Dieses Protokoll beschreibt die intravitalen Bildgebung von transgenen Mäusen zellspezifische fluoreszierenden Marker zum Ausdruck zu bringen. Intravitalen Bildgebung stellt eine nicht-invasive Methode für hochauflösende Beobachtungen an lebenden Tieren mit implantierbaren Windows durch die mikroskopische Visualisierung von Prozessen möglich ist. Diese Methode ist besonders nützlich, um längs Prozesse zu studieren.
Tumor und Tumorentwicklung Schiff sowie Tumor-Ansprechens auf Therapeutika, sind hochdynamische biologische Prozesse. Histologie enthält statische Informationen und ist oft nicht ausreichend für eine korrekte Interpretation. Zusätzliche und oft unerwartete informiert intravitalen Bewertung, in denen ein Prozess in der Zeit eingehalten wird. Mit der Schaffung von transgenen Tieren, die mit dem Ausdruck zellspezifische Marker und live Zelle Tracer, Verbesserungen für bildgebende Geräte und die Entwicklung von mehreren bildgebenden Kammern geworden intravitalen Mikroskopie ein wichtiges Instrument, um besser zu verstehen biologische Prozesse. Dieses Whitepaper beschreibt ein experimentelles Design zur Untersuchung des Schiffes Tumorentwicklung und therapeutische Effekte in einer räumlichen und zeitlichen Weise. Mit diesem Setup, kann die Bühne Schiff Entwicklung, Tipp Zell- und Lumen Bildung, Durchblutung, Extravasation, eine etablierte vaskulären Bett und vaskuläre Zerstörung visualisiert und gefolgt werden. Darüber hinaus können therapeutische Effekte, intratumorale Schicksal und die Lokalisierung von chemotherapeutischen Substanzen auch verfolgt werden.
Während in-vitro- Studien hohe kinetische Abbildungsleistung Prozesse ermöglichen, können in-vitro- Experimente keine Bewertung im richtigen Kontext. Zum Beispiel, kann nicht das Zusammenspiel von Tumorzellen mit Stromazellen Fächern oder Drug-Delivery und Verteilung innerhalb eines Tumors in einer Kultur-Platte untersucht werden. Tiermodelle sind daher verwendet, um die menschliche Physiologie und Pathologie zu imitieren. Die longitudinale Darstellung der Prozesse, vor allem bei einer subzellulären Auflösung ist jedoch schwierig. Molekulare bildgebende Verfahren, wie z. B. Magnetresonanz-Bildgebung (MRI), berechnet Single Photon Emission Tomographie (SPECT) und Positronen-Emissions-Tomographie (PET), haben gute Eindringtiefe aber mangels Auflösung oder nicht anatomische Strukturen zu veranschaulichen. Optische Bildgebung bietet hohen Auflösung und ermöglicht die Darstellung der Strukturen, aber es wird von Armen auf minimale Penetration1begleitet. Die Anwendung der intravitalen Mikroskopie in Kombination mit Fenster-Kammer Technologien, wie z. B. eine dorsale Hautfalte oder Abdominal-Fenster ermöglicht hochauflösende Bildgebung in Vivo2,3,4. Diese Technologie hat deutliche Vorteile, da sie längs Bildgebung über Stunden und sogar Tage für die Darstellung von Prozessen im richtigen Kontext (z. B. Zell-Zell-Interaktionen im abgebildeten Gewebe) und für Auflösungen an den optischen Grenzen ermöglicht erweiterte multiphoton und konfokale Mikroskope.
Die Einführung von transgenen Tieren mit zellspezifische oder Protein Fluoreszenzmarkierungen eröffnet eine Fülle von Möglichkeiten für in Vivo und ex Vivo Experimente. Für Instanz, Zell-Zell-Interaktionen, die Produktion von Proteinen und die Reaktion auf Manipulation oder Therapie studiert werden können Modelle in Vivo mit diesen5,6,7,8. Wichtig ist, positionieren Sie in Ort und Zeit mit der richtigen bildgebende Geräte und Methoden ermittelt werden. Hier, den intravitalen Mikroskopie von Tieren, die mit dem Ausdruck eines endothelialen Markers in Kombination mit injizierbaren Agenten in einen Tumor in einem modifizierten implantiert dorsalen Hautfalte Fenster Kammer vorgestellt.
