Introduction
Основные дефекты костной ткани в результате травмы, инфекции или инвазивного рака оказывают значительное влияние на восстановление и качество жизни пациента. Методы существуют , чтобы заполнить эти дефекты с здоровой кости из других частей собственного тела пациента, но эта передача несет свою собственную заболеваемость и риск осложнений 1, 2, 3. Кроме того, некоторые дефекты настолько велики, или комплекс, который достаточен донор костного не доступен для заполнения дефекта. Протезы представляют собой потенциальную возможность для заполнения костных дефектов , но они связаны с несколькими недостатками , включая риск заражения, аппаратных сбоев, а также реакции на инородное тело 4.
По этим причинам существует большой интерес к возможности инженерно - биологических заменителей кости , используя собственные клетки пациента 5. Полученные из жировой ткани стромальные клетки (ИСС)имеют потенциал для этого приложения , потому что они доступны в изобилии в собственной жировой ткани пациента , и они продемонстрировали способность исцелять костных дефектов путем формирования новой костной ткани 6, 7. ИСС представляют собой разнородную популяцию клеток и несколько исследований показали , что при выборе для специфических маркеров клеточной поверхности может привести к популяции клеток с повышенной остеогенной активности 8, 9. Выбор ИСС с самым высоким потенциалом остеогенной бы увеличить вероятность того, что леска высевают с этими клетками может регенерировать большой дефект кости.
Костный морфогенетического белка (BMP) , передача сигналов имеет решающее значение для регуляции дифференцировки и формирования костной ткани 10 и тип BMP рецептора IB (BMPR-IB) , как известно , являются важными для остеосинтеза в ИСС 11. Недавно мы показали, что экспрессия BMPR-IB может бе используется для выбора для ИСС с повышенной остеогенной активности 12. Здесь показано , протокол для выделения BMPR-IB-экспрессирующих ИСС из человеческого жира с последующим количественным анализом их остеогенной активности с использованием естественных условиях модель дефектов свода черепа в.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Примечание: Образцы были получены от пациентов, которые дали информированное согласие. Все протоколы были рассмотрены и утверждены соответствующим советом Стэнфордского университета Institutional Review. При обработке тканей человека и клетки, всегда придерживаться уровня биологической безопасности 2 (BSL2) меры предосторожности, как указано в вашем учреждении.
1. Приготовление реагентов
- Подготовка FACS буфера: Добавьте 10 мл FBS, 5 мл полоксамера 188 и 5 мл Pen-Strep до 500 мл стерильным фосфатно-буферным солевым раствором (PBS).
- Приготовьте смесь переварить: Добавить 0,375 г С. hemolyticum Типа порошка коллагеназы II и 5 мл полоксамер 188 до 500 мл стерильного 199 / EBSS среды.
- Подготовка стандартной среде: Добавьте 50 мл ФБС и 5 мл Pen-Strep до 500 мл Дульбекко в модификации Дульбекко.
2. Сбор и выделение ИСС
ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь в том, что соответствующие институциональные согласования на месте для использования тканей человека и изолирующей чУмань стволовые клетки. Получить человека в животе, обрамляют или бедра подкожной жировой клетчатки от здорового донора подвергались плановым липосакцию. Держите жир в пластиковом всасывания канистры.
- Добавить стерильной PBS в соотношении 1: 1 к жиру в оригинальной пластиковой канистре. (Если есть 500 мл жира, добавляют 500 мл ФБР). Смешайте осторожном перемешивании в течение 30 сек. Разрешить водный слой оседают на дно (рис 1) , а затем аспирата и выбросьте водный слой с 10 мл пластиковой пипетки , прикрепленной к всасыванием.
- Декантируйте жир в большой пластиковый контейнер и добавить переваривать смесь в соотношении 1: 1. Закройте контейнер и очистить снаружи с 70% этанола. Уплотнение крышки с парафиновой пленки.
- Перемешивайте этот контейнер в орбитальном шейкере при 180 оборотов в минуту при 37 ° С в течение 30 мин.
- Нейтрализовать пищеварение путем добавления стандартной среды в соотношении 1: 1. (Если есть 1000 мл жировой смеси, добавляют 1000 мл стандартной среды).
