Introduction
défauts osseux majeurs résultant d'une lésion, une infection ou un cancer invasif ont un impact significatif sur la récupération et la qualité de vie d'un patient. Il existe des techniques pour combler ces défauts avec l' os sain d'ailleurs dans son propre corps du patient, mais ce transfert porte sa propre morbidité et risque de complications 1, 2, 3. En outre, certains défauts sont si importantes ou complexes que l'os donneur suffisante ne sont pas disponibles pour combler le défaut. Dispositifs prothétiques sont une option potentielle pour le remplissage de défauts osseux , mais ceux - ci sont associés à plusieurs inconvénients , notamment le risque d'infection, panne matérielle, et la réaction de corps étranger 4.
Pour ces raisons , il y a un grand intérêt dans la possibilité de l' ingénierie des substituts osseux biologiques en utilisant les propres cellules d'un patient 5. cellules stromales adipeuses (CSA)ont le potentiel pour cette application , car ils sont disponibles en abondance dans le propre tissu adipeux du patient et ils ont démontré la capacité de guérir les défauts osseux en générant un nouveau tissu osseux 6, 7. ASCs sont une population hétérogène de cellules , et plusieurs études ont montré que la sélection de marqueurs spécifiques de la surface cellulaire peut produire des populations de cellules ayant une activité améliorée ostéogénique 8, 9. La sélection ASCs avec le potentiel le plus élevé ostéogénique augmenterait la probabilité qu'un échafaudage tête de série avec ces cellules peut régénérer un grand défaut osseux.
Une protéine morphogénétique osseuse (BMP) de signalisation est essentielle pour la régulation de la différenciation osseuse et la formation 10 et le type de récepteur de BMP IB (BMPR-IB) est connu pour être important pour l' ostéogenèse dans ASCs 11. Récemment, nous avons montré que l'expression de BMPR-IB peut be utilisée pour sélectionner ASCs avec une activité accrue ostéogénique 12. Ici , nous démontrons un protocole pour l'isolement de l' ASC de la graisse humaine , suivie par un test de leur activité ostéogénique in vivo en utilisant un modèle calvarial de défaut BMPR-IB-exprimant.
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Protocol
NOTE: Les échantillons ont été obtenus à partir de patients qui ont donné leur consentement éclairé. Tous les protocoles ont été examinés et approuvés par le comité d'examen institutionnel de l'Université de Stanford approprié. Lors de la manipulation des tissus et cellules humains, toujours adhérer à biosécurité de niveau 2 (NSB2) précautions, tel que spécifié par votre institution.
1. Préparation des réactifs
- Préparer un tampon FACS: Ajouter 10 ml de FBS, 5 ml de Poloxamer 188 et 5 ml de Pen-Strep à 500 ml de solution saline tamponnée au phosphate stérile (PBS).
- Préparer digérer mélange: Ajouter 0,375 g C. hemolyticum collagénase de type II en poudre et 5 mL Poloxamer 188 à 500 ml stérile 199 moyennes / EBSS.
- Préparer un milieu standard: Ajouter 50 ml de FBS et 5 ml Pen-Strep à 500 mL de Dulbecco Modified Eagle Medium.
2. Récolte et isolement de ASCs
NOTE: Veiller à ce que les approbations institutionnelles adéquates sont en place pour l'utilisation de tissus humains et pour isoler hcellules souches Uman. Obtenir abdominale humaine, le flanc ou la cuisse graisse sous-cutanée d'un donneur sain subissant la liposuccion élective. Gardez la graisse dans une boîte d'aspiration en plastique.
- Ajouter du PBS stérile dans un rapport de 1: 1 à la matière grasse dans le récipient en plastique d'origine. (En cas de 500 ml de matières grasses, ajouter 500 ml de PBS). Mélanger par agitation douce pendant 30 s. Permettre à la couche aqueuse pour déposer au fond (figure 1), puis aspirer et éliminer la phase aqueuse avec une pipette de 10 ml en matière plastique fixée à l' aspiration.
