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Developmental Biology

Isolamento rápido de BMPR-IB + adiposo-derivados de células estromais para uso em um Defeito Modelo Cura calota craniana

doi: 10.3791/55120 Published: February 24, 2017

Introduction

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Os principais defeitos ósseos resultantes de lesão, infecção ou cancro invasivo tem um impacto significativo sobre a recuperação e a qualidade de vida de um paciente. Existem técnicas para preencher esses defeitos com osso saudável de outras partes do próprio corpo do paciente, mas essa transferência leva seu próprio morbidade e risco de complicações 1, 2, 3. Além disso, alguns defeitos são tão grandes ou complexos que óssea de doadores suficiente não está disponível para preencher o defeito. Dispositivos protéticos são uma opção potencial para preenchimento de defeitos ósseos mas estes estão associados com várias desvantagens, incluindo o risco de infecção, falha de hardware, e reação de corpo estranho 4.

Por estas razões, há um grande interesse na possibilidade de engenharia substitutos ósseos biológicos utilizando as próprias células 5 de um paciente. células estromais derivadas de tecido adiposo (ASCs)tem potencial para esta aplicação, porque eles estão disponíveis em abundância no próprio tecido de gordura do paciente e eles têm demonstrado a capacidade de curar defeitos ósseos, gerando um novo tecido ósseo 6, 7. ASC são uma população diversa de células e vários estudos têm mostrado que a selecção de marcadores específicos da superfície celular pode produzir populações de células com actividade osteogénica aumentada de 8, 9. Seleccionar ASC com o maior potencial osteogénico iria aumentar a probabilidade de que um andaime semeadas com estas células poderia regenerar um grande defeito ósseo.

Sinalização proteína morfogenética do osso (BMP) é crítico para a regulação de diferenciação do osso e formação 10 e do tipo de receptor de BMP IB (BMPR-IB) é conhecida por ser importante para a osteogénese em 11 ASC. Recentemente, mostrámos que a expressão de BMPR-IB pode be usado para selecionar para ASC com reforçada actividade osteogénica 12. Aqui demonstramos um protocolo para o isolamento de BMPR-IB-expressando ASC de gordura humana, seguido de um ensaio da sua actividade osteogénica utilizando um modelo in vivo de calvária defeito.

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Protocol

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NOTA: As amostras foram obtidas de pacientes que deram consentimento informado. Todos os protocolos foram revistos e aprovados pela Universidade de Stanford Institutional Review Board apropriado. Ao manusear tecidos e células humanos, sempre aderir ao Nível de Biossegurança 2 (BSL2) precauções, conforme especificado pela sua instituição.

1. Preparação dos Reagentes

  1. Preparar tampão de FACS: adicionar 10 ml de FBS, 5 ml de poloxâmero 188 e 5 mL de Pen-Strep a 500 ml de solução salina tamponada com fosfato estéril (PBS).
  2. Prepare digerir mistura: Adicionar 0,375 g C. hemolyticum colagenase tipo II em pó e 5 mL Poloxamer 188 a 500 ml de meio / EBSS estéril 199.
  3. Prepare meio padrão: adicionar 50 ml de FBS e 5 mL Pen-Strep a de 500 mL Dulbecco Modified Eagle Medium.

2. A colheita e isolamento de ASC

NOTA: Certifique-se de que as aprovações institucionais adequados estão em vigor para a utilização de tecidos humanos e para isolar hcélulas estaminais uman. Obter abdominal humana, flanco ou coxa gordura subcutânea de um doador saudável passando por lipoaspiração eletiva. Manter a gordura em uma vasilha de sucção de plástico.