- Распределить смесь поровну на четное число 250 мл пластиковый конический центрифужные пробирки и центрифугируют смесь при 300 мкг в течение 20 мин при 4 ° С
- Аспирируйте супернатант и быть осторожными, чтобы оставить осадок нетронутыми. Ресуспендируют гранул в 5 мл стандартной среды для каждой конической трубе.
- Суспензию фильтруют через 100-микронный фильтр в один 50 мл коническую центрифужную пробирку. Затем центрифуге при 300 мкг в течение 15 мин при температуре 4 ° С.
- Аспирируйте супернатант и ресуспендируют осадок в 5 мл при комнатной температуре РБК буфера для лизиса. Разрешить смесь сидеть в течение 5 мин при комнатной температуре, затем центрифугировать при 300 х г в течение 15 мин при комнатной температуре (RT).
- Аспирируйте супернатант и ресуспендируют осадок в 15 мл стандартной среды. И снова фильтруют через 100-микронный фильтр в 50 мл коническую центрифужную пробирку.
- В новом 50 мл коническую, добавляют 15 мл раствора polysucrose, предназначенный для плотности на основе разделения (см список реагентов). Затем, держа трубку под углом 45 °, осторожно пипеткой клетки на сторонетрубка так , что клеточная суспензия мягко слои на верхней части раствора polysucrose (Рисунок 2).
Примечание: Важно пипеток клеток на поверхности раствора. Не следует добавлять polysucrose раствора к суспензии клеток, как это будет создавать необратимое смесь. Точно так же, не пипетку клетки в центре раствора polysucrose. - Центрифуга эту смесь при 300 х г в течение 10 мин при комнатной температуре. Используйте малое ускорение (2 - 3 из 10) и установите функцию торможения центрифуги до нуля для этого шага.
Примечание: Три слоя будут видны: ясно, на дне, облачно в середине, и оранжево-розовый на вершине. Средний слой содержит клетки, представляющие интерес. - С помощью 10 мл пипетки осторожно удалить средний слой и перенести на новую 50 мл коническую трубку.
Примечание: Лучше полностью передать средний слой и в процессе принимают некоторые из верхнего и нижнего слоев, чем оставить позади некоторых из среднего слоя. <LI> Граф клеток с использованием гемоцитометра и определить общее количество живых клеток.
Примечание: Обычно мы используем трипанового синего добавляют к смеси клеток до конечной концентрации 0,8% для оказания помощи в подсчете клеток. Приемлемые живые клетки не будет занимать синий краситель и будет казаться белым.
3. FACS сортировки для BMPR-IB позитивных клеток и клеточных Получение содержащих строительные леса
- Центрифуга клеточной суспензии при 300 мкг в течение 5 мин при температуре 4 ° С. Ресуспендируют клеток в буфере FACS в концентрации 1 млн клеток на 100 мкл (на основании количества клеток, сделанные в шаге 2.13).
- Передача по меньшей мере, 10 миллионов клеток в пластиковую центрифужную пробирку с надписью "BMPR-IB." Отдельно, передать один миллион клеток в 100 мкл FACS буфера в пробирку для центрифугирования отдельной пластиковой надписью "Безупречный". Добавляют 1 мл FACS буфера к "незапятнанным" трубки. Хранить остаток клеток в буфере FACS на льду в то время как FACS-сортировкой часть EXPERiment делается. Добавьте эти клетки "Unsorted". Используйте их в качестве средства управления позже в эксперименте.
- Добавьте соответствующее количество флуоресцентного анти-человеческого антитела BMPR-IB к трубе "BMPR-IB" в соответствии с инструкциями изготовителя. Пипетировать смесь вверх и вниз, осторожно, чтобы распространять антитела.
Примечание: Мы используем BMPR-IB / ALK-6 APC-конъюгированного антитела человека в разведении 1:10 (см список реагентов для деталей). Тем не менее, антитела от разных производителей будут иметь разные рекомендуемые концентрации. - Накройте ведро льда в пути, который держит вне свет. Разрешить смесь клеток / антитело сидеть в течение 30 минут (или в соответствии с инструкциями изготовителя антитела).