Tumor und Tumorentwicklung Schiff sowie Tumor therapeutische Effekte, ist hochdynamische Prozesse intravitalen Bewertung ein elegantes Werkzeug, um eine korrekte Einschätzung dieser Prozesse in gewissem Sinne Zeit und räumlichen abhängig zu machen. Mit der zunehmenden Verfügbarkeit von live Zellenmarkierungen, die Schaffung von transgenen Tieren und die Weiterentwicklung der bildgebenden Modalitäten ist intravitalen Bildgebung mehr und mehr populär. Obwohl Histologie noch routinemäßig verwendet, und eine Vielzahl von Markern verwendet werden, kann um Zellen und Strukturen zu identifizieren, hat Gewebe zu schneiden Nachteile bei der Untersuchung von dynamischer Prozessen. Gewebe-Dissektion ist erforderlich, nur statische Informationen; Gewebe-Qualität betrifft, Fixierung; und schneiden schadet zelluläre Interaktionen. Auch bei der Untersuchung von dynamischer Prozessen erfordert Gewebe Dissektion zu verschiedenen und oft vermuteten Zeitpunkten eine große Menge von Tieren. Mit intravitalen Bildgebung können die XYZ Raumdimensionen und die zusätzliche Dimension der Zeit in das gleiche Tier, wodurch die korrekte Platzierung der verschiedenen Akteure möglich in Raum und Zeit ausgewertet werden. Daher optimale Zeitpunkte sind nicht verpasst, und die tierische Zahl pro Experiment verwendet wird deutlich reduziert. Zweitens kann das Zeitfenster eingerichtet mit intravitalen Auswertung extrapoliert werden, um Gewebe Extraktion zu optimieren. Drittens kann die gewünschte Stufe der Behälterwachstum intravitally identifiziert und als ein ganzes-Mount Gewebe gebeizt.
Das intravitalen Design in diesem Manuskript erwähnt verwendet eine Kombination von transgene Tiere mit dem Ausdruck eine fluoreszierende Label in Endothelzellen, eine modifizierte dorsalen Hautfalte Kammer-Modell und eine dedizierte Multiphoton confocal Mikroskop.
Endotheliale Zellen durchlaufen eine Reihe von Stufen21,22 während der Angiogenese, und diese Phasen oft gleichzeitig in einen Tumor gesehen werden. Unter Verwendung der eNOSTag-GFP-Maus-Linie, einzelnen Endothelzellen können verfolgt werden, und sogar Filopodien Dynamik zurückverfolgt werden. Es ist daher ein gutes Modell Schiff Entwicklung intravitally zu studieren. Injizierbare fluoreszierende Agenten ist abhängig von der bereits Gegenwart intrinsische Etiketten lässt sich Lumen Bildung, Durchblutung, Extravasation und Blut Abstand zu bewerten. Die Maus wird kontinuierlich für bis zu 5 h abgebildet. Die langfristige Bewertung des Tieres ist machbar wenn einige Vorsichtsmaßnahmen bezüglich der Betäubung des Tieres getroffen werden, die seit23beschrieben. Da diese Forschung auf Krebs konzentriert, wurden Tumoren Gewebe oder Zellen implantiert. Jedoch experimentierten wir auch mit Mittelfußknochen und embryonale Lunge. Allerdings ist die Wachstumsrate des Gewebes unter Studie Begrenzung wie nach ein paar Wochen die Haut beginnt nachwachsen, was kann ein Problem mit langsam wachsenden Tumoren oder Gewebe.
