Summary
後成の要因は遺伝子発現を調節して B 細胞の機能を調節する遺伝的プログラムと対話できます。体外B 細胞刺激、qRT PCR とハイスループット マイクロ Rna シーケンスおよび mRNA シーケンスのアプローチを組み合わせて、B 細胞のマイクロ Rna と遺伝子発現のエピジェネティックな変調を分析できます。
Abstract
抗体は、体性 hypermutation (SHM)、クラス スイッチ組換え DNA (CSR) およびプラズマ細胞の分化を含むいくつかの重要な B 細胞の本質的なプロセスを通じて実行されます。近年、エピジェネティック修飾やヒストン脱アセチル化とマイクロ Rna (Mirna) などの要因が後成の要因の機能不全につながる発見されました、図形抗体を B 細胞遺伝的プログラムと対話する示されています。自己抗体の応答。エピジェネティックな変調器への応答における B 細胞におけるゲノム マイクロ Rna と mRNA 発現解析は、B 細胞の機能と抗体の応答のエピジェネティック制御を理解することにとって重要です。ここでは、CSR と形質細胞に分化する B 細胞を誘導、ヒストン脱アセチル化酵素 (HDAC) 阻害剤 (定) とこれらの B セルを扱うマイクロ Rna と mRNA の発現解析のためのプロトコルを示す.このプロトコルで直接次世代 mRNA シーケンス (mRNA seq) と miRNA seq 技術、ゲノムおよび定量的逆転写 (qRT) 読み取り順序のマッピングを使用して相補的 DNA (cDNA) シーケンス分析-PCR。これらのアプローチで、CSR とプラズマ細胞分化を受ける B 細胞、HDI、エピジェネティックな調節選択的にマイクロ Rna と mRNA 発現を調節して CSR とプラズマ細胞分化を変更を定義しました。
Introduction
エピジェネティックなマークや、DNA のメチル化、ヒストン修飾、(マイクロ Rna を含む)、非コード Rna などの要因、遺伝子式1を変更することにより細胞機能を調節します。エピジェネティック修飾免疫グロブリン クラス スイッチ DNA 組換え (CSR)、体性 hypermutation (SHM)、メモリー B 細胞や形質細胞、抗体と自己抗体により変調への分化などの B リンパ球の機能を調節します。応答2,3。CSR SHM が高い T に依存し、T 独立した抗原4B 細胞に誘導される活性化誘導シチジン アデノシンデアミナーゼ (援助、 Aicdaとしてエンコード) が批判的に必要です。クラス スイッチ/hypermutated の B 細胞は 1 (Blimp1、 Prdm1としてエンコード)5大量の B リンパ球による成熟タンパク質に批判的に依存しての方法で抗体を分泌する形質細胞に分化します。B 細胞の異常なエピジェネティックな変化異常抗体/抗体応答は、アレルギー反応や自己免疫1,4につながる可能性があります。B 細胞の内因、Mirna などどの後成の要因を理解すると、調節遺伝子発現は、ワクチン開発のために重要ではないが、潜在的な異常抗体/抗体応答のメカニズムを明らかにすることも重要です。
ヒストンのアセチル化と脱アセチル化されてヒストンのアセチルトランスフェラーゼ (帽子) とヒストン脱アセチル化酵素 (HDAC) 通常触媒を用いるヒストン蛋白質のリジン残基の変更。これらの変更をクロマチンの増加または減少のアクセシビリティにつながる、さらに許可または DNA と遺伝子発現5,6,の変質するトランスクリプション要因または蛋白質の結合を妨げる7,8. HDAC の抑制剤 (HDI)、hdacs をしたの機能を阻害する化合物のクラス。ここでは、B 細胞の本質的な遺伝子発現プロファイルとその機構上 HDAC の規制に対処するため HDI (バルプロ酸) を使用しました。