Примечание: Если антитело против BMPR-IB поставляется в качестве основного неконъюгированного антитела, которое требует вторичного антитела, выполнить отдельный этап окрашивания на льду с вторичным антителом в соответствии с инструкциями изготовителя. - Центрифуга обе трубки в300 мкг в течение 5 мин при температуре 4 ° С. Аспирируйте супернатант, стараясь не отсосать осадок. Ресуспендируют осажденные клетки в 1 мл FACS буфера. Опять же центрифуге трубки при 300 мкг в течение 5 мин. Тщательно аспирата супернатант и клетки вновь суспендируют в буфере FACS до концентрации 1 миллион клеток на 1 мл.
- Фильтр "BMPR-IB", "незапятнанной" и "Unsorted" клетки через 40 мкм ячейки сита в новые меченых стекла FACS труб. Промойте фильтры 500 мкл FACS буфера, чтобы гарантировать, что клетки не остались в фильтре. Кроме того, добавьте 2 мл стандартной среды для двух отдельных труб пластиковые центрифужные с надписью "BMPR-IB-положительным" и "BMPR-IB-негативный". Используйте эти два, чтобы собрать отсортированные клетки в машине FACS.
- На машине FACS, использовать неокрашенные клетки, чтобы определить отрицательную заслонкой для флуоресцентного маркера.
- Использование 100 микрон сопло, сортировка BMPR-IB положительные и отрицательные клетки в соответствующие пробирки консодержащих стандартную среду. Хранить эти трубки охлажденными при температуре 4 ° С в течение рода, если машина FACS имеет эту способность.
Примечание: Пожалуйста , обратитесь к статье Jove 13 Шарон и др. для отличного протокола для FACS сортировки. - С помощью гемоцитометра, подсчет клеток в каждой пробирке. Центрифуга "BMPR-IB-положительным", "BMPR-IB-отрицательные" и "Unsorted" пробирки при 300 мкг в течение 5 мин при 4 ° С и аспирата супернатант, стараясь не потревожить осадок клеток. Затем клетки вновь суспендируют в стандартной среде до концентрации 1 миллион клеток на 250 мкл.
- Получение предварительно вырезанное 4 мм PLGA (поли [молочной и гликолевой кислоты]) каркасы, покрытые гидроксиапатита. Поместите каждую леску в лунку 24-луночного планшета. Накройте каждую леску с 50 мкл клеточной суспензии из одной из трех групп (я .e, 200000 клеток.): Unsorted, BMPR-IB-положительным, и BMPR-IB-отрицательным (рисунок 3).
Примечание: Пожалуйста,обратитесь к статье Jove 14 Ло и др. Подробную информацию о конструкции PLGA строительных лесов. - Частично заполнить окружающие пустые лунки со стандартной средой (чтобы предотвратить высыхание каркасах), покрывающие пластины с крышкой, и инкубировать в культуре клеток инкубаторе при температуре 37 ° С в течение 30 мин.
4. Создание свода черепа дефектов и применение ACS-содержащего строительные леса
ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь в том, что соответствующие институциональные согласования на месте для создания свода черепа дефектов в живых мышей. Этот протокол был одобрен Институциональные уходу и использованию животных комитета Стэнфордского университета по.
- Обезболить CD-1 обнаженная мышь, используя либо ингаляционный изофлуран газа или внедренный длительного действия анестетика коктейль.
- Для того, чтобы использовать газ в одиночку, поместите курсор в наркоз камеру и начать подачу кислорода при температуре 2 - 3 л / мин с концентрацией изофлуран 2%. После того, как мышь еully без сознания, поместите его склонным на теплой воде, рециркулирующей одеяло с абсорбентом площадку и поместите его в морду анестезии носового конуса с той же концентрацией кислорода и изофлуран. Тщательно контролировать частоту дыхания и регулировать концентрацию изофлюрана по мере необходимости.
- Для того, чтобы использовать внедренный пролонгированный обезболивающий коктейль, анестезию мыши в наркоз камере, как это описано выше, а затем вводят анестетик коктейль. Отключив мышь от анестезии камеры и наблюдать за его поведением.
Примечание: Мышь может на короткое время выйти из анестезии, но в течение нескольких минут необходимо снова полностью под наркозом под действием нагнетаемого анестетика. Перенесите мышь в теплую воду рециркуляционного одеяло, покрытый абсорбентом площадку.
