Questo protocollo descrive l’imaging videomicroscopia di topi transgenici che esprimono marcatori fluorescenti cellula-specifico. Videomicroscopia imaging fornisce un metodo non invasivo per osservazioni ad alta risoluzione in animali vivi utilizzando windows impiantabili attraverso il quale è possibile la visualizzazione microscopica dei processi. Questo metodo è particolarmente utile per studiare i processi longitudinali.
Tumore e lo sviluppo dei vasi del tumore, come pure la risposta del tumore a terapeutica, è processi biologici altamente dinamici. L’istologia fornisce informazioni statiche e spesso non è sufficiente per una corretta interpretazione. Valutazione videomicroscopia, in cui un processo è seguito nel tempo, fornisce informazioni supplementari e spesso inaspettate. Con la creazione di animali transgenici che esprimono marcatori di cellula-specifico e rivelatori di tensione delle cellule, miglioramenti all’apparecchiatura di imaging e lo sviluppo di parecchi alloggiamenti imaging microscopia intravital è diventato uno strumento importante per capire meglio processi biologici. Questo articolo descrive un progetto sperimentale per lo studio di sviluppo di nave del tumore e degli effetti terapeutici in modo spaziale e temporale. Utilizzando questa configurazione, la fase di sviluppo del vaso, formazione di cella e lume di punta, flusso sanguigno, stravaso, stabilito letto vascolare e distruzione vascolare può essere visualizzata e seguita. Inoltre, gli effetti terapeutici, intratumoral destino e la localizzazione dei composti chemioterapici può inoltre essere seguiti.
Mentre gli studi in vitro attiva imaging ad alta risoluzione cinetica dei processi, sperimentazione in vitro non consente la valutazione nel contesto appropriato. Per esempio, l’interazione delle cellule del tumore con scomparti stromal o consegna della droga e la distribuzione all’interno di un tumore non può essere studiato in una piastra di coltura. Modelli animali vengono quindi utilizzati per imitare la fisiologia umana e patologia. Tuttavia, l’imaging longitudinale dei processi, soprattutto a una risoluzione subcellulare, è impegnativo. Metodi di imaging molecolare, quali la formazione immagine a risonanza magnetica (MRI), emissione di fotone singolo computato tomografia (SPECT) e tomografia a emissione di positroni (PET), hanno profondità di buona penetrazione ma risoluzione di mancanza o non riuscire a illustrare le strutture anatomiche. Imaging ottico fornisce ad alta risoluzione e consente l’imaging delle strutture, ma è accompagnata da una scarsa penetrazione minima1. L’applicazione di microscopia intravital in combinazione con finestra sezione tecnologie, come una dorsale skinfold o finestra addominale, consente ad alta risoluzione imaging in vivo2,3,4. Questa tecnologia ha vantaggi distinti, in quanto consente per l’imaging longitudinale sopra ore e persino giorni, per l’imaging dei processi nel contesto appropriato (ad es., interazioni cellula-cellula nel tessuto imaged) e per risoluzioni ai limiti ottici della microscopi confocale e multifotonica avanzati.
L’introduzione di animali transgenici con etichette fluorescenti specifici delle cellule o proteina apre una miriade di possibilità per sperimentazioni in vivo ed ex vivo . Per istanza, interazioni cellula-cellula, la produzione di proteine e la risposta alla terapia o di manipolazione può essere studiati in vivo usando questi modelli5,6,7,8. D’importanza, posizionare luogo e l’ora può essere determinati con le apparecchiature di imaging corretta e metodologia. Qui, la microscopia intravital degli animali esprimenti un marker endoteliale in combinazione con agenti iniettabili in un tumore impiantato in una versione modificata dorsale dello skinfold camera di finestra è presentato.
