Introduction
عيوب العظام الكبيرة الناتجة عن إصابات أو عدوى أو سرطان الغازية لها تأثير كبير على الانتعاش المريض ونوعية الحياة. وتوجد أساليب لملء هذه العيوب مع العظام صحية من أماكن أخرى في جسم المريض نفسه، ولكن هذا التحويل يحمل الاعتلال الخاص وخطر حدوث مضاعفات 1، 2، 3. وعلاوة على ذلك، بعض العيوب كبيرة جدا أو معقدة كافية العظام المانحة غير متوفر لملء العيب. الأجهزة التعويضية هي خيار محتمل لملء العيوب العظمية ولكن هذه ترتبط مع العديد من العيوب بما في ذلك خطر العدوى، وفشل في الأجهزة، ورد فعل جسم غريب (4).
لهذه الأسباب هناك اهتماما كبيرا في إمكانية هندسة بدائل العظام البيولوجية باستخدام خلايا المريض نفسه 5. الخلايا اللحمية الدهنية المشتقة (مخولا لصيانة طائرات)لديها إمكانات لهذا التطبيق لأنها متوفرة بكثرة في الأنسجة الدهنية للمريض والتي أظهرت القدرة على شفاء عيوب العظام عن طريق توليد جديدة العظام نسيج 6، 7. مخولا لصيانة طائرات هي مجموعة متنوعة من السكان من الخلايا والعديد من الدراسات أظهرت أن اختيار لعلامات سطح الخلية محددة يمكن أن تنتج سكان الخلية مع تعزيز النشاط عظمية 8 و 9. ان اختيار مخولا لصيانة طائرات وفقا لأعلى إمكانات عظمية تزيد من احتمال أن سقالة المصنف مع هذه الخلايا يمكن تجديد عيب العظام الكبيرة.
عظم البروتين المخلق (BMP) إشارات حاسمة لتنظيم التمايز تكوين العظام و10 ونوع BMP مستقبلات IB (BMPR-IB) ومن المعروف أنها مهمة لتكون العظم في مخولا لصيانة طائرات 11. مؤخرا، لقد أظهرنا أنه تعبير عن BMPR-IB يمكن بالبريد تستخدم لتحديد لمخولا لصيانة طائرات مع تعزيز النشاط عظمي المنشأ 12. هنا علينا أن نظهر بروتوكول لعزل BMPR-IB، معربا عن مخولا لصيانة طائرات من الدهون البشرية يليه فحص نشاطهم عظمي المنشأ باستخدام المجراة قبي نموذج عيب.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تم الحصول على عينات من المرضى الذين أعطوا الموافقة المسبقة عن: ملاحظة. تم استعراض كافة البروتوكولات والموافقة عليها من قبل جامعة ستانفورد مجلس المراجعة المؤسسية المناسبة. أثناء التعامل مع الأنسجة والخلايا البشرية، تلتزم دائما السلامة الأحيائية المستوى 2 (BSL2) الاحتياطات، على النحو المحدد من قبل مؤسستكم.
1. إعداد الكواشف
- إعداد FACS العازلة: إضافة 10 مل FBS و 5 مل بولوكسامير 188 و 5 مل القلم بكتيريا الى 500 مل العقيمة مخزنة المالحة الفوسفات (PBS).
- إعداد هضم خليط: إضافة 0.375 ز جيم hemolyticum نوع كولاجيناز الثاني مسحوق و 5 مل بولوكسامير 188-500 مل العقيمة 199 / EBSS المتوسطة.
- إعداد المتوسطة القياسية: إضافة 50 مل FBS و 5 مل القلم بكتيريا إلى 500 مل Dulbecco لتعديل النسر متوسطة.
2. حصاد وعزل مخولا لصيانة طائرات
ملاحظة: تأكد من الموافقات مؤسسية كافية في مكانها الصحيح لاستخدام الأنسجة البشرية ولعزل حالخلايا الجذعية أومان. الحصول على البطن البشري، الجناح، أو الفخذ الدهون تحت الجلد من متبرع سليم تمر شفط الدهون انتخابي. الحفاظ على الدهون في شفط علبة بلاستيكية.
- إضافة برنامج تلفزيوني العقيمة في نسبة 1: 1 للدهون في علبة من البلاستيك الأصلي. (إذا كان هناك 500 مل الدهون، إضافة 500 مل PBS). مزيج من قبل الإثارة لطيف لمدة 30 ثانية. السماح للطبقة المائية لتستقر في القاع (الشكل 1)، ثم نضح وتجاهل الطبقة المائية مع ماصة 10 مل من البلاستيك تعلق على الشفط.
