このプロトコルは細胞特異的蛍光マーカーを発現するトランスジェニック マウスの生体イメージングを説明します。生体イメージングは、プロセスの顕微可視化が可能な埋込型の windows を使用して生きている動物の高解像度観測の非侵襲的な方法を提供します。このメソッドは、特に縦方向プロセスの研究に有用です。
腫瘍および腫瘍容器開発、腫瘍に対する治療は、非常にダイナミックな生物学的プロセスです。組織では、静的な情報提供し、正しい解釈のために十分ではない多くの場合。生体評価、プロセス、時間、続いては、余分なと多くの場合予期しない情報を提供します。いくつかの画像処理室の開発映像装置への改善と生細胞トレーサー細胞特異的マーカーを表現するトランスジェニック動物の作成、生体顕微鏡をよりよく理解する重要なツールとなっています。生物学的プロセス。時空的に腫瘍血管の開発と治療効果の調査のための実験計画について述べる.このセットアップを使用して、容器開発、先端の細胞と内腔形成、血流、血管外漏出、確立された血管床、血管破壊の段階することができます可視化し、続きます。さらに、治療効果、腫瘍の運命、そして劑のローカライズも行われます。
生体外で研究プロセスの高分解能運動イメージングを使用すると、生体外で実験は適切なコンテキストで評価を許可されません。例えば、培養プレートで管間質コンパートメントまたは薬剤配達および腫瘍内の分布と腫瘍細胞の相互作用を検討することはできません。動物モデルは人間生理学および病理学を模倣するため。ただし、プロセス、特に細胞内の解像度の縦画像です挑戦。分子イメージング法、磁気共鳴画像 (MRI) など単一光子放射または計算された断層レントゲン写真撮影 (SPECT)、陽電子放出断層レントゲン写真撮影 (ペット)、解像度不足が良い浸透深さがある解剖学的構造を説明するために失敗します。高解像度を提供し、構造のイメージングを可能に光イメージングが、最小限の浸透1に貧しい人々 を伴っています。アプリケーション ウィンドウとの組み合わせで生体顕微鏡の皮脂、背などの技術の部屋または腹部のウィンドウは、高解像度イメージング、生体2,3,4。この技術は、(例えば細胞間相互作用イメージのティッシュで)、適切なコンテキストでプロセスの画像、解像度の光学的限界で時間と数日、上縦画像のこと明確な利点高度な共焦点と多光子顕微鏡。
細胞やタンパク質特異蛍光ラベルとトランスジェニック動物の導入は、体内と体外の実験のための可能性の茄多を開きます。インスタンス、細胞間相互作用、蛋白質の生産および操作または療法への応答を検討することができるため体内のこれらを使用してモデル5,6,7,8.重要なは、配置場所と時間を適切なイメージ投射装置および方法論を決定ことができます。ここでは、生体顕微鏡変更されるの移植腫瘍における注射剤との組み合わせで内皮マーカーを表現する動物の背側皮下脂肪ウィンドウ商工会議所が発表します。
腫瘍治療効果と同様、腫瘍と腫瘍血管の開発は非常にダイナミックなプロセスであると生体評価は時間と空間依存的にこれらのプロセスの正しい評価をするための洗練されたツールです。生細胞マーカー、トランスジェニック動物の作成と画像診断法の進歩の増加する供給、生体イメージングは、ますます人気になっています。組織がまだ日常的に使用されているし細胞や構造を識別するために使用できるマーカーの数多く、ティッシュが不利な点ダイナミックなプロセスを調査するとき。組織の郭清が必要、静的な情報のみを提供します。固定組織の品質に影響を与える細胞間相互作用を損なうスライスします。また、ダイナミックなプロセスを調査するとき異なっているとしばしば推定時点で組織郭清動物の大規模な量が必要です。生体イメージングと XYZ 空間次元や時間の余分な次元を作る別の選手の適切な位置決め可能な空間と時間、同じ動物で評価できます。したがって、最適な時間ポイントが逃されない、実験ごとに使用される動物の数を大幅に削減します。第二に、組織抽出を最適化するために生体の評価と確立期間を推定できます。第三に、容器の成長の目的の段階を intravitally 識別して全体マウント組織としてステンド グラスします。
本稿に記載されている生体の設計は、皮下脂肪の溜まりモデルと専用の多光子共焦点顕微鏡背血管内皮細胞、変更された蛍光ラベルを表現するトランスジェニック動物の組み合わせを使用します。
血管内皮細胞は、血管新生中、ステージ21,22の数を通過し、腫瘍のこれらの段階が同時に見る多くの場合ことができます。ENOSTag GFP マウスの線を使用して、個々 の内皮細胞は続くことができるとも糸状のダイナミクスをたどることができます。したがって、intravitally 容器開発を勉強する良いモデルです。既に現在の固有のラベルによって注射蛍光剤は、管腔形成、血流、血管外漏出、および血のクリアランスを評価するために使えます。マウスは 5 h まで継続的に視覚化されます。動物の長期的な評価が可能な動物の麻酔に関するいくつかの注意事項が取られるときで前述されている23。この研究は癌に焦点を当てて、腫瘍組織や細胞が移植されました。しかし、我々 はまた中足骨および萌芽期の肺を試しました。ただし、調査の下で組織の成長速度は制限、肌が再生するを開始する数週間後、成長の遅い腫瘍または組織に問題になることができます。
