Этот протокол описывает прижизненной визуализации трансгенных мышей, выражая клеток конкретных флуоресцентных маркеров. Прижизненные изображения обеспечивает неинвазивный метод для высокого разрешения наблюдений в живых животных с помощью имплантируемых windows, через которые возможен микроскопических визуализации процессов. Этот метод особенно полезен для изучения продольной процессов.
Опухоли и опухоли судно развития, а также опухоли ответ терапии, являются весьма динамических биологических процессов. Гистология обеспечивает статическую информацию и часто не является достаточным для правильной интерпретации. Прижизненной оценки, в котором процесс следует вовремя, обеспечивает дополнительную и часто неожиданные информацию. С созданием трансгенных животных, выражая клеток специфических маркеров и живых клеток-трассировщиков, усовершенствования оборудования для формирования изображений и развития несколько тепловизионных камер прижизненной микроскопии стал важным инструментом для лучшего понимания биологические процессы. Этот документ описывает экспериментальный дизайн для исследования развития опухоли судна и лечебного воздействия на основе пространственных и временных. С помощью этой установки, стадии развития судна, подсказки ячейки и Люмене формирования, поток крови, кровоподтек, установленного сосудистого русла и сосудистой уничтожения может визуализировать и следовать. Кроме того может также следовать терапевтические эффекты, внутриопухолевых судьбы и локализация химиотерапевтических соединений.
Хотя в vitro исследования включить разрешением кинетическая Визуализация процессов, в пробирке экспериментов не даст оценки в надлежащем контексте. Например взаимодействие опухолевых клеток стромы отсеках или доставки лекарств и распределения внутри опухоли не могут быть изучены в пластине культуры. Поэтому Животные модели используются для имитации человеческой физиологии и патологии. Однако продольной томографии процессов, особенно на субклеточном резолюции, является сложной задачей. Молекулярные методы обработки изображений, как магнитно-резонансная томография (МРТ), Однофотонная эмиссионная компьютерная томографии (ОФЭКТ) и позитронно-эмиссионная томография (ПЭТ), имеют хорошее проникновение глубины, но отсутствие резолюции или не проиллюстрировать анатомических структур. Оптических изображений обеспечивает высокое разрешение и визуализации структуры, но оно сопровождается бедных минимальное проникновение1. Приложение прижизненной микроскопии в сочетании с окном камеры технологии, такие как спинной skinfold или брюшной окно, позволяет с высоким разрешением изображений в vivo2,3,4. Эта технология имеет явные преимущества, так как позволяет для продольной томографии течение часов и даже дней, для визуализации процессов в надлежащем контексте (например, ячейке взаимодействий в образ ткани) и на оптические пределы резолюций Расширенные multiphoton и конфокальные микроскопы.
Введение трансгенных животных с конкретной ячейки или белка флуоресцентные метки открывает множество возможностей для in vivo и ex vivo экспериментов. Для экземпляра, ячейке взаимодействий, производство белков и ответ на манипуляции или терапии могут быть изучены в естественных условиях с помощью этих моделей5,6,,78. Важно отметить, что положение в месте и времени могут быть определены с надлежащего оборудования для формирования изображений и методологии. Здесь, прижизненной микроскопии животных, выражая маркера эндотелиальной в сочетании с инъекционными агентов в опухоли имплантируются в модифицированных спинной складки окно камеры представлена.
Как высоко-динамичные процессы, опухоли и опухоли судно развития, а также опухоли терапевтические эффекты, прижизненные Оценка является элегантный инструмент сделать правильную оценку этих процессов в духе и пространственной зависящие от времени. С растущей доступности живой клетки маркеров, создание трансгенных животных и улучшения визуализации формы прижизненные изображения становится все более и более популярным. Хотя Гистологическая картина по-прежнему широко используется, и множество маркеров могут использоваться для идентификации клеток и структур, разрезания ткани имеет недостатки, когда исследование динамических процессов. Рассечение тканей требуется, только статической информации; Фиксация влияет на качество ткани; и нарезки ущерб сотовой взаимодействий. Кроме того при изучении динамических процессов, рассечение тканей разных и часто предполагается, время-точках требуется большое количество животных. С прижизненной визуализации, XYZ пространственных измерений и дополнительное измерение времени может быть оценен в то же самое животное, делая возможным надлежащего позиционирования различных игроков в пространстве и времени. Таким образом оптимальное время точек не пропустили, и животных номер, используемый в эксперимент значительно уменьшается. Во-вторых время окна с прижизненной оценки могут быть экстраполированы оптимизировать добычу ткани. В-третьих желаемого стадии роста судно может определены прижизненно и окрашенных в целом гора ткани.
Прижизненные дизайн, упомянутых в этой рукописи использует комбинацию трансгенных животных, выражая флуоресцентные метки в эндотелиальных клетках, изменение спинной складки камеры модель и выделенный multiphoton конфокального микроскопа.