- صب الدهن في وعاء بلاستيكي كبير وإضافة هضم الخليط في نسبة 1: 1. إغلاق الحاويات وتنظيف خارج مع 70٪ من الإيثانول. ختم غطاء مع فيلم البارافين.
- تستنهض الهمم هذه الحاوية في شاكر المداري في 180 دورة في الدقيقة عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
- تحييد الهضم عن طريق إضافة المتوسطة القياسية في نسبة 1: 1. (إذا كان هناك 1000 مل الدهون الخليط، إضافة 1000 مل المتوسطة قياسي).
- توزيع الخليط بالتساوي إلى عدد زوجي من 250 مل البلاستيك أنابيب الطرد المركزي مخروطي الشكل والطرد المركزي الخليط في 300 x ج لمدة 20 دقيقة في 4 درجات مئوية.
- نضح طاف ونكون حذرين للمغادرة بيليه سليمة. الكريات resuspend في 5 مل المتوسطة القياسية لكل أنبوب مخروطي الشكل.
- تصفية تعليق من خلال مرشح 100 ميكرون في واحدة من 50 مل أنبوب مخروطي أجهزة الطرد المركزي. ثم، الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 15 دقيقة على 4 درجات مئوية.
- نضح طاف و resuspend بيليه في 5 مل درجة حرارة الغرفة العازلة تحلل كريات الدم الحمراء. يسمح هذا المزيج على الجلوس لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة ثم الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (RT).
- نضح طاف و resuspend بيليه في 15 مل المتوسطة القياسية. تصفية مرة أخرى من خلال تصفية 100 ميكرون إلى 50 مل أنبوب الطرد المركزي مخروطي.
- في جديد 50 مل المخروطية، إضافة 15 مل من محلول polysucrose مصممة للفصل على أساس الكثافة (انظر قائمة الكواشف). ثم، وعقد أنبوب في زاوية 45 درجة، ماصة بعناية الخلايا على جانبالأنبوب بحيث تعليق خلية بلطف طبقات فوق الحل polysucrose (الشكل 2).
ملاحظة: من المهم أن خلايا ماصة على سطح الحل. لا تقم بإضافة حل polysucrose الى تعليق الخلايا حيث سيؤدي ذلك إلى خلق خليط لا رجعة فيه. وبالمثل، لا ماصة الخلايا في وسط الحل polysucrose. - أجهزة الطرد المركزي لهذا الخليط في 300 x ج لمدة 10 دقيقة في RT. استخدام تسارع منخفض (2-3 من أصل 10)، وضبط وظيفة الفرامل من أجهزة الطرد المركزي إلى الصفر لهذه الخطوة.
ملاحظة: سوف ثلاث طبقات تكون واضحة: واضح على الجزء السفلي، غائم في الوسط، وعلى رأس بلون السلمون. وطبقة وسطى تحتوي على خلايا الفائدة. - باستخدام ماصة 10 مل إزالة بعناية وطبقة وسطى ونقل إلى 50 أنبوب جديد مل المخروطية.
ملاحظة: من هو أفضل لنقل تماما وطبقة وسطى وفي عملية اتخاذ بعض الطبقات العليا والسفلى من أن تترك وراءها بعض من الطبقة الوسطى. <لى> عد الخلايا باستخدام عدادة الكريات وتحديد إجمالي عدد الخلايا الحية.
وأضاف نحن نستخدم عادة الأزرق التريبان إلى خليط الخلية إلى تركيز النهائي من 0.8٪ للمساعدة في عد الخلايا: ملاحظة. والخلايا الحية قابلة للحياة لا يستغرق أكثر من صبغة زرقاء وسوف تظهر بيضاء.
3. نظام مراقبة الأصول الميدانية الفرز لBMPR-IB خلايا إيجابية وإعداد السقالات التي تحتوي على خلية
- الطرد المركزي تعليق خلية في 300 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. resuspend الخلايا في المخزن FACS بتركيز من 1 مليون خلية لكل 100 ميكرولتر (استنادا إلى عدد خلايا فعلت في الخطوة 2.13).