Während der Phase der Validierung, die dorsale, Hautfalte Fenster Kammer erheblich geändert wurde, im Vergleich zum klassischen Modell4. Die Rahmen bestehen aus Kunststoff autoklavierbar und sind leicht und klein, mit einem großen Fenster-Ansicht. Der Haken des Sicherungsringes (Abbildung 1Bg, weiße Pfeilspitze) dient nur zur einfachen Entnahme des Rings. Halter Ringe ohne Haken können verwendet werden, wenn diese Bildgebung stören. Die Haut ist nicht zu viel gedehnt, Lockerung tritt nicht in diesem Modell und Infektionen sind nur selten zu sehen. Diese Änderungen reduzieren Tier Unbehagen und verfeinern das Tiere Verfahren deutlich. Die Metallteile können auch leicht entfernt werden, wenn den Tumor mit MRI24imaging.
Jedes Mikroskop kann angenommen werden, um intravitally Bild dorsalen Hautfalte Kammern. Die Hauptanforderung ist den verfügbaren Platz zwischen den Mikroskoptisch und das Objektiv. Ein wichtiger Aspekt, der Bildgebung betrifft ist Bewegung. Um Bewegungsartefakte zu verhindern, sollte eine Plattform, die passt in den Mikroskoptisch (nach dem entfernen alle Einsätze) und unterstützt die Maus, verwendet werden. Es ist nicht notwendig, die Maus zurückhalten, wenn es unter Narkose, und es besser ist, die Maus Atem frei zu lassen. Jedoch ist das Fenster auf der Plattform geben optimale Fixierung des Sichtfeldes verschraubt (d. h., der Tumor ist sichtbar durch die Fenster-Kammer). Die Plattform wird beheizt mit einer elektronischen Heizkissen für Tiere Heizung gebräuchlich. Diese Plattform war hausgemacht und Einzelheiten erhalten Sie auf Anfrage. Eine hochauflösende Objektiv ist eine Notwendigkeit, wenn intrazelluläre Prozesse bewerten und macht es möglich, zwischen dem Zytoplasma und Zellkern zu unterscheiden. Die Verwendung einer konischen Linse mit einem guten optischen Auflösung (hohe NA) aber eine relativ lange Arbeitsabstand (vorzugsweise 2 mm oder höher) wird empfohlen. Die Einschränkung in der Bildgebung ist die Eindringtiefe und die Fluoreszenz Intensität der Etiketten. Darüber hinaus müssen während der Bildgebung Immunofluoreszenz, Phototoxizität und Sättigung vermieden werden.
Hier wurden eine integrierte konfokale Multiphoton und einem confocal Mikroskop verwendet. Die Multiphoton ist aufrecht, während die konfokale einem inversen Mikroskop. Der Vorteil von einem aufrechten Mikroskop ist die einfache Handhabung von Eintauchen in Wasser Linsen. Diese Objektive haben eine hohe NA und langem Arbeitsabstand, selbst bei einer hohen (z. B. 20 oder 40 X) Vergrößerung. Insbesondere empfiehlt es sich, eine 20 X NA 1.0 eintauchen in Wasser Linse zu erhalten, die von mehreren Unternehmen verkauft wird. Beachten Sie, dass beim Eintauchen-Objektive verwendet werden, die Objektiv und Immersionflüssigkeit auf 37 ° c erhitzt werden müssen Es empfiehlt sich für die besten Bilder, optimale konfokale Einstellungen verwenden (d. h. Lochkamera 1 luftig Unit, Laserleistung so gering wie möglich zu gewinnen, die nicht zu hoch (vor allem, wenn der Gewinn Lärm führt), Streckengeschwindigkeit auf Maximum, und keine Mittelung der Scans). Überbelichtung, Sättigung und unterschiedliche Intensitäten zwischen Bilder beeinträchtigen die Qualität der Daten. Es wird empfohlen, die Sättigung und Überbelichtung zu vermeiden. Dies kann umgangen werden, indem Bilder bei verschiedenen Gain-Einstellungen. Ändern des Gewinns ist der einfachste Weg, um die Bildhelligkeit ändern. Bei Bedarf kann die Laserleistung eingestellt werden. Um die Bildqualität zu standardisieren, können Folien mit einer festen Fluoreszenzintensität verwendet werden. Man muss im Hinterkopf behalten, dass selbst wenn das Mikroskop optimal eingestellt ist, Bildqualität zu einem großen Teil bestimmt durch die Qualität der Fenster Kammer und Gewebe ist
Wenn Sie mehrere fluoreszierende Markierungen gleichzeitig scannen, muss durchscheinen, in dem ein Fluorophor in den Kanal des anderen erkannt wird vermieden werden. Vermeiden Sie durchbluten mithilfe einer Kombination des Fluorophore mit minimalen überlappende Spektren und sequentielle Scannen zwischen Frames. Die hier präsentierten Bilder wurden mit 3 sequenzielle Scans gescannt (Track 1: GFP, DID oder fluor647 mit dem Laser 488 und 633; track 2: Rhodamin, Doxil oder mTomato mit dem 543 Laser; und Gleis 3: Hoechst mit dem 405 Laser).
