kernen. Brug af en tilspidset linse med en god optisk opløsning (høj NA) men en relativt lang arbejde afstand (helst 2 mm eller derover) anbefales. Begrænsning i imaging er indtrængningsdybde og fluorescerende intensiteten af etiketterne. Desuden, photobleaching, fototoksicitet, og mætning skal undgås under imaging.
Her, blev en integreret Konfokal-multiphoton og en Konfokal mikroskop brugt. Multiphoton er opretstående, mens den Konfokal er en inverteret mikroskop. Fordelen ved en opretstående mikroskop er nem brug af vand-fordybelse linser. Disse linser har en høj NA og lang arbejde afstand, selv ved høj (f.eks. 20 eller 40 X) forstørrelse. Specifikt, anbefales det at anskaffe en 20 X NA 1,0 vand-fordybelse linse, som sælges af flere virksomheder. Vær opmærksom på at, når fordybelse linser bruges, mål linse og fordybelse væske skal være opvarmet til 37 ° C. De bedste billeder, det anbefales at bruge optimale Konfokal indstillinger (dvs. pinhole på 1 luftige enhed, laser power så lavt som muligt, gevinst ikke for højt (især hvis gevinsten introducerer støj), line hastighed på maksimum, og ingen gennemsnit af scanninger). Overeksponering, mætning, og forskellen i intensiteter mellem billeder kompromittere datakvalitet. Det anbefales at forhindre mætning og overeksponering. Dette kan omgås ved at erhverve billeder på forskellige gain-indstillinger. Ændre gevinsten er den nemmeste måde at ændre billedets lysstyrke. Hvis det er nødvendigt, kan laser power justeres. For at standardisere billedkvaliteten, kan dias med en fast fluorescens intensitet bruges. Man skal huske på at selv når mikroskop er indstillet optimalt, billedkvalitet bestemmes i høj grad af kvaliteten af vinduet kammer og væv
Når du scanner flere fluorescerende markører samtidigt, skal gennemblødning, hvor en fluorophore er opdaget i den engelske kanal fra en anden, undgås. Undgå gennemblødning ved hjælp af en kombination af fluorophores med minimal overlappende spectra og sekventiel scanning mellem rammer. Billederne præsenteres her blev scannet ved hjælp af 3 sekventielle scanninger (spor 1: normal god landbrugspraksis, DID eller fluor647 med 488 og 633 laser; spore 2: rhodaminfilteret, Doxil eller mTomato med 543 laser; og spore 3: Hoechst med 405 laser).
Mulighed for at evaluere flere stadier af tumor fartøj udvikling, tip celle dynamics, lumen dannelse, ekstravasation og vaskulære skader er vist her. Ved hjælp af linjen eNOStag-normal god landbrugspraksis, opdages tumor områder med en ødelagt vaskulære bed let af granuleret cellulære rester stadig udtryk for normal god landbrugspraksis. Ingen injicerbare agent blev fundet i disse områder, som angiver manglen strøm. Det betyder, at administreres kemoterapeutiske stoffer vil ikke nå disse områder enten. Fartøj ødelæggelse kan dog også være et terapeutisk resultat. Forudgående evaluering af tumor, skal kontrolleres for forbehandling fartøj ødelæggelse, er en forudsætning for den nøjagtige terapeutiske evaluering og let kan udføres ved hjælp af denne eksperimentelle design.
Der er et væld af muligheder som intravital mikroskopi kan anvendes, og detaljeret diskussion er uden for rammerne af denne publikation. For at give et kort indblik, omfatter mulige anvendelser studier på ophobning af kemoterapeutika i tumor væv, udvikling af fartøjer (f.eks. antallet af fartøjer, grene og vejkryds) og blodgennemstrømningen, celle-celle interaktioner, celle målretning, og intracellulære forarbejdning samt eksempler nævnt ovenfor og vist her. Som analysen er baseret på fluorescens, være opmærksom på intensitet udsving på grund af kvaliteten af vindue eller væv. Også, som tumor væv er forholdsvis tyk, fluorescens fra over eller under plan synspunkt har en indvirkning på signalet i billedet. Det er bedst at kombinere den kvantitative billedanalyse med objektive målinger. For eksempel, hvis du er interesseret i stoffet koncentrationer, fjerne tumor væv fra vinduet efter intravital mikroskopi og bestemme stof indhold ved hjælp af med HPLC for at sammenligne med de Konfokal billeder.