- تحويل 10 مليون شخص على الأقل الخلايا إلى أنبوب الطرد المركزي البلاستيك المسمى "BMPR-IB". بشكل منفصل، نقل مليون الخلايا في 100 العازلة ميكرولتر FACS إلى أنبوب الطرد المركزي بلاستيكية منفصلة المسمى "غير ملوثين". إضافة 1 مل العازلة FACS إلى أنبوب "غير ملوثين". الحفاظ على ما تبقى من الخلايا في المخزن FACS على الجليد في حين أن نظام مراقبة الأصول الميدانية الفرز جزء من EXPERويجري iment. تسمية هذه الخلايا "لم يتم فرزها." استخدام هذه عناصر تحكم في وقت لاحق في التجربة.
- إضافة كمية مناسبة من مكافحة الإنسان الأجسام المضادة BMPR-IB الفلورسنت لأنبوب "BMPR-IB" وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. ماصة الخليط صعودا وهبوطا بلطف لتوزيع الأجسام المضادة.
ملاحظة: نحن نستخدم الإنسان BMPR-IB / ALK-6 الأجسام المضادة APC مترافق في التخفيف 01:10 (انظر قائمة الكواشف لمزيد من التفاصيل). ومع ذلك، فإن الأجسام المضادة من مختلف الصانعين وتركيزات الموصى مختلفة. - تغطية دلو الجليد بطريقة تحافظ من الضوء. السماح للخليط الخلية / الأجسام المضادة للجلوس لمدة 30 دقيقة (أو وفقا لتعليمات الشركة المصنعة الأجسام المضادة).
ملاحظة: إذا كان يأتي الأجسام المضادة لمكافحة BMPR-IB كما الأجسام المضادة اللامقترن الأساسي الذي يتطلب الضد الثانوية، نفذ خطوة تلطيخ منفصلة على الجليد مع الأجسام المضادة الثانوية وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. - أجهزة الطرد المركزي لكلا أنابيب في300 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. نضح طاف، والحرص على عدم نضح بيليه. resuspend الخلايا مكعبات في 1 مل العازلة FACS. مرة أخرى أنابيب الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 5 دقائق. نضح بعناية وطاف resuspend الخلايا في المخزن FACS إلى تركيز من 1 مليون خلية لكل 1 مل.
- تصفية "BMPR-IB"، "غير ملوثين"، و "خلايا غير المصنفة" من خلال 40 ميكرون مصافى الخلية في أنابيب زجاجية FACS جديدة المسمى. شطف المرشحات مع 500 العازلة ميكرولتر FACS للتأكد من أن الخلايا لا تترك وراءها في التصفية. أيضا إضافة 2 مل المتوسطة القياسية لاثنين من أنابيب الطرد المركزي البلاستيك منفصلة المسمى "BMPR-IB-ايجابية" و "BMPR-IB-سلبي". استخدام هذين لجمع الخلايا مرتبة في الجهاز نظام مراقبة الأصول الميدانية.
- على الجهاز نظام مراقبة الأصول الميدانية، استخدام الخلايا غير ملوثين لتحديد بوابة السلبية للعلامة فلوري.
- باستخدام فوهة 100 ميكرون، نوع BMPR-IB خلايا الإيجابية والسلبية في أنابيب منهما يخدعtaining المتوسطة القياسية. إبقاء هذه الأنابيب المبردة عند 4 درجات مئوية خلال هذا النوع إذا كان الجهاز FACS ديها هذه القدرة.
ملاحظة: يرجى الرجوع إلى المادة JOVE 13 من شارون وآخرون. لبروتوكول ممتازة لنظام مراقبة الأصول الميدانية الفرز. - باستخدام عدادة الكريات، عد الخلايا في كل أنبوب. الطرد المركزي "BMPR-IB إيجابية"، "BMPR-IB سلبية"، و "أنابيب غير المصنفة" في 300 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية، ونضح طاف، والحرص على عدم تعكير صفو بيليه الخلية. ثم resuspend الخلايا في المتوسط القياسي لتركيز 1 مليون خلية لكل 250 ميليلتر.
- الحصول على قطع قبل 4 مم PLGA السقالات المغلفة مع هيدروكسيباتيت (بولي [حامض اللبنيك الذي اشترك في الجليكوليك]). وضع كل سقالة في بئر من 24 لوحة جيدا. تغطية كل سقالة مع 50 ميكرولتر من تعليق خلية من واحدة من المجموعات الثلاث (ط حدده.د-، 200،000 الخلايا.): لم يتم فرزها،-IB إيجابية BMPR، وBMPR-IB-السالب (الشكل 3).