Mirna が小さく、非コード Rna 約 18 に 22 ヌクレオチド長でいくつかの段階を経て生成されます。miRNA 宿主遺伝子が書き換えられるとヘアピン プライマリ マイクロ Rna (Mirna-pri)。彼らは、pri Mirna が処理されてさらに Mirna 前駆体 (pre-Mirna) に細胞質にエクスポートされます。最後に、pre miRNAs の胸の谷間を経て成熟 Mirna が形成されます。miRNAs そのターゲット Mrna6、7の 3' 非翻訳領域内の相補的なシーケンスを認識します。転写後サイレンシングは、miRNAs は、増殖・分化・ アポトーシスの10、11などの細胞の活動を調節します。複数 miRNAs 同じ mRNA をターゲットすることができますので、1 つの単一のマイクロ Rna が複数の Mrna を対象可能性のある個々 の値は、miRNAs の集合的な効果を理解するマイクロ Rna 発現プロファイルのコンテキストのビューを持つことが重要です。miRNAs B 細胞の発達と周辺分化段階特異 B 細胞の分化、抗体応答、自己免疫1,4,9に関与することが示されています。3' UTR AicdaとPrdm1miRNAs8の対象にできるいくつか検証済みまたは予測の進化上保存されたサイトがあります。
エピジェネティックな変調では、ヒストンの転写後修飾および Mirna を含む遺伝子式9の細胞型と細胞の段階に特異的パターンを表示します。ここでは、我々 は miRNA と mRNA 発現、CSR およびプラズマ細胞の分化の HDI を介した変調を定義する方法を説明します。CSR と形質細胞分化を受ける B 細胞を誘導するためのプロトコルが含まれますHDI; と B 細胞を治療のためqRT PCR、seq、マイクロ Rna と mRNA seq10、11,12,8,13マイクロ Rna と mRNA 発現を分析するため。
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Protocol
プロトコルの制度的ケアとテキサス大学サンアントニオ校の利用委員会の動物のケアのガイドラインに従います
。1 CSR、プラズマ細胞分化、HDI 処理マウス B 細胞の刺激
- 脾臓細胞懸濁液の準備
注: マウスを除いて層流フードのすべての手順を実行します。安楽死と郭清。- 、特定病原体フリー c57bl/6 j マウス (8-12 週齢) の CO 2 吸入により安楽死 。
- は、上向き腹部解離性基板上にマウスを置きます。18 ゲージ 1.5 で注射針を使って、マウスのすべての 4 フィートをピンします 。
- 70% エタノールに浸したワイプを使用して皮膚を消毒します 。
- (鉗子と解剖はさみ) (肝臓のすぐ下、腹部の左側) に脾臓を視覚化する胸郭のすぐ下の皮膚をカットするオートクレーブの手術器具の 1 つのセットを使用します 。
- を使用して、別の滅菌鉗子と脾臓を優しく鉗子でクランプし解離性大のすべての接続組織を切断、胃の大彎側下にある脾臓を抽出するはさみはさみ。すべての接続組織を削除することを確認します 。
- は、完全 RPMI1640 培地の 1,000 μ L を含む 1.5 mL 遠心チューブに脾臓を配置 (RPMI 1640 培地を添加した 10% 熱不活化牛胎児血清 (FBS)、2 mM L-グルタミン 100 μ g/mL ペニシリン、100 μ g/mLストレプトマイシン、0.25 μ g/mL アムホテリシン B、50 μ M β-メルカプトエタノール).