- Décanter la graisse dans un grand récipient en plastique et ajouter digérer le mélange dans un rapport 1: 1. Fermer le récipient et nettoyer l'extérieur avec 70% d'éthanol. Sceller le bouchon avec un film de paraffine.
- Agiter ce récipient dans un agitateur orbital à 180 tours par minute à 37 ° C pendant 30 min.
- Neutraliser la digestion en ajoutant un milieu standard dans un rapport 1: 1. (En cas de mélange de matières grasses 1000 ml, ajouter 1 000 ml de milieu standard).
- Distribuer le mélange également dans un nombre pair de 250 ml en plastique de tubes à centrifuger conique et centrifuger le mélange à 300 xg pendant 20 min à 4 ° C
- Aspirer le surnageant et faire attention à laisser le culot intact. pellets Resuspendre dans 5 ml de milieu standard pour chaque tube conique.
- Filtrer la suspension à travers un filtre de 100 microns dans un 50 ml tube conique de centrifugeuse. Ensuite, centrifuger à 300 g pendant 15 min à 4 ° C.
- Aspirer le surnageant et resuspendre le culot dans un tampon de lyse RBC mL de la température ambiante 5. Laisser le mélange reposer pendant 5 min à température ambiante puis centrifuger à 300 g pendant 15 min à température ambiante (RT).
- Aspirer le surnageant et remettre le culot dans 15 ml de milieu standard. filtrer à nouveau à travers un filtre de 100 microns dans un tube à centrifuger conique de 50 ml.
- Dans un nouveau ml conique 50, ajouter 15 solution de polysucrose mL conçu pour la séparation basé sur la densité (voir la liste des réactifs). Puis, tenant le tube à un angle de 45 °, pipette soigneusement les cellules sur le côté dele tube de telle sorte que la suspension de cellules en douceur des couches au - dessus de la solution de polysaccharose (figure 2).
Remarque: il est important de cellules de pipette sur la surface de la solution. Ne pas ajouter de solution polysucrose à une suspension de cellules car cela va créer un mélange irréversible. De même, ne pas introduire à la pipette les cellules dans le milieu de la solution de polysaccharose. - Centrifugeuse ce mélange à 300 g pendant 10 min à température ambiante. Utiliser une faible accélération (2 - 3 sur 10) et régler la fonction de frein de la centrifugeuse à zéro pour cette étape.
NOTE: Trois couches sont visibles: clair sur le fond, nuageux dans le milieu, et de couleur saumon sur le dessus. La couche intermédiaire contient les cellules d'intérêt. - En utilisant une pipette de 10 ml retirer délicatement la couche médiane et transfert à un nouveau tube de 50 ml conique.
NOTE: Il est préférable de transférer complètement la couche intermédiaire et dans le processus de prendre quelques-unes des couches supérieures et inférieures que de laisser derrière une partie de la couche intermédiaire. <li> Compter les cellules en utilisant un hémocytomètre et de déterminer le nombre total de cellules vivantes.
REMARQUE: On utilise typiquement le bleu trypan a ajouté au mélange de cellules à une concentration finale de 0,8% pour faciliter le comptage des cellules. cellules vivantes Viable ne prendra pas le colorant bleu et blanc apparaissent.
3. FACS de tri pour BMPR-IB cellules positives et Préparation de scellants contenant des cellules
- Centrifuger la suspension cellulaire à 300 xg pendant 5 min à 4 ° C. Remettre en suspension les cellules dans un tampon FACS à une concentration de 1 million de cellules par 100 pi (basé sur la numération cellulaire effectuée à l'étape 2.13).