  1. Adicionar PBS estéril numa proporção de 1: 1 para a gordura no recipiente de plástico original. (Se houver 500 mL de gordura, adicionar 500 mL de PBS). Misturar por agitação suave durante 30 s. Permitir que a camada aquosa para se depositar no fundo (figura 1) e, em seguida, aspirado e descartar a camada aquosa com uma pipeta de 10 ml de plástico ligado à sucção.
  2. Decantar a gordura em um grande recipiente de plástico e adicionar digerir mistura na proporção de 1: 1. Fechar o recipiente e limpar o exterior com 70% de etanol. Selar a tampa com película de parafina.
  3. Agita-se este recipiente num agitador orbital a 180 rpm a 37 ° C durante 30 min.
  4. Neutraliza-se a digestão por adição de meio padrão numa razão de 1: 1. (Se não houver 1.000 ml de uma mistura de gordura, adicione 1,000 mL meio padrão).
  5. Distribua a mistura igualmente em um número par de 250 ml de tubos de centrífuga de plástico de centrífuga cónico e a mistura a 300 xg durante 20 min a 4 ° C.
  6. Aspirar o sobrenadante e ter o cuidado de deixar o pellet intacto. pelotas ressuspender em 5 mL meio padrão para cada tubo cônico.
  7. Filtra-se a suspensão através de um filtro de 100 microns para um tubo cónico de 50 ml de centrífuga. Em seguida, centrifugar a 300 xg durante 15 min a 4 ° C.
  8. Aspirar o sobrenadante e ressuspender o sedimento em 5 mL de tampão de lise temperatura ambiente RBC. Deixar a mistura em repouso durante 5 min à temperatura ambiente e depois centrifugar a 300 xg durante 15 min à temperatura ambiente (RT).
  9. Aspirar o sobrenadante e ressuspender o sedimento em 15 mL de meio padrão. Novamente filtrar através de um filtro de 100 microns para um tubo de centrífuga cónico de 50 ml.
  10. Em uma nova mL cônico de 50, adicionar 15 solução polissacarose mL concebido para a separação à base de densidade (ver lista de reagentes). Em seguida, segurando o tubo com um ângulo de 45 °, pipetagem cuidadosa das células para o lado deo tubo de modo que a suspensão de células suavemente camadas no topo da solução polissacarose (Figura 2).
    NOTA: É importante a células de pipeta sobre a superfície da solução. Não adicionar solução polissacarose a uma suspensão de células como isso vai criar uma mistura irreversível. Da mesma forma, não pipetar as células para o centro da solução polissacarose.
  11. Centrifugar esta mistura a 300 xg durante 10 min à temperatura ambiente. Use baixa aceleração (2-3 de 10) e definir a função de freio da centrífuga a zero para esta etapa.
    NOTA: Três camadas será visível: transparente na parte inferior, nublado no meio e no topo de cor salmão. A camada intermédia contém as células de interesse.
  12. Usando uma pipeta de 10 retire cuidadosamente a camada média e transferir para um novo tubo cônico de 50 mL.
    NOTA: É melhor transferir completamente a camada do meio e no processo de tomar algumas das camadas superior e inferior do que deixar para trás um pouco da camada média.
  13. <li> Contar as células usando um hemocitômetro e determinar o número de células vivas total.
    NOTA: De modo geral, utilizar azul de tripano adicionado à mistura de células para uma concentração final de 0,8% para auxiliar na contagem de células. células vivas viáveis ​​não vai ocupar o corante azul e aparecerá branco.