Примечание: Для получения анестезирующего коктейля, мы рекомендуем смесь, содержащую кетамин 10 мг / мл и ксилазин 1 мг / мл в нормальном солевом растворе, доставленные внутрибрюшинно. Стандартная доза этой смеси300 мкл в течение 30 г мыши, что эквивалентно кетамином 100 мг / кг и ксилазина 10 мг / кг. Смотрите раздел Обсуждение Для получения более подробной информации о инъекционной анестезии. - Используйте палец ноги пинч маневр, чтобы определить глубину анестезии. Адекватно наркозом мышь не убирается лапу, когда он слегка ущипнул хирургом.
- Нанести глазную мазь, чтобы предотвратить высыхание роговицы.
- Администрирование 1 мг / кг бупренорфина SR подкожно.
Примечание: Предоставление обезболивание ранее результатам операции в высшей облегчения боли. - В течение всей процедуры, контролировать частоту дыхания мыши.
Примечание: Мышь правильно наркозом под изофлуран должны иметь частоту дыхания 50 - 100 вдохов / мин. Повышенная частота дыхания указывает на то, что анестезия слишком светлый, в то время как снизились частота дыхания может свидетельствовать о том, что анестезия слишком глубоко.
- Приготовительный кожи спинной части черепа с повидон-иодаРешение ине с последующим 70% этанола в три раза. Накройте стерильными простынями, оставляя место операции воздействию.
Примечание: Носите стерильные хирургические перчатки и поддерживать стерильность во время процедуры. трогайте только стерильные поверхности и предметы, такие как стерильный драпировка и автоклавного инструментов. Попросите помощника отрегулировать освещение, открытые пакеты шовные и т.д. - Используя 15-лезвия скальпель, сделайте сагиттальный срединный разрез, который простирается над большей частью спинного черепа. С помощью тонкой зубчатыми щипцами, втягивать кожу на правой стороне разреза, чтобы разоблачить правой теменной кости.
- С помощью дрели с автоклавного 4 мм с алмазным покрытием Трепан сверлом, просверлить дефект через теменной кости. Не выдвигайте дефект кости в прошлое твердой мозговой оболочки слоя. (Рисунок 4)
- Поместите леску в дефект, а затем закройте разрез кожи проточной нейлоновой нити.
- Монитор мыши и обеспечивают стандартную послеоперационную забочусьогласно институциональных руководящих принципов.
- Держите мышь на чистое бумажное полотенце в чистой клетке в то время как он восстанавливается. Одна половина из клетки должны быть размещены на теплой воде, рециркулирующей одеяло и мышь должна сначала быть помещены в этой половине.
- Не оставляйте мышь без присмотра, пока он не пришел в сознание достаточное, чтобы передвигаться. Не возвращайте мышь, которая прооперированы в клетку с другими мышами, пока не будет полностью восстановлена.
- Повторите описанные выше шаги с новой мыши для каждого помост, который должен быть проверен. Стерилизовать хирургических инструментов между хирургических операций с использованием горячего шарика стерилизатор или другой подходящий метод.
- Вскоре после этой процедуры, а затем на 2, 4, 6 и 8 недель, с помощью микро-КТ-сканирование, чтобы проанализировать скорость закрытия дефекта свода черепа.
ПРИМЕЧАНИЕ: См статью Леви и др. 6 для описания микро - КТ дефектов свода черепа. - Когда эксперимент Комплексыт.е, усыпить мышей, помещая их в чистую эвтаназии камеру и начать поток углекислого газа в камеру со скоростью 2 л / мин. После того, как дыханий перестали полностью (после примерно 10 мин) выполнять шейки дислокации, чтобы подтвердить эвтаназию.
- По желанию, после того, как эксперимент завершится, использование секционирования и гистологическое окрашивание для оценки образования костной ткани в пределах дефекта.
ПРИМЕЧАНИЕ: См статью Макардл и др. 12 Подробную информацию о подготовке кости образцов для гистологического исследования. Для обзора гистологических и окрашивания техники, см гистологическое руководство , например, Руководство по хирургической патологии 15.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Micro КТ делается на день операции ясно покажет дефект черепа. В это время не будет врастание в 4 мм дефект. Последующем сканировании получены в течение долгого времени, чтобы количественно оценить размер дефекта с течением времени по сравнению с базовой линией. Дефекты , посеянные с BMPR-IB + клетки должны демонстрировать более быстрое закрытие дефекта по сравнению с BMPR-IB- и НЕСОРТИРОВАННАЯ клеток (рисунок 5). Кроме того, часть черепа , содержащего дефект может быть декальцированной и обработаны для гистологического исследования с использованием стандартных методов , 12. Секции окрашивали pentachrome пятно Movat будет выявить большую регенерацию костной ткани у дефекта , обработанного BMPR-IB клеток по сравнению с другими популяциями клеток (рисунок 6).