- Transfert au moins 10 millions de cellules dans un tube de centrifugeuse en plastique étiqueté «BMPR-IB." Par ailleurs, le transfert d'un million de cellules dans 100 ul de tampon FACS à un tube de centrifugation en plastique séparée intitulée «non marqué». Ajouter 1 tampon FACS ml au tube "non marqué". Gardez le reste des cellules dans un tampon FACS sur la glace tandis que les FACS partie de l'exper de trimode de est fait. Marquez ces cellules "Unsorted." Utilisez-les comme témoins plus tard dans l'expérience.
- Ajouter une quantité appropriée d'un anticorps fluorescent BMPR-IB anti-humaine au tube "BMPR-IB" selon les instructions du fabricant. Pipeter le mélange monter et descendre doucement pour répartir l'anticorps.
NOTE: Nous utilisons un humain BMPR-IB / ALK-6 Anticorps APC conjugué à une dilution de 1:10 (voir la liste des réactifs pour les détails). Cependant, les anticorps provenant de différents fabricants auront différentes concentrations recommandées. - Couvrir le seau à glace d'une manière qui maintient la lumière. Laisser le mélange cellules / anticorps à reposer pendant 30 minutes (ou selon les instructions du fabricant de l'anticorps).
REMARQUE: si l'anticorps anti-BMPR-IB est un anticorps non conjugué primaire qui nécessite un anticorps secondaire, effectuer une étape de coloration distincte sur la glace avec l'anticorps secondaire selon les instructions du fabricant. - Centrifuger les tubes à300 g pendant 5 min à 4 ° C. Aspirer le surnageant, en faisant attention de ne pas aspirer le culot. Resuspendre les cellules sédimentées dans un tampon 1 FACS mL. centrifuger à nouveau les tubes à 300 xg pendant 5 min. Aspirer soigneusement le surnageant et remettre en suspension les cellules dans un tampon FACS à une concentration de 1 million de cellules par 1 ml.
- Filtrer le "BMPR-IB», «non marqué» et «cellules non triées" à travers 40 microns crépines cellulaires dans de nouveaux tubes FACS de verre étiquetés. Rincer les filtres avec 500 pi de tampon FACS pour assurer que les cellules ne soient pas laissés dans le filtre. Également ajouter 2 ml de milieu standard pour deux tubes de centrifugation en plastique séparés étiquetés «BMPR-IB-positif» et «BMPR-IB-négatif." Utiliser ces deux pour recueillir les cellules triées dans la machine FACS.
- Sur la machine FACS, en utilisant les cellules non colorées pour définir une grille négative pour le marqueur fluorescent.
- En utilisant une buse 100 microns, de tri BMPR-IB cellules positives et négatives dans les tubes respectifs concontenant un milieu standard. Gardez ces tubes réfrigérés à 4 ° C au cours de la sorte si la machine FACS a cette capacité.
NOTE: S'il vous plaît se référer à l'article 13 JOVE par Sharon et al. pour un excellent protocole de tri FACS. - L'utilisation d'un hémocytomètre, compter les cellules dans chaque tube. Centrifuger le "BMPR-IB-positif", "BMPR-IB-négative» et «tubes non triés» à 300 xg pendant 5 min à 4 ° C et aspirer le surnageant, en faisant attention à ne pas perturber le culot cellulaire. Puis remettre en suspension les cellules dans un milieu standard à une concentration de 1 million de cellules par 250 pi.
- Obtenir prédécoupée 4 mm PLGA (poly [acide lactique-co-glycolique]) échafauds revêtus d'hydroxyapatite. Placez chaque échafaudage dans un puits d'une plaque de 24 puits. Couvrir chaque échafaudage avec 50 pl de suspension cellulaire de l' un des trois groupes (i .e, 200.000 cellules.): Celebres, BMPR-IB-positif, et BMPR-IB-négatif (Figure 3).
NOTE: S'il vous plaîtse référer à l'article 14 JOVE par Lo et al. pour plus de détails sur la construction d'échafaudages PLGA. - Remplir partiellement les puits vides entourant avec un milieu standard (pour empêcher la dessiccation des échafauds), couvrent la plaque avec son couvercle et incuber dans un incubateur de culture de cellules à 37 ° C pendant 30 min.