Die Möglichkeit mehrere Stufen der Tumorentwicklung Schiff, Tipp Zelldynamik Lumen Bildung, Extravasation und Gefäßschäden zu bewerten ist hier dargestellt. Unter Verwendung der eNOStag-GFP-Linie, sind Tumor-Bereiche mit einem zerstörten vaskulären Bett leicht durch granulierten zellulären Reste noch ausdrücken GFP erkannt. In diesen Bereichen zeigt das Fehlen des Flusses keine injizierbaren Agent festgestellt. Das bedeutet, die Chemotherapeutika verabreicht wird diese Bereiche entweder nicht erreichen. Schiff Zerstörung kann jedoch auch eine therapeutische Ergebnis. Vorbewertung des Tumors, nach Vorbehandlung Schiff Zerstörung suchen ist eine Voraussetzung für die genaue therapeutische Auswertung und kann leicht mit dieser Versuchsanordnung durchgeführt werden.
Es gibt eine Fülle von Möglichkeiten für die intravitalen Mikroskopie verwendet werden kann, und ausführliche Diskussion sprengt den Rahmen dieser Publikation. Um einen kurzen Einblick zu geben, sind Anwendungsmöglichkeiten Studien über die Anhäufung von Chemotherapeutika im Tumorgewebe, die Entwicklung von Schiffen (z. B. die Anzahl der Schiffe, Verzweigungen und Kreuzungen) und Blutfluss, Zell-Zell-Interaktionen, Handy-targeting, und intrazelluläre Verarbeitung sowie Beispiele oben erwähnten und hier zu sehen. Wie auf Fluoreszenz Analyse basierende beachten Sie Intensitätsschwankungen aufgrund der Qualität des Fensters oder der Gewebe. Da Tumorgewebe relativ dick ist, wirkt sich auch Fluoreszenz von oberhalb oder unterhalb der Ebene der Ansicht auf das Signal im Bild. Es empfiehlt sich, die quantitative Bildanalyse mit objektiven Messungen zu kombinieren. Zum Beispiel wenn Interesse an Drogen-Konzentrationen, entfernen Sie das Tumorgewebe aus dem Fenster nach intravitalen Mikroskopie und bestimmen Sie das Medikament Inhalte mit HPLC mit der konfokalen Bilder zu vergleichen.