Come tumore e lo sviluppo dei vasi del tumore, così come gli effetti terapeutici del tumore, sono processi altamente dinamici, videomicroscopia valutazione è uno strumento elegante per fare una corretta valutazione di questi processi in maniera temporale e spaziale. Con la crescente disponibilità di marcatori di cellule vive, la creazione di animali transgenici e la promozione di modalità di imaging, imaging videomicroscopia sta diventando sempre più popolare. Anche se l’istologia è ancora abitualmente utilizzato, e una moltitudine di indicatori può essere utilizzata per identificare le cellule e strutture, tessuto di sezionamento ha svantaggi quando studia i processi dinamici. Dissezione del tessuto è richiesta, fornendo solo informazioni statiche; fissazione influisce sulla qualità del tessuto; e affettare danneggia interazioni cellulari. Inoltre, durante l’analisi di processi dinamici, dissezione del tessuto agli intervalli di tempo differenti e spesso presunti, richiede una grande quantità di animali. Con videomicroscopia imaging, le dimensioni spaziali XYZ e la dimensione extra di tempo possono essere valutate nello stesso animale, permettendo il corretto posizionamento dei giocatori differenti nello spazio e nel tempo. Pertanto, non sono mancati momenti ottimali ed è ridotto significativamente il numero degli animali utilizzato per esperimento. In secondo luogo, l’intervallo di tempo stabilito con videomicroscopia valutazione possa essere estrapolato per ottimizzare l’estrazione del tessuto. In terzo luogo, la fase desiderata della crescita dei vasi può essere identificata intravitally e macchiata come un tessuto intero-monta.
Il design intravital citato in questo manoscritto utilizza una combinazione di animali transgenici che esprimono un’etichetta fluorescente in cellule endoteliali, una versione modificate dorsale dello skinfold camera modello e un microscopio confocale multifotonica dedicato.
Cellule endoteliali passare attraverso una serie di fasi21,22 durante l’angiogenesi, e queste fasi possono essere spesso visto contemporaneamente in un tumore. Utilizzando la linea di mouse eNOSTag-GFP, singole cellule endoteliali possono essere seguite, e anche filopodi dinamiche possono essere rintracciati. È quindi un buon modello per studiare lo sviluppo dei vasi intravitally. A seconda le etichette intrinseche già presente, iniettabili agenti fluorescenti possono essere utilizzati per valutare il lume, flusso sanguigno, stravaso e sangue clearance. Il mouse è imaged continuamente per fino a 5 h. La valutazione a lungo termine di un animale è fattibile quando sono prese alcune precauzioni per quanto riguarda l’anestesia dell’animale, che è stato descritto in precedenza23. Come questa ricerca si concentra sul cancro, tumori tessuto o le cellule sono state impiantate. Tuttavia, abbiamo anche sperimentato con metatarsi e polmoni embrionali. Tuttavia, il tasso di crescita del tessuto in fase di studio è limitante, come dopo un paio di settimane, la pelle inizia a ricrescere, che può essere un problema con i tumori a crescita lenta o tessuti.
Durante la fase di convalida, la dorsale che dello skinfold camera finestra era notevolmente modificato rispetto al modello classico4. I telai sono costruiti con materiale sintetico autoclavabile e sono leggeri e piccoli, con una zona di grande finestra vista. Il gancio dell’anello di tenuta (figura 1Bg, punta di freccia bianca) viene utilizzato solo per la facile rimozione dell’anello. Anelli di fermo senza ganci possono essere utilizzati quando questi interferiscono con la formazione immagine. La pelle non è allungata troppo, allentamento non si verifica in questo modello, e le infezioni sono solo raramente. Queste modifiche riducono il disagio dell’animale e perfezionare la procedura animale significativamente. Inoltre, le parti metalliche possono esser facilmente rimosso quando il tumore usando MRI24di imaging.
Qualsiasi microscopio può essere adottata per intravitally immagine dorsale dello skinfold chambers. Il requisito principale è lo spazio disponibile tra il tavolino del microscopio e la lente dell’obiettivo. Un aspetto importante che riguarda la formazione immagine è movimento. Per evitare artefatti da movimento, una piattaforma che si inserisce nella tabella microscopio (dopo la rimozione di tutti gli inserti) e supporta il mouse deve essere utilizzata. Non è necessaria a trattenere il mouse quando è sotto anestesia, ed è meglio lasciare che il respiro del mouse liberamente. Tuttavia, la finestra è imbullonata sulla piattaforma, dando il fissaggio ottimale del campo visivo (cioè, il tumore è visibile attraverso la camera di finestra). La piattaforma è riscaldata utilizzando un rilievo di riscaldamento elettronico, come usato per il riscaldamento degli animali. Questa piattaforma è stata fatta in casa, e specifiche possono essere ottenute su richiesta. Un obiettivo ad alta risoluzione è una necessità quando valutare processi intracellulari e permette di discriminare tra il citoplasma e il nucleo. L’uso di una lente conica con una buona risoluzione ottica (alta NA) ma una relativamente lunga distanza di lavoro (preferibilmente 2 mm o superiore) è raccomandato. La limitazione nell’imaging è la profondità di penetrazione e l’intensità di fluorescenza delle etichette. Inoltre, photobleaching, fototossicità e saturazione deve essere evitate durante la formazione immagine.