Эндотелиальные клетки пройти через ряд этапов21,22 во время ангиогенеза, и эти этапы можно часто увидеть одновременно в опухоль. С помощью мыши линии eNOSTag-GFP, отдельные эндотелиальные клетки могут следовать, и даже filopodia динамики могут быть прослежены. Поэтому это хорошая модель для изучения развития судна прижизненно. В зависимости от уже в настоящее время имеющих внутренних меток инъекционные флуоресцентные агентов может использоваться для оценки формирования люмен, поток крови, кровоподтек и крови распродажа. Мышь является непрерывно образы для до 5 ч. Возможна долгосрочная оценка животного когда несколько меры относительно наркоза животного, которое было описано ранее23. Поскольку данное исследование сосредоточено на рак, опухоли ткани или клетки были имплантированы. Однако мы также экспериментировали с плюсны и эмбриональных легких. Однако темпы роста тканей под исследование ограничивается, как через пару недель, кожа начинает вырастить, который может быть проблемой с медленно растущие опухоли или тканей.
На этапе проверки, спинной значительно измененной складки окно камеры по сравнению с классической модели4. Рамы изготовлены из синтетического материала автоклавируемый и легкий и небольшой, с видом окна области. Крючок кольцо (рис 1Bg, белые стрелки) используется только для легкого удаления кольца. Стопорные кольца без крючков может использоваться, когда они мешают изображений. Кожа растягивается не слишком много, ослабив не происходит в этой модели, и только редко встречаются инфекции. Эти изменения уменьшить животных дискомфорт и значительно усовершенствовать процедуре животных. Кроме того металлические части могут быть легко удалены при визуализации опухоли с помощью МРТ24.
Любое микроскоп может быть принят прижизненно изображение спинной складки камер. Основным требованием является доступное пространство между микроскопа и объектива. Важным аспектом, который влияет на изображений является движение. Для предотвращения артефактов движения, следует использовать платформу, которая вписывается в таблице микроскоп (после удаления всех вставок) и поддерживает мышь. Это не необходимо сдерживать мыши, когда он находится под наркозом, и это лучше, чтобы мыши дыхание свободно. Однако, окно болтами на платформе, давая оптимальное фиксирование поле зрения (т.е., опухоль видна через окно камеры). Платформа нагревается с помощью электронных грелки, как для животных отопления. Эта платформа была сделана собственными силами, и особенности могут быть получены по запросу. Высоким разрешением объектив является необходимостью при оценке внутриклеточных процессов и делает возможным различать цитоплазмы и ядра. Использование конические линзы с хорошим оптическим разрешением (высокая NA) но относительно длительного рабочее расстояние (желательно 2 мм или выше) рекомендуется. Ограничение в изображений является глубина проникновения и интенсивности флуоресценции меток. Кроме того Фотообесцвечивание, Фототоксичность и насыщенность следует избегать во время визуализации.
Здесь были использованы комплексной конфокальный multiphoton и конфокального микроскопа. Multiphoton вертикально, в то время как конфокальный является инвертированным микроскопом. Преимуществом прямо микроскопом является легко использования линз погружения в воду. Эти объективы имеют высокий NA и длинный рабочее расстояние, даже с увеличением средней (например, 20 или 40 X). В частности рекомендуется для получения 20 X NA 1.0 погружения в воду объектив, который продается несколькими компаниями. Имейте в виду, что, когда используются линзы погружения, объектива и погружения жидкости, необходимо нагревать до 37 ° C. Для лучших изображений, рекомендуется использовать оптимальные настройки конфокальный (т.е., Пинхол на 1 блок Эйри, как низкий, как возможно, выигрыш не слишком высокая мощность лазера, (особенно если выигрыш представляет шум), линии скорость на максимум и не усреднения сканирования). Передержка, насыщенность и разница в интенсивности между изображениями компромисс качества данных. Рекомендуется для предотвращения насыщения и передержки. Это можно обойти путем приобретения изображений на различных получить настройки. Изменение усиления это самый простой способ изменить яркость изображения. При необходимости, можно отрегулировать мощность лазера. Чтобы стандартизировать качество изображения, может использоваться слайды с фиксированной флюоресценция света. Надо иметь в виду, что даже если микроскоп оптимально, качество изображения определяется в значительной степени качество окно камеры и ткани
При сканировании нескольких флуоресцентные маркеры одновременно, обрез через, в которой одна Флюорофор обнаруживается в канале еще один, следует избегать. Избегайте через кровь, используя сочетание флуорофоров с минимальными перекрывающиеся спектры и последовательное сканирование между кадрами. Изображения, представленные здесь были отсканированы с помощью 3 последовательных сканирований (трек 1: GFP, DID или fluor647 лазером 488 и 633; трек 2: родамин, Doxil или mTomato лазером 543; и отслеживать 3: Hoechst лазером 405).
Здесь показана возможность оценки несколько этапов развития опухоли судна, подсказки ячейки динамики, формирования люмен, кровоподтек и сосудистых повреждений. Использование линии eNOStag-GFP, опухоли районы с разрушенной сосудистого русла легко обнаруживаются гранулированный сотовой остатки, по-прежнему выражая GFP. Инъекционные агент не был обнаружен в этих областях, указанием отсутствие потока. Это означает, что управляемый химиотерапевтических агентов не достигнет этих областях либо. Однако судно уничтожения также может быть лечебный результат. Предварительная оценка опухоли, чтобы проверить для уничтожения предварительной обработки судна, является предварительным условием для точной оценки терапевтических и может быть легко выполнена с помощью этот экспериментальный дизайн.