Рисунок 1: липоаспирата после PBS Wash. сильный> добавляется канистру липоаспирата после PBS и смеси дают отстояться. Слой верхнего ткани является жировая ткань, которая проходит ИСС, в то время как нижний слой является водный слой, в основном состоящий из физиологического раствора и крови. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2: Размещение клеточной суспензии на Polysucrose раствора. (а) Клеточную суспензию должна быть пипеткой очень аккуратно на стороне трубки, что позволяет ему работать поверх раствора polysucrose. (б) Это правильный внешний вид клеточной суспензии слоя на верхней части polysucrose перед центрифугированием."> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 3: Посев клеток на эшафот. (а) На стерильной поверхности одну лунку 24-луночный культуральный планшет, загрузите сухую леску с приблизительно 50 мкл клеточной суспензии. (б) Выдержите леску в культуре клеток инкубаторе в течение 30 мин , чтобы позволить адгезию клеток. Примечание: На рисунке 10 см пластина используется для демонстрационных целей. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 4: Создание костный дефект. Костный дефект (стрелки) видна воткрытая кожа надрез. Обратите внимание, не подвергнутые воздействию дуральные кровеносные сосуды (стрелки), указывая, что бурение не нарушала твердую мозговую оболочку. Шкала бар, 5 мм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 5: Исцеление критических размеров дефектов свода черепа с различным ASC подгруппах. (A) Трехмерные микро- реконструкций CT были выполнены для дефектов свода черепа отремонтировав с Unsorted, BMPR-IB (+), или BMPR-IB (-) ИСС. (В) Количественное исцеления через 8 недель продемонстрировали значительно большую регенерацию костной ткани с ИСС (92%) BMPR-IB (+) по сравнению с несортированная и BMPR-IB (-) ИСС (58% и 46%, соответственно, ** р < 0,01). Значительные различия в исцелении были также замечены в 2 часа мыЭКС (** р <0,01), 4 недели (*** р <0,001) и 6 недель (*** р <0,001). Микро-КТ, микро- компьютерной томографии. Печатается с разрешения Макардла и др. 12. Столбики ошибок обозначают стандартное отклонение. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 6: Гистологический Окрашивание костного регенерата. Pentachrome окрашивание (A) Movat в кости регенерации в дефектов ремонтируемых с несортированным, BMPR-IB (+) или BMPR-IB (-) ИСС при увеличении 5X с использованием светлого поля микроскопии. Обратите внимание, формирование более прочной костной ткани в BMPR-IB (+) группе по сравнению с BMPR-IB (-) группы. Пунктирная линия представляет степень области дефекта. Область внутри черного прямоугольника показан на более высоком Magnificвания с использованием (B) , в 10 раз и (С) 40X светлого поля микроскопию дефектной области. Печатается с разрешения Макардла и др. 12. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Критические шаги в рамках Протокола
Во время сбора урожая ИСС, важным шагом является адекватным переваривание жира с коллагеназы. Недостаточное пищеварение приведет к низкому выходу ИСС. Во время FACS сортировки клеток BMPR-IB +, важно тщательно определить ворота для положительности. Определение ворот слишком свободно может привести к отсортированных популяций, которые не являются чистыми. Во время создания дефекта свода черепа, очень важно, чтобы развернуть дефект через кости черепа, но, чтобы не наступать на твердую мозговую оболочку. Это вызовет обильное кровотечение и облучение головного мозга, что потребует эвтаназии животного.