Evaluering af tumor respons kan udføres som godt ved hjælp af denne model, men med nogle forholdsregler. Man må indse, at tumorer også vokse indad, ind i huden. 3D-målinger kan foretages, hvis penetration er dyb nok til at dække hele tumoren. I så fald bør far-red farvestoffer anvendes. Vinduet kammeret som beskrevet her tilbud med tumorer i hud omgivelser, og det er vigtigt at påpege, at vinduet opretholder en temperatur lidt lavere end kropstemperatur normale mus. Det er derfor bedst at studere tumorer i lige mikro miljømæssige omgivelser til at bekræfte intravital undersøgelser med den dorsale skinfold vindue kammer. Vigtigere er, den dorsale skinfold kammer giver indblik i kinetik af processer og mekanismer, giver en instrumental grundlag for forbedring af terapi. Også kan indhentes ekstra oplysninger om biodistribution og farmakokinetik. Klassisk, udføres disse biodistribution undersøgelser af behandling af tumor-bærende dyr og dissekere tumorer/organer for at måle stof optagelse. Ved hjælp af denne intravital model kan intratumoral placeringen af et lægemiddel (dvs. intravaskulær, intratumoral, intracellulære eller nukleare) gives5,25,26. Ikke kun er placeringen af stoffet afsløret, men også den tid vindue-af-mulighed for den mest optimale optagelse.
Ved hjælp af eksperimentelle design, der er beskrevet i denne artikel, kan en lang række parametre evalueres i tidsmæssige og rumlige omgivelser. Specifikt, viser her vi, at intravital mikroskopi giver vigtig indsigt i dynamikken i tumor fartøj udvikling og terapeutisk respons.
The authors have nothing to disclose.
Vi vil gerne takke Rien van Haperen og Rini de Crom for deres udvikling og donation af linjen eNOSTag-normal god landbrugspraksis, Joost A.P. Rens for sin tekniske bistand med det animalske arbejde og de animalsk pedeller for deres hjælp. Mikroskopi faciliteter bruges er en del af Erasmus-optisk Imaging Center, og vi vil gerne takke personalet OIC for deres service. Denne undersøgelse blev støttet af tilskud DDHK 2000-2224 fra hollandske Kræftens Bekæmpelse, “Vereniging Trustfonds” Erasmus University Rotterdam og “Stichting Erasmus Heelkundig Kankeronderzoek”, og vi vil gerne takke medlemmerne af udvalgene for deres generøse donation.
DMEM | Sigma | D1145 | Supplemented with 10% FCS |
Trypsin-versene (EDTA) | Lonza | BE17-161E | Make a 0.1% solution in PBS, sterile |
PBS | |||
Window frames | Costum made | ||
Filler glass 10 mm, 0.55 mm | Abrisia technologies | ||
Cover glass 12mm, #1 thickness | Thermo Scientific/VWR | 631-0713 | |
Hear removal gel (veet) | for sensitive skin | ||
Eye ointment | |||
Buprenorfine hydrochloride | use 0.05 mg/kg | ||
Anesthesia unit | O2/Isoflurane inhalation unit with an chamber and tubeing+cone | ||
insulin syringe 0.5ml x 12.7mm 29g, green | BD | 324824 | |
Needles 23G 1 1/4" | Braun | 4657640 | |
Needles 25G 5/8" | Braun | 4657853 | |
Sutures silkan 0.7 | Braun | 1134019 | |
Nuts | Jeveka | 934 A2 1 | |
Bolts | Jeveka | 84 A2 1 10 | |
0.9% NaCl | |||
Microscope + software | The space between table and objective need to be wide enough to hold the animal | ||
Heated temperature controlled platform | Costum made | ||
Window holder | Costum made | ||
tetramethylrhodamine 2,000,000 MW dextran | Invitrogen | D7139 | 100 µg/mouse |
Alexa-fluor 647 10,000 MW dextran | Invitrogen | D22914 | 100 µg/mouse |
Hoechst 33342 | Invitrogen | H1399 | 25 µg/mouse |
Pegulated nanoparticles | ref 5 | ||
LEICA TCS SP5 Multiphoton Microscope | Leica | ||
LAS AF Software | Leica |