Qui, sono stati utilizzati un confocal-multifotonica integrato e un microscopio confocale. Il multifotonica è in posizione verticale, mentre il confocale è un microscopio invertito. Il vantaggio di un microscopio verticale è la facilità d’uso di lenti di immersione in acqua. Queste lenti hanno un alta NA e una lunga distanza di lavoro, anche a un ingrandimento di alta (per esempio, 20 o 40 X). In particolare, si consiglia di ottenere un obiettivo di immersione in acqua X NA 1.0 20, che è venduto da parecchie società. Essere consapevoli del fatto che, quando vengono utilizzate lenti ad immersione, l’obiettivo e il liquido di immersione bisogno di essere riscaldata a 37 ° C. Per le immagini migliori, si consiglia di utilizzare le impostazioni ottimali confocale (cioè, pinhole a 1 unità arioso, laser di potenza più basso guadagno possibile, non troppo alta (soprattutto se il guadagno introduce rumore), velocità al massimo e non con una media di scansioni di linea). Sovraesposizione, saturazione e la differenza di intensità tra immagini compromettere la qualità dei dati. Si raccomanda di evitare la saturazione e la sovraesposizione. Questo può essere aggirato con l’acquisizione di immagini impostazioni diverse di guadagno. Cambiare il guadagno è il modo più semplice per modificare la luminosità dell’immagine. Se necessario, la potenza del laser può essere regolata. Per standardizzare la qualità delle immagini, diapositive con un’intensità di fluorescenza fisso possono essere utilizzati. Si deve tenere a mente che, anche quando il microscopio è impostato in modo ottimale, qualità dell’immagine è determinata in larga misura dalla qualità della camera di finestra e del tessuto
Quando la scansione simultanea di più marcatori fluorescenti, trapasso, in cui viene rilevato un fluoroforo nel canale di un altro, deve essere evitato. Evitare di trapasso utilizzando una combinazione di fluorofori con minimi spettri sovrapposti e sequenziale di scansione tra i fotogrammi. Le immagini presentate qui sono state scannerizzate usando 3 scansioni sequenziali (traccia 1: GFP, DID o fluor647 con il laser 488 e 633; traccia 2: rodamina, Doxil o mTomato con il laser 543; e track 3: Hoechst con il laser 405).
La possibilità di valutare le diverse fasi di sviluppo del vaso del tumore, punta cella dinamiche, formazione lumen, stravaso e danno vascolare è mostrata qui. Utilizzando la riga di eNOStag-GFP, zone del tumore con un letto vascolare distrutto sono facilmente rilevabili da granulato cellulari avanzi ancora che esprimono GFP. Nessun agente iniettabile è stato rilevato in questi settori, che indica la mancanza di flusso. Ciò significa che somministrati agenti chemioterapeutici non raggiungerà neanche queste aree. Tuttavia, distruzione del vaso può anche essere un risultato terapeutico. Pre-valutazione del tumore, per verificare la distruzione del vaso di pre-trattamento, è un prerequisito per l’accurata valutazione terapeutica e può essere facilmente eseguita utilizzando questo disegno sperimentale.
C’è una pletora di possibilità per cui microscopia intravital può essere utilizzata, e discussione dettagliata esula dall’ambito della presente pubblicazione. Per dare una breve panoramica, possibili applicazioni includono studi sull’accumulo di chemioterapici nel tessuto del tumore, lo sviluppo dei vasi (ad esempio, il numero di vasi, rami e intersezioni) e del flusso sanguigno, interazioni cellula-cellula, cella di destinazione e processamento intracellulare, nonché esempi di cui sopra e mostrato qui. Analisi si basa sulla fluorescenza, tenere conto delle fluttuazioni di intensità a causa della qualità della finestra o del tessuto. Inoltre, come il tessuto del tumore è relativamente spesso, fluorescenza da sopra o sotto il piano della vista ha un impatto sul segnale nell’immagine. È meglio combinare l’analisi di immagine quantitativa con misurazioni oggettive. Per esempio, se siete interessati nelle concentrazioni nella droga, rimuovere il tessuto del tumore dalla finestra dopo microscopia intravital e determinare il farmaco contenuto utilizzando con HPLC da confrontare con le immagini confocale.