ملاحظة: الرجاءالرجوع إلى مقالة JOVE 14 من لو وآخرون. لمزيد من التفاصيل حول بناء السقالات PLGA. - ملء جزئيا الآبار الفارغة المحيطة المتوسطة القياسية (لمنع جفاف السقالات)، وتغطية لوحة مع غطاء لها، واحتضان في حاضنة الثقافة خلية عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
4. إنشاء العيوب قبي وتطبيق ACS التي تحتوي على سقالة
ملاحظة: تأكد من أن الموافقات مؤسسية كافية في مكانها الصحيح لإنشاء عيوب قبي في الفئران الحية. تمت الموافقة على هذا البروتوكول من قبل لجنة رعاية الحيوان المؤسسية واستخدم جامعة ستانفورد.
- تخدير قرص 1 الماوس عارية باستخدام الغاز الأيزوفلورين استنشاقه أو حقنه طويل المفعول كوكتيل مخدر.
- لاستخدام الغاز وحده، ضع الماوس إلى غرفة التخدير وبدء تدفق الأكسجين في 2-3 لتر / دقيقة مع تركيز 2٪ من الأيزوفلورين. وبمجرد أن الفأر هو واللاوعي ully، وضعه عرضة على الحارة بطانية إعادة تدوير المياه مع وسادة absorbant ووضع خطم لها في مخروط الأنف التخدير مع نفس تركيز الأكسجين والأيزوفلورين. رصد دقيق لمعدل التنفس وضبط تركيز الأيزوفلورين حسب الحاجة.
- لاستخدام حقن طويلة المفعول كوكتيل مخدر، تخدير الماوس في غرفة التخدير كما هو موضح أعلاه ثم حقن مخدر كوكتيل. إزالة الماوس من غرفة التخدير ومراقبة سلوكها.
ملاحظة: الماوس قد يظهر لفترة وجيزة من التخدير ولكن في غضون عدة دقائق وينبغي مرة أخرى تخدير تماما تحت تأثير مخدر حقن. نقل الماوس إلى الحارة بطانية إعادة تدوير المياه مغطاة وسادة absorbant.
ملاحظة: للحصول على كوكتيل مخدر، ونحن نوصي مزيج يحتوي على الكيتامين 10 ملغ / مل وزيلازين 1 ملغ / مل في محلول ملحي، وسلمت البريتونى. الجرعة المعيارية من هذا الخليط هو300 ميكرولتر لمدة 30 ز الفأر، وهو ما يعادل الكيتامين 100 ملغ / كغ وزيلازين 10 ملغ / كغ. راجع قسم مناقشة لمزيد من التفاصيل بشأن حقن مخدر. - استخدام مناورة قرصة أخمص قدميه لتحديد عمق التخدير. سوف الماوس تخدير كاف لا تتراجع مخلب لها عندما يتم مقروص أنها خفيفة من قبل الجراح.
- تطبيق مرهم العين لمنع جفاف القرنية.
- إدارة 1 ملغم / كغم البوبرينورفين ريال تحت الجلد.
ملاحظة: توفير تسكين السابقة الى نتائج عملية جراحية في تخفيف الآلام متفوقة. - خلال الإجراء بأكمله، ومراقبة معدل التنفس من الفأرة.
ملاحظة: فأر تخدير بشكل صحيح تحت الأيزوفلورين ينبغي أن يكون معدل التنفس من 50-100 الأنفاس / دقيقة. يدل على وجود زيادة في معدل التنفس الذي تخدير خفيف جدا، في حين أن معدل التنفس انخفضت قد تشير إلى أن التخدير عميق جدا.
- الإعدادية الجلد من الجانب الظهري للجمجمة مع بوفيدون IODالمعهد الوطني للإحصاء حل تليها الايثانول 70٪ ثلاث مرات. ثنى مع الستائر العقيمة، وترك موقع الجراحة المكشوفة.
ملاحظة: ارتداء القفازات الجراحية المعقمة والحفاظ على تقنية معقمة أثناء العملية. لمس الأسطح فقط معقمة وأشياء مثل ثنى العقيمة والصكوك تعقيمها. هل لديك مساعد ضبط الإضاءة، والحزم خياطة مفتوحة، الخ - باستخدام مشرط 15 شفرة، وجعل شق خط الوسط سهمي الذي يمتد على معظم الجمجمة ظهري. باستخدام ملقط مسنن غرامة، التراجع عن الجلد في الجانب الأيمن من شق لفضح الصحيح العظم الجداري.