4. Création de défauts calvarial et application des ACS contenant Échafaudages
NOTE: Veiller à ce que les approbations institutionnelles adéquates sont en place pour la création de défauts calvaria dans des souris vivantes. Ce protocole a été approuvé par le Comité institutionnel de protection et de l'utilisation des animaux de l'Université de Stanford.
- Anesthetize un CD-1 souris nude en utilisant soit le gaz isoflurane inhalée ou longue durée d'action cocktail anesthésique injecté.
- Pour utiliser le gaz seul, placer la souris dans une chambre d'anesthésie et démarrer le flux d'oxygène à 2 - 3 L / min avec une concentration d'isoflurane à 2%. Une fois que la souris est fully inconsciente, placez-le sur une tendance générale de recirculation de l'eau chaude avec un tampon absorbant et placer son museau dans un cône de nez anesthésie avec la même concentration d'oxygène et de l'isoflurane. Surveiller attentivement la fréquence respiratoire et ajuster la concentration d'isoflurane au besoin.
- Pour utiliser une longue durée d'action cocktail anesthésique injecté, anesthésier la souris dans une chambre d'anesthésie comme décrit ci-dessus, puis injecter le cocktail anesthésique. Retirez la souris de la chambre de l'anesthésie et observer son comportement.
REMARQUE: La souris peut rapidement sortir de l'anesthésie mais en quelques minutes devrait être à nouveau totalement anesthésiées sous l'effet de l'anesthésique injecté. Transférer la souris pour une couverture de recirculation d'eau chaude recouvert d'un tampon absorbant.
NOTE: Pour un cocktail anesthésique, nous recommandons un mélange contenant de la kétamine 10 mg / mL et de xylazine 1 mg / ml dans une solution saline normale, délivrée par voie intrapéritonéale. La dose standard de ce mélange est300 ul pour une souris de 30 g, ce qui équivaut à la Kétamine 100 mg / kg et de xylazine 10 mg / kg. Voir la section de discussion pour plus de détails concernant l'anesthésique injectable. - Utilisez une manœuvre orteil de pincement pour déterminer la profondeur de l'anesthésie. Une souris anesthésiée adéquate ne se rétracte pas sa patte quand elle est légèrement pincé par le chirurgien.
- Appliquer une pommade oculaire pour éviter le dessèchement de la cornée.
- Administrer 1 mg / kg buprénorphine SR voie sous-cutanée.
REMARQUE: Fournir une analgésie avant les résultats de la chirurgie dans le soulagement de la douleur supérieure. - Au cours de la procédure, surveiller la fréquence respiratoire de la souris.
NOTE: Une souris correctement anesthésiés sous isoflurane devrait avoir une fréquence respiratoire de 50 - 100 respirations / min. Une augmentation du rythme respiratoire indique que l'anesthésie est trop léger, tandis qu'un taux respiratoire diminué peut indiquer que l'anesthésie est trop profonde.
- Prep la peau de la face dorsale du crâne avec povidone-iodsolution ine suivie d'éthanol à 70% trois fois. Drapé avec des champs stériles, en laissant le site chirurgical exposé.
NOTE: Porter des gants chirurgicaux stériles et maintenir une technique stérile pendant la procédure. Ne touchez des surfaces et des objets stériles tels que le champ stérile et les instruments autoclavés. Vous avez déjà un assistant ajuster l' éclairage, les paquets de suture ouverts, etc. - 15 en utilisant un scalpel à lame, faire une incision médiane sagittal qui se prolonge sur la majeure partie de la boîte crânienne dorsale. En utilisant une pince fine à dents, retirer la peau sur le côté droit de l'incision pour exposer l'os pariétal droit.
- L'utilisation d'une perceuse avec un 4 mm bit trépan de forage diamanté autoclavé, percez un défaut à travers l'os pariétal. Ne pas prolonger le défaut osseux passé dans la couche dure-mère. (Figure 4)
- Placez un échafaudage dans le défaut, puis fermez l'incision de la peau avec l'exécution de suture en nylon.