La valutazione della risposta tumorale può essere eseguita anche utilizzando questo modello, ma con alcune precauzioni. Uno deve rendersi conto che i tumori si sviluppano anche verso l’interno, nella pelle. Misurazioni 3D possono essere fatto se la penetrazione è abbastanza profonda per coprire l’intero tumore. In tal caso, da’ coloranti dovrebbero essere usati. La camera di finestra come descritto qui offerte con i tumori in un ambiente di pelle, ed è importante sottolineare che la finestra mantiene una temperatura leggermente inferiore rispetto alla temperatura corporea normale mouse. Pertanto, si consiglia di studiare i tumori in ambito ambientale in micro per confermare intravital studi con la dorsale dello skinfold camera di finestra. Soprattutto, la dorsale dello skinfold camera offre spaccato la cinetica dei processi e dei meccanismi, fornendo una base strumentale per il miglioramento della terapia. Inoltre, possono essere ottenuti informazioni extra sulla biodistribuzione e la farmacocinetica. Classicamente, questi studi di biodistribuzione sono eseguiti da trattare gli animali del tumore-cuscinetto e dissezione tumori/organi per misurare l’assorbimento del farmaco. Utilizzando questo modello videomicroscopia, la posizione di intratumoral di un farmaco (cioè, intravascolare, intratumoral, intracellulare, o nucleare) possa essere fornita5,25,26. Non solo è la posizione della droga ha rivelata, ma anche il tempo finestra-di-opportunità per l’assorbimento ottima.
Utilizzando il disegno sperimentale descritto in questo articolo, una vasta gamma di parametri può essere valutata in un contesto temporale e spaziale. In particolare, qui vi mostriamo che quello Microscopia intravital fornisce importanti intuizioni le dinamiche di sviluppo del vaso del tumore e della risposta terapeutica.
The authors have nothing to disclose.
Vorremmo ringraziare Rien van Haperen e Rini de Crom per il loro sviluppo e la donazione della linea eNOSTag-GFP, Joost A.P. Rens per la sua assistenza tecnica con il lavoro degli animali e i Guardiani dell’animale per il loro aiuto. Le strutture di microscopia utilizzate sono parte del centro di Imaging ottico di Erasmus, e vorremmo ringraziare il personale dell’OIC per il loro servizio. Questo studio è stato sostenuto da grant DDHK 2000-2224 dal Dutch Cancer Society, “Vereniging Trustfonds” Università Erasmus di Rotterdam e “Stichting Erasmus Heelkundig Kankeronderzoek”, e ringraziamo i membri dei comitati per la loro generosa donazione.
DMEM | Sigma | D1145 | Supplemented with 10% FCS |
Trypsin-versene (EDTA) | Lonza | BE17-161E | Make a 0.1% solution in PBS, sterile |
PBS | |||
Window frames | Costum made | ||
Filler glass 10 mm, 0.55 mm | Abrisia technologies | ||
Cover glass 12mm, #1 thickness | Thermo Scientific/VWR | 631-0713 | |
Hear removal gel (veet) | for sensitive skin | ||
Eye ointment | |||
Buprenorfine hydrochloride | use 0.05 mg/kg | ||
Anesthesia unit | O2/Isoflurane inhalation unit with an chamber and tubeing+cone | ||
insulin syringe 0.5ml x 12.7mm 29g, green | BD | 324824 | |
Needles 23G 1 1/4" | Braun | 4657640 | |
Needles 25G 5/8" | Braun | 4657853 | |
Sutures silkan 0.7 | Braun | 1134019 | |
Nuts | Jeveka | 934 A2 1 | |
Bolts | Jeveka | 84 A2 1 10 | |
0.9% NaCl | |||
Microscope + software | The space between table and objective need to be wide enough to hold the animal | ||
Heated temperature controlled platform | Costum made | ||
Window holder | Costum made | ||
tetramethylrhodamine 2,000,000 MW dextran | Invitrogen | D7139 | 100 µg/mouse |
Alexa-fluor 647 10,000 MW dextran | Invitrogen | D22914 | 100 µg/mouse |
Hoechst 33342 | Invitrogen | H1399 | 25 µg/mouse |
Pegulated nanoparticles | ref 5 | ||
LEICA TCS SP5 Multiphoton Microscope | Leica | ||
LAS AF Software | Leica |