3. FACS de classificação para BMPR-IB Células positivas e preparação de andaimes contendo células

  1. Centrifugar a suspensão de células a 300 xg durante 5 min a 4 ° C. Ressuspender as células em tampão de SCAF, a uma concentração de 1 milhão de células por 100 uL (com base na contagem de células feito no passo 2.13).
  2. Transferir, pelo menos, 10 milhões de células para um tubo de centrífuga de plástico rotulados "BMPR-IB." Separadamente, a transferência de um milhão de células em 100 ul de tampão de FACS para um tubo de centrífuga de plástico separada marcado "não corado." Adicionar 1 mL de tampão de FACS para o tubo "não corado". Manter o restante das células em tampão de SCAF em gelo enquanto as triagem FACS porção do experiment está sendo feito. Rotular essas células "não separados." Utilizá-los como controlos no final do experimento.
  3. Adicionar uma quantidade apropriada de um anticorpo de BMPR-IB anti-humano fluorescente para o tubo "BMPR-IB" de acordo com as instruções do fabricante. Pipetar a mistura para cima e para baixo suavemente para distribuir o anticorpo.
    NOTA: Nós usamos um Humano BMPR-IB / ALK-6 Antibody APC-conjugado a uma diluição de 1:10 (ver lista de reagentes para detalhes). No entanto, os anticorpos de diferentes fabricantes terão diferentes concentrações recomendadas.
  4. Cubra o balde de gelo de uma forma que impede a entrada de luz. Permitir que a mistura de células / anticorpo para sentar-se durante 30 min (ou de acordo com as instruções do fabricante do anticorpo).
    NOTA: Se o anticorpo anti-BMPR-IB vem como um anticorpo não conjugado primária que requer um anticorpo secundário, realizar um passo separado de coloração em gelo com o anticorpo secundário de acordo com as instruções do fabricante.
  5. Centrifugar ambos os tubos a300 xg durante 5 min a 4 ° C. Aspirar o sobrenadante, tendo o cuidado para não aspirar o sedimento. Ressuspender as células peletizadas em 1 mL de tampão de FACS. Mais uma vez, centrifugar os tubos a 300 xg durante 5 min. Aspirar cuidadosamente o sobrenadante e ressuspender as células em tampão de SCAF até uma concentração de 1 milhão de células por 1 ml.
  6. Filtra-se a "BMPR-IB," "não corado," e "células" não separados através de filtros de 40 micron de células para novos tubos de vidro marcados FACS. Lavar os filtros com 500 ul de tampão de FACS para assegurar que as células não são deixadas para trás no filtro. Além disso, adicione 2 mL meio padrão para dois tubos de centrífuga de plástico separados rotulados como "BMPR-IB-positivo" e "BMPR-IB-negativo." Use estes dois para recolher as células classificadas na máquina de FACS.
  7. Na máquina de FACS, as células não coradas utilizar para definir uma porta negativa para o marcador fluorescente.
  8. Utilizando um bico de 100 micra, de classificação BMPR-IB células positivas e negativas para os respectivos tubos contenção meio padrão. Manter estes tubos refrigerados a 4 ° C durante a classificação, se a máquina FACS tem essa capacidade.
    NOTA: Por favor, consulte o artigo JOVE 13 por Sharon et al. para um protocolo excelente para separação por FACS.
  9. Usando um hemocitómetro, contar as células de cada tubo. Centrifuga-se o "BMPR-IB-positiva", "BMPR-IB-negativo" e "tubos" não separados a 300 xg durante 5 min a 4 ° C e aspirar o sobrenadante, tendo o cuidado para não perturbar o sedimento celular. Em seguida, voltar a suspender as células em meio padrão a uma concentração de 1 milhão de células por 250 uL.
  10. Obter suportes revestidos com hidroxiapatite pré-cortadas quatro milímetros de PLGA (poli [ácido láctico-co-glicólico]). Colocar cada andaime em um poço de uma placa de 24 poços. Cobrir cada andaime com 50 ul de suspensão de células a partir de um dos três grupos de (i .e, 200.000 células.): Não separados, BMPR-IB-positiva, e BMPR-IB-negativa (Figura 3).
    NOTA: Por favor,consulte o artigo JOVE 14 por Lo et al. para obter detalhes sobre a construção de andaimes de PLGA.
  11. Parcialmente encher os vazios circundantes poços com meio padrão (para prevenir a dessecação dos andaimes), cobrir a placa com a tampa, e incubar numa incubadora de cultura de células a 37 ° C durante 30 min.

4. Criação de defeitos na calota craniana e Aplicação do ACS contendo andaime

NOTA: Certifique-se de que as aprovações institucionais adequados estão no lugar para a criação de defeitos na calota craniana em ratos vivos. Este protocolo foi aprovado pelo Comitê Animal Care Institucional e Use da Universidade de Stanford.