- Surveiller la souris et de fournir la norme des soins postopératoires uneelon directives institutionnelles.
- Gardez la souris sur une serviette en papier propre à l'intérieur d'une cage propre alors qu'il récupère. Une moitié de la cage doit être placé sur une couverture de remise en circulation de l'eau chaude et la souris doit être initialement placé dans cette moitié.
- Ne laissez pas une souris sans surveillance jusqu'à ce qu'il ait repris connaissance suffisante pour déambuler. Ne retournez pas une souris qui a subi une intervention chirurgicale à une cage avec les autres souris jusqu'à ce qu'il soit complètement rétabli.
- Répéter les étapes ci-dessus avec une nouvelle souris pour chaque échafaudage qui doit être testé. Stériliser les instruments chirurgicaux entre les interventions chirurgicales utilisant un stérilisateur à billes chaud ou autre procédé approprié.
- Peu de temps après la procédure, puis à 2, 4, 6 et 8 semaines utiliser CT scan micro pour analyser le taux de fermeture de défaut calvarial.
NOTE: Voir l'article de Levi et al. 6 pour une description de micro scanner de défauts calvaria. - Lorsque l'expérience est complete, euthanasie les souris en les plaçant dans une chambre d'euthanasie propre et à partir d'un flux de gaz de dioxyde de carbone dans la chambre à un débit de 2 L / min. Après la respiration ont complètement cessé (après environ 10 min) effectuer la dislocation cervicale pour confirmer l'euthanasie.
- Eventuellement, après l'expérience est terminée, l'utilisation et tronçonnage coloration histologique pour évaluer la formation osseuse dans le défaut.
NOTE: Voir l'article de McArdle et al. 12 pour les détails de la préparation de l' os spécimens pour l' histologie. Pour un examen des techniques histologiques et de coloration, voir un manuel histologique comme le manuel de pathologie chirurgicale 15.
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Representative Results
Micro CT scan effectué le jour de la chirurgie montrera clairement le défaut du crâne. A cette époque, il n'y aura pas d'interposition dans le défaut de 4 mm. On obtient des analyses ultérieures au cours du temps afin de quantifier la taille du défaut au fil du temps par rapport à la ligne de base. Défauts ensemencés avec BMPR-IB cellules + devraient démontrer plus fermeture rapide du défaut par rapport à BMPR-IB- et les cellules non triées (figure 5). En outre, la partie du crâne contenant le défaut peut être décalcifié et traité pour une histologie en utilisant des procédés classiques 12. Sections colorées avec pentachrome la coloration de Movat va révéler une plus grande régénération osseuse dans le défaut traité avec des cellules BMPR-IB par rapport aux autres populations de cellules (figure 6).