Существует множество возможностей, для которых может использоваться прижизненной микроскопии, и подробное обсуждение выходит за рамки этой публикации. Чтобы дать краткое представление, возможности применения включают исследования на накопление химиотерапевтические в опухолевой ткани, развитие судов (например, количество судов, ветви и пересечений) и потока крови, клеток взаимодействий, Сотовый ориентации и внутриклеточных обработки, а также примеры, упомянутые выше и показано здесь. Анализ основан на флуоресценции, необходимо учитывать колебания интенсивности благодаря качеству окна или ткани. Кроме того как опухолевой ткани довольно толстым, флуоресценции от выше или ниже плоскости зрения влияет на сигнал в изображении. Лучше всего сочетать анализ количественных изображений с объективными измерениями. Например если вы заинтересованы в концентрации наркотиков, удалить опухолевой ткани из окна после прижизненной микроскопии и определения контента, используя с ВЭЖХ для сравнения с конфокальный изображений наркотиков.
Оценка реакции опухоли могут выполняться как также с помощью этой модели, но с некоторые меры предосторожности. Надо понимать, что опухоли также растут внутрь, в кожу. 3D-измерения можно сделать если проникновения достаточно глубоко, чтобы покрыть весь опухоли. В таком случае следует использовать far-red красителей. Окно камеры как описано здесь сделок с опухолями в среде кожи, и это важно отметить, что окно поддерживает температуру немного ниже, чем температура тела нормальные мыши. Таким образом это лучше для изучения опухолей в право микро экологической обстановке для подтверждения прижизненной исследования с спинной складки окно камеры. Важно отметить, что спинной складки палата предлагает понимание кинетики процессов и механизмов, инструментальной основой для совершенствования терапии. Кроме того можно получить дополнительную информацию о накопление и Фармакокинетика. Классически эти исследования накопление осуществляется лечение опухоли подшипник животных и рассекает опухоли/органов для измерения потребления наркотиков. С помощью этой прижизненной модели, расположение внутриопухолевых препарата (т.е. внутрисосудистая, внутриопухолевых, внутриклеточный, или ядерной) могут быть предоставлены5,25,26. Это не только место показал, но также время окна из возможность для наиболее оптимальное усвоение препарата.
С помощью экспериментальный дизайн, описанные в этой статье, широкий спектр параметров может быть оценен в условиях временных и пространственных. В частности здесь мы показываем, что прижизненной микроскопии предоставляет важную информацию о динамике развития опухоли судна и терапевтические реакции.
The authors have nothing to disclose.
Мы хотели бы поблагодарить Rien Ван Haperen и де Crom Rini для их развития и пожертвование линии eNOSTag-GFP, Joost а.п. Rens его технической помощи с работой животных и животных уход за их помощь. Микроскопия объектов, используемых являются частью центра Эразма оптических изображений, и мы хотели бы поблагодарить сотрудников ОИК за их службу. Это исследование было поддержано Грант DDHK 2000-2224 от голландского общества рака, Роттердам университета Erasmus «Vereniging Trustfonds» и «Stichting Эразма Heelkundig Kankeronderzoek», и мы благодарим членов комитетов за их щедрые пожертвования.
DMEM | Sigma | D1145 | Supplemented with 10% FCS |
Trypsin-versene (EDTA) | Lonza | BE17-161E | Make a 0.1% solution in PBS, sterile |
PBS | |||
Window frames | Costum made | ||
Filler glass 10 mm, 0.55 mm | Abrisia technologies | ||
Cover glass 12mm, #1 thickness | Thermo Scientific/VWR | 631-0713 | |
Hear removal gel (veet) | for sensitive skin | ||
Eye ointment | |||
Buprenorfine hydrochloride | use 0.05 mg/kg | ||
Anesthesia unit | O2/Isoflurane inhalation unit with an chamber and tubeing+cone | ||
insulin syringe 0.5ml x 12.7mm 29g, green | BD | 324824 | |
Needles 23G 1 1/4" | Braun | 4657640 | |
Needles 25G 5/8" | Braun | 4657853 | |
Sutures silkan 0.7 | Braun | 1134019 | |
Nuts | Jeveka | 934 A2 1 | |
Bolts | Jeveka | 84 A2 1 10 | |
0.9% NaCl | |||
Microscope + software | The space between table and objective need to be wide enough to hold the animal | ||
Heated temperature controlled platform | Costum made | ||
Window holder | Costum made | ||
tetramethylrhodamine 2,000,000 MW dextran | Invitrogen | D7139 | 100 µg/mouse |
Alexa-fluor 647 10,000 MW dextran | Invitrogen | D22914 | 100 µg/mouse |
Hoechst 33342 | Invitrogen | H1399 | 25 µg/mouse |
Pegulated nanoparticles | ref 5 | ||
LEICA TCS SP5 Multiphoton Microscope | Leica | ||
LAS AF Software | Leica |