- باستخدام الحفر مع تعقيمها 4 مم المغلفة الماس منقب مثقاب، حفر الخلل من خلال العظم الجداري. لا تمديد عيب الماضي العظام في طبقة الأم الجافية. (الشكل 4)
- ضع سقالة في عيب، ومن ثم إغلاق شق الجلد مع تشغيل خياطة النايلون.
- مراقبة الماوس وتوفير معيار الرعاية بعد العملية الجراحية لccording لمبادئ التوجيهية المؤسسية.
- الحفاظ على الماوس على منشفة ورقية نظيفة داخل قفص نظيفة في الوقت الذي يتعافى. ينبغي أن توضع نصف من القفص أكثر من الحارة بطانية إعادة تدوير المياه، وينبغي في البداية أن وضع الماوس في هذا الشوط.
- لا تترك الماوس غير المراقب حتى استعاد وعيه كافية لambulate. لا إرجاع الفأر الذي خضع لعملية جراحية لقفص مع فئران أخرى حتى يتم الشفاء منها تماما.
- كرر الخطوات المذكورة أعلاه مع ماوس جديد لكل السقالة التي سيتم اختبارها. تعقيم الأدوات الجراحية في بين العمليات الجراحية باستخدام معقم حبة ساخنة أو طريقة أخرى مناسبة.
- بعد وقت قصير من إجراء، ثم في 2 و 4 و 6 و 8 أسابيع، استخدم الصغير مسح CT لتحليل معدل إغلاق عيب قبة القحف.
ملاحظة: انظر مقال ليفي وآخرون. 6 للحصول على وصف الاشعة المقطعية الصغير من العيوب قبي. - عندما التجربة COMPLEالشركة المصرية للاتصالات، الموت ببطء الفئران عن طريق وضعها في غرفة القتل الرحيم نظيفة وبدء تدفق غاز ثاني أكسيد الكربون في غرفة بمعدل 2 لتر / دقيقة. بعد التنفس قد توقف تماما (بعد ما يقرب من 10 دقيقة) أداء خلع عنق الرحم لتأكيد القتل الرحيم.
- اختياريا، بعد اكتمال التجربة، واستخدام باجتزاء وتلطيخ النسيجي لتقييم تكوين العظام داخل عيب.
ملاحظة: انظر مقال مكاردل وآخرون. 12 لمزيد من التفاصيل من إعداد العظام العينات لالأنسجة. لمراجعة التقنيات النسيجية وتلطيخ، انظر دليل النسيجي مثل دليل لعلم الأمراض الجراحية 15.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
مايكرو الاشعة المقطعية القيام به في يوم من الجراحة سوف تظهر بوضوح الخلل الجمجمة. في هذا الوقت لن يكون هناك نشوب إلى الخلل 4 مم. ويتم الحصول على مسح لاحقة مع مرور الوقت لقياس حجم الخلل مع مرور الوقت بالمقارنة مع خط الأساس. يجب أن العيوب المصنف مع BMPR-IB + الخلايا إظهار المزيد من الإغلاق السريع لعيب بالمقارنة مع BMPR-IB- والخلايا غير المصنفة (الشكل 5). بالإضافة إلى ذلك، جزء من الجمجمة التي تحتوي على خلل يمكن decalcified ومعالجتها للالأنسجة باستخدام الأساليب القياسية 12. سوف أقسام ملطخة صمة عار pentachrome Movat لتكشف عن أكبر تجديد العظام في خلل تعامل مع الخلايا BMPR-IB مقارنة مع سكان الخلية الأخرى (الشكل 6).