  1. Anestesiar um rato nu CD-1 utilizando o gás isoflurano inalado ou um cocktail anestésico de ação longa injetado.
    1. Para utilizar o gás sozinho, colocar o rato numa câmara de anestesia e iniciar o fluxo de oxigénio a 2 - 3 L / min, com uma concentração de 2% de isoflurano. Uma vez que o mouse é fully inconsciente, coloque-o de bruços sobre um cobertor com recirculação de água quente com uma almofada absorvente e coloque seu focinho em um cone de nariz anestesia com a mesma concentração de oxigênio e isoflurano. acompanhar atentamente a frequência respiratória e ajustar a concentração de isoflurano, conforme necessário.
    2. Para usar um cocktail anestésico de longa acção injectado, anestesiar o rato numa câmara de anestesia, como descrito acima e, em seguida, injectar o cocktail de anestésico. Remover o rato da câmara de anestesia e observar seu comportamento.
      NOTA: O rato pode rapidamente sair da anestesia, mas dentro de vários minutos, deve ser novamente completamente anestesiados sob o efeito da anestesia injectado. Transferir o mouse para um cobertor quente recirculação de água coberto com uma almofada absorvente.
      NOTA: Para um cocktail anestésico, recomenda-se uma mistura contendo cetamina 10 mg / ml de xilazina e 1 mg / ml em solução salina normal, entregue intraperitonealmente. A dose padrão de esta mistura é300 mL para um rato de 30 g, o que equivale à cetamina 100 mg / kg de xilazina e 10 mg / kg. Consulte a seção de discussão para obter mais detalhes sobre o anestésico injetável.
    3. Utilizar um dedo do pé pitada manobra para determinar a profundidade de anestesia. Um rato adequadamente anestesiados não se retrai a pata quando é levemente comprimida pelo cirurgião.
    4. Aplicar pomada para evitar a dessecação da córnea.
    5. Administrar 1 mg / kg por via subcutânea buprenorfina SR.
      NOTA: Fornecer analgesia antes de os resultados da cirurgia no alívio da dor superior.
    6. Durante todo o procedimento, monitorar a frequência respiratória do mouse.
      NOTA: Um rato devidamente anestesiados sob isoflurano deve ter uma taxa respiratória de 50 - 100 ciclos / min. Um aumento da frequência respiratória indica que a anestesia é muito leve, enquanto uma frequência respiratória diminuída pode indicar que a anestesia é muito profundo.
  2. Prepare a pele do dorso do crânio com povidona-iodINE solução seguido de etanol a 70% três vezes. Drapejar com campos estéreis, deixando o local da cirurgia exposta.
    NOTA: Usar luvas cirúrgicas estéreis e manter uma técnica asséptica durante o procedimento. Apenas em contacto com superfícies e objetos estéreis, como a cortina estéril e os instrumentos autoclavados. Possui uma assistente de ajustar a iluminação, os pacotes sutura abertos, etc.
  3. Usando um bisturi 15-lâmina, fazer uma incisão na linha média sagital, que se estende sobre a maior parte do crânio dorsal. Usando uma pinça fina dentadas, retrair a pele do lado direito da incisão para expor o osso parietal direito.
  4. Usando uma furadeira com uma broca trefina diamantada 4 milímetros autoclavado, perfurar um defeito através do osso parietal. Não estenda o defeito passado óssea na camada dura-máter. (Figura 4)
  5. Coloque um andaime no defeito e, em seguida, fechar a incisão na pele com o funcionamento de fio de náilon.
  6. Monitorar o mouse e fornecer padrão de pós-operatório os cuidados de umegundo as diretrizes institucionais.
    1. Mantenha o mouse sobre uma toalha de papel limpa dentro de uma gaiola limpa enquanto ele se recupera. Metade da gaiola deve ser colocado sobre uma manta de recirculação de água quente e o rato deve ser colocada inicialmente no semestre.
    2. Não deixe um mouse sem vigilância até que tenha recuperado a consciência suficiente para deambular. Não devolva um rato que foi submetido a cirurgia para uma gaiola com outros ratos até que esteja totalmente recuperado.
  7. Repetir os passos acima com um novo rato para cada estrutura de suporte que está a ser testado. Esterilizar instrumentos cirúrgicos entre cirurgias usando um esterilizador talão quente ou outro método adequado.
  8. Pouco tempo após o procedimento, e, em seguida, a 2, 4, 6, e 8 semanas, usar varrimento CT micro para analisar a taxa de fechamento do defeito calvária.
    NOTA: Ver o artigo de Levi et al. 6 para uma descrição de varredura micro CT de defeitos na calota craniana.
  9. Quando o experimento é complete, a eutanásia ratos colocando-as em uma câmara de eutanásia limpo e iniciar um fluxo de dióxido de carbono gasoso para dentro da câmara a uma taxa de 2 L / min. Depois de respiração cessaram completamente (após cerca de 10 min) realizar deslocamento cervical para confirmar a eutanásia.
  10. Opcionalmente, após a experiência estar completa, o uso de seccionamento e coloração histológica para avaliar a formação de osso dentro do defeito.
    NOTA: Ver o artigo de McArdle et al. 12 para obter detalhes sobre a preparação óssea amostras para histologia. Para uma revisão de técnicas histológicas e de coloração, consulte um manual histológica, como o Manual de Patologia Cirúrgica 15.