Модификации и устранение неисправностей
Что касается анестезии для свода черепа хирургии дефекта, наша лаборатория предпочитает использовать ингаляционный изофлуран, но другой вариант заключается в внутрибрюшинно вводят смесь, содержащую конечную концентрацию кетамин 10 мг / мл и ксилазин 1 мг / мл в нормальном SAлиния. Стандартная доза этой смеси составляет 300 мкл на 30 г мыши. Это обеспечивает примерно 30 мин надежных анестезии, которая не требует мыши, чтобы быть в изофлурановым конусообразной во время операции. Недостатком использования впрыскиваемого анестетик, что это не возможно, чтобы уменьшить дозу после инъекции было дано. В противоположность этому, при вдыхании изофлуран легко можно титровать вверх или вниз в режиме реального времени.
При добавлении суспензии клеток к плахе, исследователи могут обнаружить, что объем жидкости слишком мал, и частично испариться в 30 мин инкубации. Испарение может привести к гибели клеток, что является особенно вредным confounder в лечении костей экспериментов. Для борьбы с этим, загрузите эшафот внутри лунку 24-луночного планшета. Заполните немедленно окружающие скважины с обычной средой. Это создаст увлажненный микро-среду, которая помогает сохранить загруженную леску от высыхания.
Гистологическое окрашивание кости предварительнона правильном показаны, и тщательное декальцинации свода черепа до встраивания и секционирования. Принято считать, что черепов разного возраста требуют отличающиеся длительности декальцинации, традиционно делается в растворе ЭДТА
Ограничения техники
Этот протокол использует 4 мм костный дефект, чтобы оценить способность популяции клеток для улучшения закрытия дефекта. Эта модель не может имитировать исцеление, которое происходит в более сложной среде, такой как длинный перелома кости или резекции опухоли. По этой причине, альтернативные модели на животных, возможно, должны быть использованы для понимания вклада ИСС в заживления кости в этих условиях.
Значимость техники в отношении существующих / альтернативных методов
С помощью проточной цитометрии для выделения конкретных групп населения ASC является перспективным методом для повышения заживления и регенерации в контексте множественной ткани и вМодели жюри, такие как ангиогенез, адипогенеза и остеогенеза. Полезность про-остеогенных клеток исследуется в этом исследовании, показывая глубокое воздействие с клетками положительно отобранных для BMPR-IB в заживлении костный дефект.
Предварительные протоколы для изоляции ASC включают культивирования клеток в течение нескольких дней на клеточной культуре пластин 16. Тем не менее, клетки могут испытывать значительные фенотипические дрейф в то время как культуры. По этой причине мы используем протокол изоляции ASC, который позволяет быстро выделения этих клеток, а затем дальнейшей очистки субпопуляционном с использованием FACS. Вся процедура осуществляется менее чем за день, сводя к минимуму эффекты маркера клеточной поверхности или фенотипического дрейфа.
Будущие применения и направления
Мы показали, что ИСС высокоэкспрессирующими BMPR-IB демонстрируют большую способность усиливать регенеративную заживление дефекта кости по сравнению с другими ИСС. Механизмы лежат в основеИНГ это явление не известны. Например, не ясно, непосредственно ли клетки сами дифференцироваться в костные клетки, формирующие, или они производят факторы, которые стимулируют другие клетки, чтобы сделать это. Будущие исследования должны быть выполнены, чтобы ответить на эти вопросы.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 micron cell strainer | Falcon | 352360 | |
| 15 blade scalpel | Miltex | 4-515 | |
| 24 well plate | Corning | 3524 | |
| 40 micron cell strainer | Falcon | 352340 | |
| 50 mL conical centrifuge tubes | Falcon | 352098 | |
| 6-0 Ethilon nylon suture, 18", P-3 needle, | Ethicon | 1698G | |
| Anti-BMPR-IB primary antibody | R&D systems | FAB5051A | |
| BioGel PI surgical gloves | Mölnlycke Health Care | ALA42675Z | |
| Buprenorphine SR | ZooPharm | ||