検証フェーズでは、背の皮下脂肪ウィンドウ商工会議所が大幅に変更された古典的なモデル4と比較。フレームはオートクレーブ合成材料の組み立てられる、光と小さく、大規模なウィンドウ-表示領域で。(図 1Bg、白矢印) 止め輪のフックは、リングを簡単に除去の使用だけです。フックなしリテーナー リングは、これらのイメージングと干渉するときに使用できます。皮膚があまり伸長しないゆるみ、このモデルでは発生しませんし、感染症はまれにしか見られます。これらの変更は動物の不快感を軽減し、動物のプロシージャを大幅に絞り込みます。また、MRI24を使用して腫瘍をイメージングするときは、金属部品は簡単に削除できます。
Intravitally イメージの背に顕微鏡を採用できる皮下脂肪の部屋。主な要件は、顕微鏡ステージと対物レンズの間利用可能なスペースです。画像に影響を与える重要な側面は、運動です。動きの人工物を防ぐためには、(すべての挿入の除去) 後顕微鏡テーブルにフィットし、マウスをサポートするプラットフォームを使用してください。麻酔下では、マウスの呼吸を自由にできるように優れているときマウスを抑制する必要はありません。ただし、ウィンドウはビューのフィールドの最適な固定を与えるプラットフォーム上にボルトで固定 (すなわち腫瘍がウィンドウ チャンバーを介して表示されます)。家畜暖房用電子加熱パッドを使用してプラットフォームを加熱します。このプラットフォームは社内でつくられ、リクエストの詳細を得ることができます。高分解能対物レンズは不可欠な細胞内プロセスを評価するとき、細胞質と核の間で区別することが可能になります。優れた光学分解能 (高 NA) しかし、比較的長いテーパー レンズの使用作動距離 (できれば 2 mm 以上) をお勧めします。溶込み深さおよびラベルの蛍光イメージングの制限です。さらに、退色、光毒性、および彩度は、イメージ投射の間避けなければなりません。
ここでは、統合された共焦点多光子と共焦点顕微鏡は使用されました。多光子は直立、共焦点は倒立顕微鏡です。正立型顕微鏡の利点は、水浸漬レンズの使いです。これらのレンズがある高 NA と長作動距離、(例えば、 20 または 40 倍) の高倍率でも。具体的には、いくつかの企業が販売されている、20 の X NA 1.0 水浸漬レンズを取得することをお勧めします。浸漬のレンズを使用すると、対物レンズと浸漬液が 37 ° C まで加熱する必要ということに注意してください。最高の画像は勧め最適な共焦点設定を使用する (すなわちピンホール 1 風通しの良いユニットでレーザー出力可能なゲイン高すぎない限り低く (特に利得には、ノイズが導入されています) 場合、回線速度最大、およびスキャンの平均で)。露出、彩度、およびイメージの強度の違いは、データの品質を妥協します。彩度、露出オーバーを防ぐためにそれをお勧めします。これは、異なるゲイン設定で画像を取得することによって回避できます。ゲインの変更は、画像の明るさを変更する最も簡単な方法です。必要な場合は、レーザー パワーを調整できます。画像の品質を標準化するには、固定の蛍光強度を持つスライドを使用できます。顕微鏡が最適な状態に設定されている場合でも画質がウィンドウ商工会議所と組織の品質によってのかなりの程度まで決定は念頭にしておかなければなりません。
複数の蛍光マーカーを同時にスキャンするとき裁ち落としを通じて、もう 1 つのチャネルで 1 つの蛍光体が検出されたを避けなければなりません。裁ち落としを通じて最小重複スペクトルと蛍光物質の組み合わせを使用して、シーケンシャル スキャン フレーム間は避けてください。紹介画像は 3 連続したスキャンを使用してスキャンされた (トラック 1: GFP、DID や 488 と 633 レーザー; fluor647 トラック 2: 543 レーザー; mTomato や Doxil、ローダミン トラック 3 と: 405 レーザー ヘキスト)。
腫瘍血管の開発や先端細胞ダイナミクス、管腔形成、血管外漏出、血管損傷のいくつかの段階を評価する可能性を示しています。ENOStag GFP ラインを使用して、破壊された血管床と腫瘍エリア簡単にまだ gfp 粒状の細胞残り物によって検出されます。注射剤は見つかりませんでした、これらの分野の流れの欠如を示します。つまり、化学療法剤を投与では、これらの領域をどちらか届きません。ただし、容器破壊には治療の結果することができます。前処理容器破壊をチェックするため、腫瘍の前評価は、正確な治療評価のための前提条件で、この実験的なデザインを使用して簡単に実行できます。
生体顕微鏡を使える可能性の茄多があるし、詳細な議論はこの文書の範囲を超えています。可能なアプリケーションには簡単な洞察力を与えるためには、腫瘍組織の血管 (例えば船舶、分岐や交差の数) と血流、細胞間相互作用の開発化学療法の蓄積に関する研究が含まれますターゲットし細胞内処理と上記のここに示されている例をセルします。分析は、蛍光に基づいている、ウィンドウまたは組織の品質による強度変動の注意してください。また、腫瘍組織は比較的厚く、上下ビューの平面からの蛍光は画像の信号に影響を及ぼします。客観的な測定と定量画像解析法を結合することをお勧めします。例えば、薬物濃度に興味がある、生体顕微鏡観察後ウィンドウから腫瘍を削除してコンテンツ高速液体クロマトグラフィーを用いた共焦点の画像と比較するための薬剤を調べます。