Figure 1: lipoaspirat après lavage PBS. strong> Une cartouche de lipoaspirat après PBS est ajouté et le mélange est laissé décanter. La couche de tissu supérieure est le tissu adipeux qui accueille ASCs, tandis que la couche inférieure est la couche aqueuse, composé principalement de solution saline et de sang. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2: Mise en place de suspension cellulaire sur Polysucrose Solution. (a) La suspension cellulaire doit être très doucement à la pipette sur le côté du tube, ce qui permet à la couche au - dessus de la solution de polysaccharose. (b) Ceci est l'aspect correct d'une couche de cellules en suspension au - dessus du polysucrose avant la centrifugation."> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3: Ensemencement des cellules sur l'échafaud. (a) Sur la surface stérile d'un puits d'une plaque de culture cellulaire de 24 puits, charger un échafaudage sec avec environ 50 ul de suspension cellulaire. (b) incuber l'échafaudage dans un incubateur de culture cellulaire pendant 30 min pour permettre l' adhésion cellulaire. Remarque: Dans la figure, une plaque de 10 cm est utilisée à des fins de démonstration. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 4: Création de la calvarial Defect. Le défaut calvarial (flèches) est visible dans leouverte incision cutanée. Notez les vaisseaux sanguins duraux intacts (pointes de flèche), indiquant que le forage n'a pas violé la dure. Barre d'échelle, 5 mm. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 5: La guérison des défauts calvarial critiques taille avec différentes sous - populations de l' ASC. (A) en trois dimensions reconstructions CT micro ont été réalisées pour les défauts calvaria réparé avec unsorted, BMPR-IB (+), ou BMPR-IB (-) ASCs. (B) Quantification de guérison à 8 semaines a démontré une plus grande régénération osseuse avec CSA (92%) BMPR-IB (+) par rapport aux non triés et BMPR-IB (-) CSA (58% et 46%, respectivement, ** p < 0.01). Des différences significatives dans la guérison ont également été observés à 2 nousEKS (** p <0,01), 4 semaines (*** p <0,001) et 6 semaines (*** p <0,001). Micro-CT, la micro-tomographie par ordinateur. Reproduit avec la permission de McArdle et al. 12. Les barres d'erreur représentent l'écart type. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 6: Coloration histologique des os Régénérer. Pentachrome coloration de (A) Movat d'os régénérer des défauts réparés avec unsorted, BMPR-IB (+), ou BMPR-IB (-) ASCs à grossissement 5X en utilisant la microscopie à champ clair. Remarque plus robuste formation osseuse dans BMPR-IB (+) par rapport à un groupe BMPR-IB (-) groupe. La ligne pointillée représente l'étendue de la zone de défaut. La zone dans le rectangle noir apparaît sur magnific supérieuration en utilisant (B) 10X et (C) 40X microscopie en champ lumineux de la zone de défaut. Reproduit avec la permission de McArdle et al. 12. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
Étapes critiques dans le Protocole
Lors de la récolte de ASCs, l'étape critique est la digestion adéquate de graisse avec de la collagénase. digestion inadéquate se traduira par un faible rendement de ASCs. Au cours de tri FACS de cellules BMPR-IB +, il est important de définir soigneusement la porte de positivité. Définition de portes trop lâche peut entraîner des populations triées qui ne sont pas pures. Lors de la création du défaut crânienne, il est essentiel pour percer le défaut dans l'os du crâne, mais de ne pas avancer dans la dure-mère. Cela entraînera des saignements abondants et de l'exposition du cerveau, ce qui nécessitera l'euthanasie de l'animal.
Modifications et dépannage
En ce qui concerne l'anesthésie pour la chirurgie des défauts calvarial, notre laboratoire préfère utiliser l'isoflurane inhalée, mais une autre option consiste à injecter par voie intrapéritonéale un mélange contenant une concentration finale de la kétamine 10 mg / mL et de xylazine 1 mg / ml dans sa normaleligne. La dose standard de ce mélange est de 300 pi pour une souris de 30 g. Ceci permet d'obtenir environ 30 min d'anesthésie fiable qui ne nécessite pas la souris dans le cône de nez de l'isoflurane pendant la chirurgie. Un inconvénient de l'utilisation de l'anesthésique est injecté qu'il ne soit pas possible de diminuer la dose après que l'injection a été donnée. En revanche, l'isoflurane inhalé peut facilement être augmentée ou diminuée en temps réel.