الشكل 1: Lipoaspirate بعد برنامج تلفزيوني غسل. قوية> تتم إضافة علبة من lipoaspirate بعد برنامج تلفزيوني وسمحت الخليط إلى تسوية. طبقة الأنسجة العليا هي الأنسجة الدهنية التي تستضيف مخولا لصيانة طائرات، في حين أن الطبقة السفلية هي الطبقة المائية، التي تتألف أساسا من المياه المالحة والدم. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: تنسيب تعليق خلية على Polysucrose الحل. (أ) يجب أن pipetted تعليق خلية بلطف شديد على الجانب من الأنبوب، والسماح لها طبقة على رأس من الحل polysucrose. (ب) وهذا هو مظهر الصحيح للطبقة تعليق الخلية على رأس polysucrose قبل الطرد المركزي."> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل (3): البذر من الخلايا على سقالة. (أ) على سطح عقيمة من جانب واحد من 24 لوحة جيدا ثقافة الخلية، تحميل سقالة الجافة مع ما يقرب من 50 ميكرولتر من التعليق الخلية. (ب) احتضان سقالة في حاضنة الثقافة خلية لمدة 30 دقيقة للسماح التصاق الخلية. ملاحظة: في الشكل، يتم استخدام لوحة 10 سم لأغراض العرض التوضيحي. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: إنشاء لقبي عيب. الخلل قبة القحف (السهام) مرئيا داخلفتح شق الجلد. ملاحظة الأوعية الدموية الجافية سليمة (السهام)، مشيرا إلى أن الحفر لم خرق الجافية. شريط النطاق، 5 ملم. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 5: شفاء من العيوب قبي الحرجة الحجم مع القطعان ASC مختلفة. تم تنفيذ (أ) إعادة البناء CT الدقيقة ثلاثية الأبعاد للعيوب قبي اعيد يقترن لم يتم فرزها، BMPR-IB (+)، أو BMPR-IB (-) مخولا لصيانة طائرات. (ب) الكمي للشفاء في 8 أسابيع أظهرت أكبر بكثير تجديد العظام مع مخولا لصيانة طائرات (92٪) BMPR-IB (+) مقارنة مع فرزها وBMPR-IB (-) مخولا لصيانة طائرات (58٪ و 46٪ على التوالي، ** ع < 0.01). وشوهدت اختلافات كبيرة في الشفاء أيضا في 2 نحنEKS (** ف <0.01)، و 4 أسابيع (*** P <0.001)، و 6 أسابيع (*** P <0.001). مايكرو-CT، المحسوبة الصغيرة التصوير المقطعي. أعيد طبعها بإذن من مكاردل وآخرون. 12. أشرطة الخطأ تمثل الانحراف المعياري. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 6: تلطيخ النسيجي العظام التجدد. تلطيخ pentachrome (A) Movat من العظام التجدد عيوب إصلاحه مع فرزها، BMPR-IB (+)، أو BMPR-IB (-) مخولا لصيانة طائرات في 5X التكبير باستخدام مشرق المجهري الميدان. ملاحظة تكوين العظام أكثر قوة في مجموعة BMPR-IB (+) مقارنة مع BMPR-IB - المجموعة (). يمثل خط منقط على مدى المنطقة عيب. يظهر منطقة داخل المستطيل الأسود على أعلى Magnific علىأوجه استخدام (B) 10X و (C) 40X المجهر مشرق الميدان من منطقة عيب. أعيد طبعها بإذن من مكاردل وآخرون. 12. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
خطوات حاسمة في إطار بروتوكول
خلال موسم الحصاد من مخولا لصيانة طائرات، فإن الخطوة الحاسمة هي الهضم كافية من الدهون مع كولاجيناز. سوف الهضم وعدم كفاية يؤدي إلى العائد المنخفض من مخولا لصيانة طائرات. خلال FACS الفرز من خلايا + BMPR-IB، فمن المهم أن تحدد بعناية البوابة بالفيروس. تحديد بوابات فضفاضة جدا قد يؤدي الى السكان فرزها ليست نقية. خلال إنشاء عيب قبة القحف، فمن الأهمية بمكان لحفر الخلل من خلال عظم الجمجمة ولكن لعدم المضي قدما في الأم الجافية. وهذا سوف يسبب النزيف الغزير والتعرض للدماغ، وهو ما يستلزم القتل الرحيم للحيوان.
التعديلات واستكشاف الأخطاء وإصلاحها
وفيما يتعلق التخدير لعملية جراحية عيب قبي، لدينا مختبر يفضل استخدام الأيزوفلورين استنشاقه، ولكن هناك خيار آخر هو لحقن داخل الصفاق مزيج يحتوي على تركيز النهائي من الكيتامين 10 ملغ / مل وزيلازين 1 ملغ / مل في سا الطبيعيخط. الجرعة المعيارية من هذا الخليط هو 300 ميكرولتر لمدة 30 ز الماوس. وهذا يوفر ما يقرب من 30 دقيقة من التخدير الموثوق بها التي لا تتطلب الماوس ليكون في مخروط الأنف الأيزوفلورين أثناء الجراحة. سيئات استخدام مخدر حقن هو أنه ليس من الممكن خفض جرعة بعد الحقن. في المقابل، يمكن الأيزوفلورين استنشاقها بسهولة معاير أعلى أو لأسفل في الوقت الحقيقي.