まあこのモデルを使用して、いくつかの注意事項と、腫瘍の反応の評価を実行できます。1 つは、腫瘍が皮膚にで、内側も成長することを実現する必要があります。普及率は全体の腫瘍をカバーするために十分に深い場合、3 D 計測が可能です。このような場合、遠赤色染料を使用してください。としてウィンドウ チャンバーは肌環境の腫瘍にお得な情報をここで説明し、指摘するウィンドウが通常のマウスの体温よりも若干低い温度を維持することが重要です。そのため、皮下脂肪のウィンドウの商工会議所、背と生体研究を確認する右マイクロ環境設定で腫瘍を勉強することをお勧めします。重要なは、背側皮下脂肪室プロセスおよび療法の改善のため機器の基礎を提供するメカニズムの動力学への洞察力。また、体内分布および薬物動態に関する追加情報を取得できます。従来、これらの体内研究は担腫瘍動物の治療と薬剤の吸収を測定する腫瘍/臓器の解剖によって実行されます。この生体モデルを使用して (すなわち、血管内、腫瘍、細胞内、または核) 薬の腫瘍の場所が5,25,26提供できます。だけでなくは、明らかにされるも、時間ウィンドウ–機会の最適な吸収のため薬の場所です。
この資料に記載されている実験的なデザインを使用して、広範なパラメーターを時空設定で評価できます。具体的には、ここでその生体顕微鏡による腫瘍血管の開発と治療反応の動態に重要な洞察を提供していますを紹介します。
The authors have nothing to disclose.
我々 は開発の eNOSTag GFP ライン、Joost 兼 Ren の動物の仕事と彼のテクニカル サポートおよび彼らの助けのための動物の介護の寄付なし・ ヴァン ・ Haperen、リニ ・ デ ・ Crom を感謝したいです。顕微鏡施設エラスムス光イメージング センターの一部であるし、我々 は彼らのサービスの OIC のスタッフに感謝したいと思います。この研究はオランダのがん学会、「Vereniging Trustfonds」エラスムス大学ロッテルダム、”スティヒティング エラスムス Heelkundig Kankeronderzoek”から DDHK 2000-2224 の助成金によって支えられた、我々 は彼らの寛大な寄付のための委員会メンバーに感謝。
DMEM | Sigma | D1145 | Supplemented with 10% FCS |
Trypsin-versene (EDTA) | Lonza | BE17-161E | Make a 0.1% solution in PBS, sterile |
PBS | |||
Window frames | Costum made | ||
Filler glass 10 mm, 0.55 mm | Abrisia technologies | ||
Cover glass 12mm, #1 thickness | Thermo Scientific/VWR | 631-0713 | |
Hear removal gel (veet) | for sensitive skin | ||
Eye ointment | |||
Buprenorfine hydrochloride | use 0.05 mg/kg | ||
Anesthesia unit | O2/Isoflurane inhalation unit with an chamber and tubeing+cone | ||
insulin syringe 0.5ml x 12.7mm 29g, green | BD | 324824 | |
Needles 23G 1 1/4" | Braun | 4657640 | |
Needles 25G 5/8" | Braun | 4657853 | |
Sutures silkan 0.7 | Braun | 1134019 | |
Nuts | Jeveka | 934 A2 1 | |
Bolts | Jeveka | 84 A2 1 10 | |
0.9% NaCl | |||
Microscope + software | The space between table and objective need to be wide enough to hold the animal | ||
Heated temperature controlled platform | Costum made | ||
Window holder | Costum made | ||
tetramethylrhodamine 2,000,000 MW dextran | Invitrogen | D7139 | 100 µg/mouse |
Alexa-fluor 647 10,000 MW dextran | Invitrogen | D22914 | 100 µg/mouse |
Hoechst 33342 | Invitrogen | H1399 | 25 µg/mouse |
Pegulated nanoparticles | ref 5 | ||
LEICA TCS SP5 Multiphoton Microscope | Leica | ||
LAS AF Software | Leica |