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Representative Results

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Micro Scan CT feito no dia da cirurgia irá mostrar claramente o defeito no crânio. Neste tempo, não haverá o crescimento interno para o defeito de 4 mm. verificações subsequentes são obtidos ao longo do tempo para quantificar o tamanho do defeito ao longo do tempo em comparação com a linha de base. Defeitos semeadas com células de BMPR-IB + devem demonstrar de forma mais rápida de fecho do defeito quando comparado com BMPR-IB e células não separadas (figura 5). Além disso, a parte do crânio que contém o defeito pode ser descalcificadas e processadas para histologia usando métodos padrão 12. Secções coradas com corante pentachrome de Movat irá revelar maior regeneração do osso no defeito tratados com células de BMPR-IB, em comparação com as outras populações de células (Figura 6).

figura 1
Figura 1: lipoaspirado após lavagem com PBS. forte> é adicionada uma lata de lipoaspirado depois de PBS e a mistura é deixada sedimentar. A camada de tecido fino de topo é o tecido adiposo, que hospeda ASC, enquanto a camada inferior é a camada aquosa, composta principalmente de soro fisiológico e sangue. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2
Figura 2: Colocação de suspensão de células em polissacarose Solution. (a) A suspensão de células deve ser muito suavemente pipetados para o lado do tubo, permitindo que a camada em cima da solução polissacarose. (b) Este é o aspecto correcta de uma camada de suspensão de células no topo da polissacarose antes da centrifugação."> Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3
Figura 3: Sementeira de Células para o andaime. (a) sobre a superfície esterilizada de uma cavidade de uma placa de cultura celular de 24 poços, carregar um andaime seco com aproximadamente 50 ul de suspensão de células. (b) incubar o andaime num incubador de cultura de células durante 30 min para permitir a adesão celular. Nota: Na figura, uma placa de 10-cm é usado para fins de demonstração. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4
Figura 4: Criação da calota craniana Defect. O defeito calvária (setas) é visível dentro doincisão na pele aberta. Note os vasos sanguíneos da dura-máter intacta (setas), indicando que a perfuração não violou o dura. barra de escala, 5 mm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5
Figura 5: Cura de defeitos críticos para a dimensão calota craniana com várias sub-populações ASC. (A) reconstruções CT micro tridimensionais foram realizadas por defeitos na calota craniana reparada com indiferenciados, BMPR-IB (+), ou BMPR-IB (-) ASC. (B) Quantificação de cura em 8 semanas demonstraram significativamente maior regeneração óssea com ASC (92%) BMPR-IB (+) em comparação com não triados e BMPR-IB (-) ASC (58% e 46%, respectivamente, ** p < 0,01). diferenças significativas na cicatrização também foram vistos a 2 nósEKS (** p <0,01), 4 semanas (*** p <0,001) e 6 semanas (*** p <0,001). Micro-CT, Tomografia computadorizada de micro. Reproduzido com permissão de McArdle et al. 12. As barras de erro representam o desvio padrão. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 6
Figura 6: Coloração histológica do osso regenerar. Coloração pentachrome (A) de Movat do osso regenerar em defeitos reparados com indiferenciados, BMPR-IB (+), ou BMPR-IB (-) ASC em 5X usando microscopia de campo claro. Nota formação de osso mais robusto no grupo de BMPR-IB (+) em comparação com BMPR-IB - grupo (). A linha a tracejado representa a extensão da área do defeito. A área dentro do retângulo preto é mostrado em maior magnificção usando (B) Microscopia de campo 10X e (C) 40X brilhante da área do defeito. Reproduzido com permissão de McArdle et al. 12. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