عند إضافة تعليق الخلية إلى سقالة، قد يجد الباحثون أن حجم السائل هو صغير جدا، وسوف تتبخر جزئيا في 30 دقيقة من الحضانة. التبخر يمكن أن يسبب موت الخلايا، وهو المحير ضارة وخاصة في التجارب العظام الشفاء. لمكافحة هذه، تحميل سقالة داخل بئر من 24 لوحة جيدا. ملء الآبار المحيطة مباشرة مع المتوسط العادي. وهذا خلق مرطب للبيئة الجزئي الذي يساعد في الحفاظ على سقالة المحملة من الجفاف.
تلطيخ النسيجي من العظام قبلdicated على زوال الكلس الصحيح وشامل للالقبة قبل التضمين وباجتزاء. ومن المتفق عليه أن الجماجم من الأعمار المختلفة تتطلب فترات متفاوتة من زوال الكلس، يتم عادة في محلول EDTA
القيود المفروضة على تقنية
هذا البروتوكول يستخدم عيب قبة القحف 4 ملم لتقييم قدرة السكان من الخلايا لتعزيز إغلاق عيب. هذا النموذج قد لا محاكاة تضميد الجراح التي تحدث في بيئة أكثر تعقيدا، مثل كسر العظام الطويلة أو استئصال الورم. لهذا السبب، قد تحتاج إلى استخدامها لفهم مساهمة مخولا لصيانة طائرات لالتئام العظام في هذه الإعدادات نماذج حيوانية بديلة.
أهمية تقنية مع الاحترام لالحالية / الطرق البديلة
باستخدام التدفق الخلوي لعزل السكان ASC محددة هي تقنية واعدة لتعزيز الشفاء والتجدد في سياق الأنسجة المتعددة وفينماذج لجنة التحكيم، مثل الأوعية الدموية، تكون الشحم، وتكون العظم. هو استكشاف فائدة خلايا موالية للالمكونة للعظم في هذه الدراسة، مما يدل على تأثير عميق مع الخلايا المحددة بشكل إيجابي لBMPR-IB في الشفاء عيب قبة القحف.
البروتوكولات السابقة لعزل ASC تشمل زراعة الخلايا لعدة أيام على لوحات ثقافة الخلية 16. ومع ذلك، قد الخلايا تجربة الانجراف المظهرية كبير بينما في الثقافة. لهذا السبب، ونحن نستخدم بروتوكول العزلة ASC الذي يسمح لعزل السريع لهذه الخلايا، تليها مزيد من تنقية حيوانية باستخدام نظام مراقبة الأصول الميدانية. ويتم إنجاز الإجراء بأكمله في أقل من يوم واحد، والتقليل من آثار علامة سطح الخلية أو الانجراف المظهري.
التطبيقات المستقبلية والاتجاهات
لقد أثبتنا أن مخولا لصيانة طائرات التعبير عن غاية BMPR-IB يبرهن على وجود قدرة أكبر على تعزيز التجدد الشفاء عيب العظام مقارنة مع مخولا لصيانة طائرات أخرى. آليات underlyجي هذه الظاهرة ليست معروفة. على سبيل المثال، فإنه ليس من الواضح ما إذا كانت الخلايا نفسها التفريق مباشرة إلى الخلايا المكونة للعظام، أو ما إذا كانت تنتج العوامل التي تشجع خلايا أخرى للقيام بذلك. سوف تحتاج إلى أن تتم الإجابة على هذه الأسئلة الدراسات المستقبلية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 micron cell strainer | Falcon | 352360 | |
| 15 blade scalpel | Miltex | 4-515 | |
| 24 well plate | Corning | 3524 | |
| 40 micron cell strainer | Falcon | 352340 | |
| 50 mL conical centrifuge tubes | Falcon | 352098 | |
| 6-0 Ethilon nylon suture, 18", P-3 needle, | Ethicon | 1698G | |
| Anti-BMPR-IB primary antibody | R&D systems | FAB5051A | |
| BioGel PI surgical gloves | Mölnlycke Health Care | ALA42675Z | |
| Buprenorphine SR | ZooPharm | ||
| Castro-Viejo needle driver | Fine Science Tools | 12565-14 | |
| CD1 nude mouse | Charles River | 086 | |
| Collagenase Type II powder | Gibco | 17101-015 | |
| DMEM medium | Gibco | 10564-011 | |
| Drill: Circular knife 4.0 mm | Xemax Surgical | CK40 | |
| Drill: Z500 Brushless Micromotor | NSK | NSKZ500 | |
| FBS | Gicbo | 10437-077 | |
| Fisherbrand Absorbent Underpads, 20" x 24" | Fisher Scientific | 14-206-62 | |
| Fisherbrand Sterile cotton gauze pad, 4" x 4" | Fisher Scientific | 22-415-469 | |
| Heating pad | Kent Scientific | DCT-20 | |
| Hyclone 199/EBSS medium | GE Life Sciences | SH30253.01 | |
| Isothesia isoflurane | Henry Schein | 050033 | |