Die Bewertung des Tumor-Ansprechens kann als gut mit diesem Modell, aber mit einigen Vorsichtsmaßnahmen durchgeführt werden. Man muss erkennen, dass Tumoren auch nach innen, in die Haut wachsen. 3D Messungen können erfolgen, wenn das Eindringen tief genug, um den gesamten Tumor zu decken ist. In einem solchen Fall sollte dunkelrote Farbstoffe verwendet werden. Die Fenster-Kammer als hier beschriebenen Angebote mit Tumoren in einem Hautmilieus, und es ist wichtig, darauf hinzuweisen, dass das Fenster eine Temperatur etwas niedriger als die normale Maus Körpertemperatur hält. Daher empfiehlt es sich, Tumoren in der direkt micro-Umwelt-Setting intravitalen Studien mit der dorsalen bestätigen Hautfalte Fenster Kammer zu studieren. Wichtig ist, die dorsale Hautfalte Kammer bietet Einblick in die Kinetik der Prozesse und Mechanismen, die eine instrumentale Grundlage für die Verbesserung der Therapie. Außerdem erhalten Sie zusätzliche Informationen über die Bioverteilung und Pharmakokinetik. Klassisch, sind diese Bioverteilung Studien durch Behandlung von Tumor-tragenden Tieren und seziert Tumoren/Organe zur Messung der Droge Aufnahme durchgeführt. Mit diesem intravitalen Modell kann die intratumorale Standort eines Medikaments (d. h. intravaskulären, intratumorale, intrazelluläre oder nuklearen)5,25,26mitgeteilt. Nicht nur ist die Lage des Medikaments ergeben, aber auch die Zeit-Fenster-von-Möglichkeit für die optimale Aufnahme.
Verwenden in diesem Artikel beschriebenen Versuchsanordnung, kann eine Vielzahl von Parametern in einer zeitlichen und räumlichen Umgebung ausgewertet werden. Speziell, zeigen hier wir, dass intravitalen Mikroskopie liefert wichtige Erkenntnisse über die Dynamik des Schiffes Tumorentwicklung und therapeutische Reaktion.
The authors have nothing to disclose.
Wir möchten Rien van Haperen und Rini de Crom für ihre Entwicklung und die Spende von der eNOSTag-GFP-Linie, Joost A.P. Rens für seine technische Unterstützung mit den Tieren arbeiten und die Tierpfleger für ihre Hilfe danken. Die Mikroskopie Einrichtungen verwendet, sind Teil des Erasmus Optical Imaging Center und möchten wir den Mitarbeitern der Organisation der Islamischen Konferenz für ihren Dienst danken. Diese Studie wurde unterstützt durch Zuschuss DDHK 2000-2224 von der niederländischen Krebsgesellschaft, “Vereniging Trustfonds” Erasmus-Universität Rotterdam und “Stichting Erasmus Heelkundig Kankeronderzoek”, und wir danken die Mitgliedern der Ausschüsse für ihre großzügige Spende.
DMEM | Sigma | D1145 | Supplemented with 10% FCS |
Trypsin-versene (EDTA) | Lonza | BE17-161E | Make a 0.1% solution in PBS, sterile |
PBS | |||
Window frames | Costum made | ||
Filler glass 10 mm, 0.55 mm | Abrisia technologies | ||
Cover glass 12mm, #1 thickness | Thermo Scientific/VWR | 631-0713 | |
Hear removal gel (veet) | for sensitive skin | ||
Eye ointment | |||
Buprenorfine hydrochloride | use 0.05 mg/kg | ||
Anesthesia unit | O2/Isoflurane inhalation unit with an chamber and tubeing+cone | ||
insulin syringe 0.5ml x 12.7mm 29g, green | BD | 324824 | |
Needles 23G 1 1/4" | Braun | 4657640 | |
Needles 25G 5/8" | Braun | 4657853 | |
Sutures silkan 0.7 | Braun | 1134019 | |
Nuts | Jeveka | 934 A2 1 | |
Bolts | Jeveka | 84 A2 1 10 | |
0.9% NaCl | |||
Microscope + software | The space between table and objective need to be wide enough to hold the animal | ||
Heated temperature controlled platform | Costum made | ||
Window holder | Costum made | ||
tetramethylrhodamine 2,000,000 MW dextran | Invitrogen | D7139 | 100 µg/mouse |
Alexa-fluor 647 10,000 MW dextran | Invitrogen | D22914 | 100 µg/mouse |
Hoechst 33342 | Invitrogen | H1399 | 25 µg/mouse |
Pegulated nanoparticles | ref 5 | ||
LEICA TCS SP5 Multiphoton Microscope | Leica | ||
LAS AF Software | Leica |