Lors de l'ajout de la suspension cellulaire à l'échafaud, les chercheurs peuvent trouver que le volume de fluide est trop petit et seront partiellement s'évaporer dans les 30 min d'incubation. L'évaporation peut provoquer la mort cellulaire, ce qui est un facteur de confusion particulièrement néfaste dans des expériences d'os de guérison. Pour lutter contre cela, charger l'échafaud l'intérieur d'un puits d'une plaque 24 puits. Remplir les puits entourant immédiatement avec un milieu ordinaire. Cela va créer un micro-environnement humidifié qui aide à garder l'échafaud chargé de sécher.
coloration histologique de l'os est prédicated sur décalcification correcte et complète de la calotte crânienne avant l'enrobage et sectionner. Il est admis que les crânes d'âges différents exigent des durées différentes de décalcification, traditionnellement fait dans une solution d'EDTA
Limites de la technique
Ce protocole utilise un défaut crânienne 4 mm afin d'évaluer la capacité d'une population de cellules pour améliorer la fermeture du défaut. Ce modèle ne peut pas simuler la guérison qui se produit dans un environnement plus complexe, par exemple une fracture de l'os long ou une résection de la tumeur. Pour cette raison, peuvent avoir besoin de modèles animaux de remplacement pour être utilisé pour comprendre la contribution de l'ASC pour la cicatrisation osseuse dans ces milieux.
Importance de la technique par rapport aux méthodes existantes / alternatives
En utilisant la cytométrie en flux pour isoler des populations spécifiques de l'ASC est une technique prometteuse pour améliorer la cicatrisation et la régénération dans le contexte de multiples tissus etmodèles du jury, comme l'angiogenèse, l'adipogenèse, et l'ostéogenèse. L'utilité des cellules pro-ostéogéniques est exploré dans cette étude, montrant un effet profond avec des cellules sélectionnées positivement pour BMPR-IB dans la guérison d'un défaut calvarial.
Protocoles antérieurs pour l'isolement des ASC impliquent la culture des cellules pendant plusieurs jours sur des plaques de culture cellulaire 16. Cependant, les cellules peuvent subir une dérive phénotypique significative tandis que dans la culture. Pour cette raison, on utilise un protocole d'isolement de l'ASC qui permet une isolation rapide de ces cellules, suivie d'une purification supplémentaire en utilisant des sous-populations FACS. Toute la procédure est accomplie en moins d'un jour, ce qui minimise les effets du marqueur de surface cellulaire ou de la dérive phénotypique.
Applications et orientations futures
Nous avons montré que ASCs exprimant fortement BMPR-IB montrent une plus grande capacité à améliorer la cicatrisation de régénération défaut osseux par rapport aux autres ASCs. Les mécanismes sous-tendenttion de ce phénomène ne sont pas connus. Par exemple, on ne sait pas si les cellules se différencient directement dans les cellules osseuses formant, ou si elles produisent des facteurs qui encouragent d'autres cellules à le faire. Les futures études devront être effectuées pour répondre à ces questions.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 micron cell strainer | Falcon | 352360 | |
| 15 blade scalpel | Miltex | 4-515 | |
| 24 well plate | Corning | 3524 | |
| 40 micron cell strainer | Falcon | 352340 | |
| 50 mL conical centrifuge tubes | Falcon | 352098 | |
| 6-0 Ethilon nylon suture, 18", P-3 needle, | Ethicon | 1698G | |
| Anti-BMPR-IB primary antibody | R&D systems | FAB5051A | |
| BioGel PI surgical gloves | Mölnlycke Health Care | ALA42675Z | |
| Buprenorphine SR | ZooPharm | ||
| Castro-Viejo needle driver | Fine Science Tools | 12565-14 | |
| CD1 nude mouse | Charles River | 086 | |
| Collagenase Type II powder | Gibco | 17101-015 | |
| DMEM medium | Gibco | 10564-011 | |