| Micro Forceps with teeth | Roboz | RS-5150 | |
| Micro Forceps with teeth | Roboz | RS-5150 | |
| Paraffin film (Parafilm) | Bemis | PM996 | |
| PBS | Gibco | 10010-023 | |
| Pen-Strep | Gibco | 15140-122 | |
| PLGA scaffolds | Proprietary Formulation | ||
| Poloxamer 188, 10% | Sigma | P5556-100ML | |
| Polylined Sterile Field, 18" x 24" | Busse Hospital Disposables | 696 | Cut a rectangular hole of the appropriate size |
| Polysucrose Solution: Histopaque 1119 | Sigma | 11191 | |
| Povidone Iodine Prep Solution | Medline | MDS093944H | |
| Puralube petrolatum ophthalmic ointment, 1/8 oz. tube | Dechra Veterinary Products | ||
| RBC lysis buffer | Sigma | 11814389001 | |
| Webcol alcohol prep swabs | Covidien | 6818 |
References
- Silber, J. S., et al. Donor site morbidity after anterior iliac crest bone harvest for single-level anterior cervical discectomy and fusion. Spine (Phila Pa 1976). 28 (2), 134-139 (2003).
- Giannoudis, P. V., Dinopoulos, H., Tsiridis, E. Bone substitutes: an update. Injury. 36, S20-S27 (2005).
- Laurencin, C., Khan, Y., El-Amin, S. F. Bone graft substitutes. Expert Rev Med Devices. 3 (1), 49-57 (2006).
- Walmsley, G. G., et al. Nanotechnology in bone tissue engineering. Nanomedicine. 11 (5), 1253-1263 (2015).
- Chapekar, M. S. Tissue engineering: challenges and opportunities. J Biomed Mater Res. 53 (6), 617-620 (2000).
- Levi, B., et al. Human adipose derived stromal cells heal critical size mouse calvarial defects. PLoS One. 5 (6), e11177 (2010).
- Gimble, J. M., Katz, A. J., Bunnell, B. A. Adipose-derived stem cells for regenerative medicine. Circ Res. 100 (9), 1249-1260 (2007).
- Levi, B., et al. CD105 protein depletion enhances human adipose-derived stromal cell osteogenesis through reduction of transforming growth factor beta1 (TGF-beta1) signaling. J Biol Chem. 286 (45), 39497-39509 (2011).
- Chung, M. T., et al. CD90 (Thy-1)-positive selection enhances osteogenic capacity of human adipose-derived stromal cells. Tissue Eng Part A. 19 (7-8), 989-997 (2013).
- Wozney, J. M., et al. Novel regulators of bone formation: molecular clones and activities. Science. 242 (4885), 1528-1534 (1988).
- Wan, D. C., et al. Osteogenic differentiation of mouse adipose-derived adult stromal cells requires retinoic acid and bone morphogenetic protein receptor type IB signaling. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (33), 12335-12340 (2006).
- McArdle, A., et al. Positive selection for bone morphogenetic protein receptor type-IB promotes differentiation and specification of human adipose-derived stromal cells toward an osteogenic lineage. Tissue Eng Part A. 20 (21-22), 3031-3040 (2014).
- Sharon, Y., Alon, L., Glanz, S., Servais, C., Erez, N. Isolation of normal and cancer-associated fibroblasts from fresh tissues by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS). J Vis Exp. (71), e4425 (2013).
- Lo, D. D., et al. Repair of a critical-sized calvarial defect model using adipose-derived stromal cells harvested from lipoaspirate. J Vis Exp. (68), (2012).
- Lester, S. C. Manual of surgical pathology. , Saunders/Elsevier. (2010).
- Bunnell, B. A., Flaat, M., Gagliardi, C., Patel, B., Ripoll, C. Adipose-derived stem cells: isolation, expansion and differentiation. Methods. 45 (2), 115-120 (2008).