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Passos críticos dentro do Protocolo

Durante a colheita da ASC, o passo crítico é a digestão adequada de gordura com colagenase. digestão inadequada resultará em um baixo rendimento da ASC. Durante FACS triagem de células BMPR-IB +, é importante definir cuidadosamente o portão para a positividade. Definindo portas muito frouxamente pode resultar em populações classificadas que não são puros. Durante a confecção do defeito calvária, é crítico para perfurar o defeito através do osso do crânio, mas não para avançar para a dura-máter. Isto irá causar hemorragia profusa e exposição do cérebro, o que exige a eutanásia do animal.

Modificações e resolução de problemas

No que diz respeito a anestesia para a cirurgia de calvária defeito, o nosso laboratório prefere usar isoflurano inalado, mas uma outra opção é para injectar por via intraperitoneal uma mistura contendo uma concentração final de cetamina 10 mg / ml de xilazina e 1 mg / mL em normais SAlinha. A dose padrão desta mistura é de 300 mL para um rato de 30 g. Isto proporciona aproximadamente 30 minutos de anestesia fiáveis, que não requerem o rato a estar no cone de nariz de isoflurano durante a cirurgia. Uma desvantagem do uso de anestesia injectado é que não é possível para diminuir a dose após a injecção tenha sido dada. Em contraste, o isoflurano inalado pode facilmente ser ajustada para cima ou para baixo em tempo real.

Ao adicionar suspensão de células para o cadafalso, os pesquisadores podem achar que o volume de líquido é muito pequeno e parcialmente evaporar nos 30 min de incubação. A evaporação pode causar a morte das células, que é um confundidor particularmente prejudiciais em experiências de reparação óssea. Para combater isso, carregar o andaime dentro de um poço de uma placa de 24 poços. Encha as cavidades que cercam imediatamente com meio simples. Isto irá criar um micro-ambiente umidificado que ajuda a manter o cadafalso carregada de secar.

coloração histológica de osso é prédicated na descalcificação correta e completa da calota antes da incorporação e corte. Aceita-se que os crânios de diferentes idades exigem durações diferentes de descalcificação, tradicionalmente feito em uma solução de EDTA

Limitações da técnica

Este protocolo utiliza um defeito de calvária de 4 mm a avaliar a capacidade de uma população de células para aumentar fecho do defeito. Este modelo pode simular a cura não ocorre, em que um ambiente mais complexo, tal como uma fractura óssea longa ou uma ressecção do tumor. Por esta razão, os modelos animais podem alternativos precisam ser utilizados para compreender a contribuição de ASC para cicatrização óssea nesses locais.

Importância da Técnica em Matéria de Existentes / Métodos Alternativos

Utilizando citometria de fluxo para isolar populações específicas ASC é a melhor técnica para melhorar a cura e regeneração no contexto de múltiplos tecidos e emmodelos do júri, como angiogênese, adipogênese e osteogênese. O utilitário de células pró-osteogênicos é explorado neste estudo, mostrando um efeito profundo com células seleccionadas positivamente para BMPR-IB na cura de um defeito calvária.