| Drill: Circular knife 4.0 mm | Xemax Surgical | CK40 | |
| Drill: Z500 Brushless Micromotor | NSK | NSKZ500 | |
| FBS | Gicbo | 10437-077 | |
| Fisherbrand Absorbent Underpads, 20" x 24" | Fisher Scientific | 14-206-62 | |
| Fisherbrand Sterile cotton gauze pad, 4" x 4" | Fisher Scientific | 22-415-469 | |
| Heating pad | Kent Scientific | DCT-20 | |
| Hyclone 199/EBSS medium | GE Life Sciences | SH30253.01 | |
| Isothesia isoflurane | Henry Schein | 050033 | |
| Micro Forceps with teeth | Roboz | RS-5150 | |
| Micro Forceps with teeth | Roboz | RS-5150 | |
| Paraffin film (Parafilm) | Bemis | PM996 | |
| PBS | Gibco | 10010-023 | |
| Pen-Strep | Gibco | 15140-122 | |
| PLGA scaffolds | Proprietary Formulation | ||
| Poloxamer 188, 10% | Sigma | P5556-100ML | |
| Polylined Sterile Field, 18" x 24" | Busse Hospital Disposables | 696 | Cut a rectangular hole of the appropriate size |
| Polysucrose Solution: Histopaque 1119 | Sigma | 11191 | |
| Povidone Iodine Prep Solution | Medline | MDS093944H | |
| Puralube petrolatum ophthalmic ointment, 1/8 oz. tube | Dechra Veterinary Products | ||
| RBC lysis buffer | Sigma | 11814389001 | |
| Webcol alcohol prep swabs | Covidien | 6818 |
References
- Silber, J. S., et al. Donor site morbidity after anterior iliac crest bone harvest for single-level anterior cervical discectomy and fusion. Spine (Phila Pa 1976). 28 (2), 134-139 (2003).
- Giannoudis, P. V., Dinopoulos, H., Tsiridis, E. Bone substitutes: an update. Injury. 36, S20-S27 (2005).
- Laurencin, C., Khan, Y., El-Amin, S. F. Bone graft substitutes. Expert Rev Med Devices. 3 (1), 49-57 (2006).
- Walmsley, G. G., et al. Nanotechnology in bone tissue engineering. Nanomedicine. 11 (5), 1253-1263 (2015).
- Chapekar, M. S. Tissue engineering: challenges and opportunities. J Biomed Mater Res. 53 (6), 617-620 (2000).
- Levi, B., et al. Human adipose derived stromal cells heal critical size mouse calvarial defects. PLoS One. 5 (6), e11177 (2010).
- Gimble, J. M., Katz, A. J., Bunnell, B. A. Adipose-derived stem cells for regenerative medicine. Circ Res. 100 (9), 1249-1260 (2007).
- Levi, B., et al. CD105 protein depletion enhances human adipose-derived stromal cell osteogenesis through reduction of transforming growth factor beta1 (TGF-beta1) signaling. J Biol Chem. 286 (45), 39497-39509 (2011).
- Chung, M. T., et al. CD90 (Thy-1)-positive selection enhances osteogenic capacity of human adipose-derived stromal cells. Tissue Eng Part A. 19 (7-8), 989-997 (2013).
- Wozney, J. M., et al. Novel regulators of bone formation: molecular clones and activities. Science. 242 (4885), 1528-1534 (1988).
- Wan, D. C., et al. Osteogenic differentiation of mouse adipose-derived adult stromal cells requires retinoic acid and bone morphogenetic protein receptor type IB signaling. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (33), 12335-12340 (2006).
- McArdle, A., et al. Positive selection for bone morphogenetic protein receptor type-IB promotes differentiation and specification of human adipose-derived stromal cells toward an osteogenic lineage. Tissue Eng Part A. 20 (21-22), 3031-3040 (2014).
- Sharon, Y., Alon, L., Glanz, S., Servais, C., Erez, N. Isolation of normal and cancer-associated fibroblasts from fresh tissues by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS). J Vis Exp. (71), e4425 (2013).
- Lo, D. D., et al. Repair of a critical-sized calvarial defect model using adipose-derived stromal cells harvested from lipoaspirate. J Vis Exp. (68), (2012).
- Lester, S. C. Manual of surgical pathology. , Saunders/Elsevier. (2010).
- Bunnell, B. A., Flaat, M., Gagliardi, C., Patel, B., Ripoll, C. Adipose-derived stem cells: isolation, expansion and differentiation. Methods. 45 (2), 115-120 (2008).