| Castro-Viejo needle driver | Fine Science Tools | 12565-14 | |
| CD1 nude mouse | Charles River | 086 | |
| Collagenase Type II powder | Gibco | 17101-015 | |
| DMEM medium | Gibco | 10564-011 | |
| Drill: Circular knife 4.0 mm | Xemax Surgical | CK40 | |
| Drill: Z500 Brushless Micromotor | NSK | NSKZ500 | |
| FBS | Gicbo | 10437-077 | |
| Fisherbrand Absorbent Underpads, 20" x 24" | Fisher Scientific | 14-206-62 | |
| Fisherbrand Sterile cotton gauze pad, 4" x 4" | Fisher Scientific | 22-415-469 | |
| Heating pad | Kent Scientific | DCT-20 | |
| Hyclone 199/EBSS medium | GE Life Sciences | SH30253.01 | |
| Isothesia isoflurane | Henry Schein | 050033 | |
| Micro Forceps with teeth | Roboz | RS-5150 | |
| Micro Forceps with teeth | Roboz | RS-5150 | |
| Paraffin film (Parafilm) | Bemis | PM996 | |
| PBS | Gibco | 10010-023 | |
| Pen-Strep | Gibco | 15140-122 | |
| PLGA scaffolds | Proprietary Formulation | ||
| Poloxamer 188, 10% | Sigma | P5556-100ML | |
| Polylined Sterile Field, 18" x 24" | Busse Hospital Disposables | 696 | Cut a rectangular hole of the appropriate size |
| Polysucrose Solution: Histopaque 1119 | Sigma | 11191 | |
| Povidone Iodine Prep Solution | Medline | MDS093944H | |
| Puralube petrolatum ophthalmic ointment, 1/8 oz. tube | Dechra Veterinary Products | ||
| RBC lysis buffer | Sigma | 11814389001 | |
| Webcol alcohol prep swabs | Covidien | 6818 |
References
- Silber, J. S., et al. Donor site morbidity after anterior iliac crest bone harvest for single-level anterior cervical discectomy and fusion. Spine (Phila Pa 1976). 28 (2), 134-139 (2003).
- Giannoudis, P. V., Dinopoulos, H., Tsiridis, E. Bone substitutes: an update. Injury. 36, S20-S27 (2005).
- Laurencin, C., Khan, Y., El-Amin, S. F. Bone graft substitutes. Expert Rev Med Devices. 3 (1), 49-57 (2006).
- Walmsley, G. G., et al. Nanotechnology in bone tissue engineering. Nanomedicine. 11 (5), 1253-1263 (2015).
- Chapekar, M. S. Tissue engineering: challenges and opportunities. J Biomed Mater Res. 53 (6), 617-620 (2000).
- Levi, B., et al. Human adipose derived stromal cells heal critical size mouse calvarial defects. PLoS One. 5 (6), e11177 (2010).
- Gimble, J. M., Katz, A. J., Bunnell, B. A. Adipose-derived stem cells for regenerative medicine. Circ Res. 100 (9), 1249-1260 (2007).
- Levi, B., et al. CD105 protein depletion enhances human adipose-derived stromal cell osteogenesis through reduction of transforming growth factor beta1 (TGF-beta1) signaling. J Biol Chem. 286 (45), 39497-39509 (2011).
- Chung, M. T., et al. CD90 (Thy-1)-positive selection enhances osteogenic capacity of human adipose-derived stromal cells. Tissue Eng Part A. 19 (7-8), 989-997 (2013).
- Wozney, J. M., et al. Novel regulators of bone formation: molecular clones and activities. Science. 242 (4885), 1528-1534 (1988).
- Wan, D. C., et al. Osteogenic differentiation of mouse adipose-derived adult stromal cells requires retinoic acid and bone morphogenetic protein receptor type IB signaling. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (33), 12335-12340 (2006).
- McArdle, A., et al. Positive selection for bone morphogenetic protein receptor type-IB promotes differentiation and specification of human adipose-derived stromal cells toward an osteogenic lineage. Tissue Eng Part A. 20 (21-22), 3031-3040 (2014).
- Sharon, Y., Alon, L., Glanz, S., Servais, C., Erez, N. Isolation of normal and cancer-associated fibroblasts from fresh tissues by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS). J Vis Exp. (71), e4425 (2013).
- Lo, D. D., et al. Repair of a critical-sized calvarial defect model using adipose-derived stromal cells harvested from lipoaspirate. J Vis Exp. (68), (2012).
- Lester, S. C. Manual of surgical pathology. , Saunders/Elsevier. (2010).
- Bunnell, B. A., Flaat, M., Gagliardi, C., Patel, B., Ripoll, C. Adipose-derived stem cells: isolation, expansion and differentiation. Methods. 45 (2), 115-120 (2008).