Protocolos anteriores para o isolamento de ASC envolvem a cultura das células durante vários dias em placas de cultura de células 16. No entanto, as células podem sofrer significativa deriva fenotípica, enquanto na cultura. Por esta razão, utiliza-se um protocolo de isolamento ASC que permite a rápida isolamento destas células, seguido de purificação adicional subpopulação usando FACS. Todo o procedimento é realizado em menos de um dia, minimizando os efeitos do marcador da superfície celular ou deriva fenotípica.

Aplicações futuras e Direcções

Mostrámos que expressam altamente ASC BMPR-IB demonstrar uma maior capacidade para melhorar a cicatrização do defeito ósseo regenerativa em comparação com outros ASC. Os mecanismos underlying este fenómeno não são conhecidos. Por exemplo, não é claro se as células diferenciam-se directamente em células formadoras de osso, ou se eles produzem factores que estimulam outras células para o fazer. Futuros estudos deverão ser realizados para responder a estas perguntas.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
100 micron cell strainer Falcon 352360
15 blade scalpel Miltex 4-515
24 well plate Corning 3524
40 micron cell strainer Falcon 352340
50 mL conical centrifuge tubes Falcon 352098
6-0 Ethilon nylon suture, 18", P-3 needle,  Ethicon 1698G
Anti-BMPR-IB primary antibody R&D systems FAB5051A
BioGel PI surgical gloves Mölnlycke Health Care ALA42675Z
Buprenorphine SR ZooPharm
Castro-Viejo needle driver Fine Science Tools 12565-14
CD1 nude mouse Charles River 086
Collagenase Type II powder Gibco 17101-015
DMEM medium Gibco 10564-011
Drill: Circular knife 4.0 mm Xemax Surgical CK40
Drill: Z500 Brushless Micromotor NSK NSKZ500
FBS Gicbo 10437-077
Fisherbrand Absorbent Underpads, 20" x 24" Fisher Scientific 14-206-62
Fisherbrand Sterile cotton gauze pad, 4" x 4" Fisher Scientific 22-415-469
Heating pad Kent Scientific DCT-20
Hyclone 199/EBSS medium GE  Life Sciences SH30253.01
Isothesia isoflurane Henry Schein  050033
Micro Forceps with teeth Roboz RS-5150
Micro Forceps with teeth Roboz RS-5150
Paraffin film (Parafilm) Bemis PM996
PBS Gibco 10010-023
Pen-Strep Gibco 15140-122
PLGA scaffolds Proprietary Formulation
Poloxamer 188, 10% Sigma P5556-100ML
Polylined Sterile Field, 18" x 24" Busse Hospital Disposables 696 Cut a rectangular hole of the appropriate size
Polysucrose Solution: Histopaque 1119 Sigma 11191
Povidone Iodine Prep Solution Medline MDS093944H
Puralube petrolatum ophthalmic ointment, 1/8 oz. tube Dechra Veterinary Products
RBC lysis buffer Sigma 11814389001
Webcol alcohol prep swabs Covidien 6818

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Isolamento rápido de BMPR-IB + adiposo-derivados de células estromais para uso em um Defeito Modelo Cura calota craniana
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Marshall, C. D., Zielins, E. R., Brett, E. A., Blackshear, C. P., Hu, M. S., Leavitt, T., Barnes, L. A., Lorenz, H. P., Longaker, M. T., Wan, D. C. Rapid Isolation of BMPR-IB+ Adipose-Derived Stromal Cells for Use in a Calvarial Defect Healing Model. J. Vis. Exp. (120), e55120, doi:10.3791/55120 (2017).More

Marshall, C. D., Zielins, E. R., Brett, E. A., Blackshear, C. P., Hu, M. S., Leavitt, T., Barnes, L. A., Lorenz, H. P., Longaker, M. T., Wan, D. C. Rapid Isolation of BMPR-IB+ Adipose-Derived Stromal Cells for Use in a Calvarial Defect Healing Model. J. Vis. Exp. (120), e55120, doi:10.3791/55120 (2017).

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