- は、50 mL ポリプロピレン製円錐形遠心管に 70 μ m の細胞ストレーナーを配置し、セル ストレーナーに遠心チューブから脾臓を注ぐ。15 mL ポリプロピレン製円錐形遠心チューブの先端を使用して、こし器を通して、脾臓を軽くマッシュします。15 に 20 ml の完全培地のセル ストレーナーをすすいでください 。
- 350 x g は 5 分、破棄上澄みでセル スピンダウン 。
- は、脾臓細胞懸濁液から赤血球を削除します。ACK の換散バッファー (脾臓あたり 5 mL) の細胞ペレットを再懸濁します。時折揺れで室温で 4 分間インキュベートし、25 ml の完全培地の癒す 。
- スピン 5 min のための 350 x g でセルと上澄みを廃棄します。1 または 10 の mL の完全培地で細胞ペレットを再懸濁します。診断の実行可能なセルをカウントします 。
- B 細胞分離
注: 製造元に続く負の淘汰によって特定の B 細胞 ' の指示。非 B 細胞が非 B 細胞 (CD4、CD8、CD11b, CD43、CD49b、CD90.2、Ly-6 C/G (グラム-1)、および TER119) とストレプトアビジン コーティングした磁性粒子に対するビオチン化抗体を除去対象します。- 1 x 10 8 セル/mL の完全培地滅菌 5 mL (12 × 75 mm) ポリスチレン中での 0.25 を 2 mL 細胞懸濁液の準備丸底チューブ。正常ラット血清 (50 μ L/mL) をサンプルに追加します 。
- 追加 50 μ L/mL 分離のサンプルにカクテル。軽くピペッティングにより細胞をミックス アップし、ダウンの 2 - 3 倍で 10 分間室温でインキュベート
- は、75 μ L/mL ストレプトアビジン コーティングした磁性粒子をサンプルに追加します。上下に軽くピペッティングして混合物をミックス 2 〜 3 回、2.5 分間室温でインキュベートします 。
- は、完全 RPMI 1640 培地を追加します。優しく上下に 2 - 3 回をピペッティングにより細胞をミックスします 。
- 磁石入り (蓋) なしチューブを置き、上清を新しい 15 mL の円錐管にそのまま B 細胞を含むオフ 2.5 分注ぐのため室温でインキュベートします 。
- は、検定とトリパン ブルー染色を使用して実行可能なセルを数えます。B220 など CD19 B 細胞の表面のマーカーのフローサイトメトリー分析による B 細胞の純度を評価します 。
- B 細胞刺激と HDI 治療
- 10 6 セル/mL x 0.3 の最終的な集中で完全な RPMI 1640 中浄化された B 細胞を再懸濁します 。
- は、細胞培養のための 48 ウェル細胞培養プレートを使用します。各ウェルの精製された B 細胞懸濁液 (10 6 セル/mL x 0.3)、大腸菌 IL-4 (最終濃度が 5 ng/mL)、および 0 から LPS (3 μ g/mL 最終濃度) または 500 μ M HDI (バルプロ酸; 1 mL を追加します。VPA).
- QRT PCR および高スループット mRNA および miRNA 配列解析のための 60 の h またはフローサイトメトリー解析のため 96 h の CO 2 を 37 ° C、5% で細胞をインキュベートします 。
- CSR と形質細胞分化のフローサイトメトリー解析
- 文化の 96 時間後を上下に数回セルをピペッティングして各ウェルから細胞をデタッチします。1.5 mL 遠心チューブに細胞懸濁液を転送します。ベンチトップ遠心分離機を使用して 5 分間 350 x g で細胞をスピンし、上澄みを廃棄します 。
- 1 %bsa と 0.5 ng/mL フルオレセイン (FITC)-を含む HBSS バッファーの 100 μ L で細胞を再懸濁します 抗 - マウス IgM 抗体 (Ab) , 0.2 ng/mL アロフィコシアニン (APC) 共役ヤギ-共役ラット抗マウス IgG1モノクローナル Ab (mAb)、0.2 ng/mL フィコエ リスリン (PE)-2 ng/mL 7-aminoactinomycin、0.2 ng/mL PE Cy7 共役ラット抗マウス CD138 mAb ラット抗マウス B220 mAb を共役 D (7 AAD).
- 30 分間室温で暗闇の中で蛍光色素標識された抗体 (ステップ 1.4.2) で細胞をインキュベート
- 1 ml 1 %bsa を用いた HBSS のセルを洗浄しています 。
- でベンチトップ遠心分離機および破棄上清を使用して 5 分間 1,500 × g 細胞スピンダウン 。
- は 300 μ L と 1% BSA HBSS の細胞を再懸濁し、細胞懸濁液を丸底ポリスチレン管に転送します。光の露出を避けるために箔でチューブをカバーします 。
- 単一細胞懸濁液に流れフローサイトメトリー分析を実行します。各補正のサンプルの 50,000 イベントおよびその他のサンプルの 250,000 のイベントを収集します。装置ソフトウェアを使用してデータを分析します 。
- は、パルス形状ゲート (FSC FSC A と SSC A x SSC H x H) を用いた破片やダブレットを排除します。適切なゲートの死んだ細胞を除外する 7 AAD にプロットします 。
2。高スループット mRNA Seq
文化- 後 60 h メーカーに続く小さな RNA を回復できるトータル RNA 分離キットを使用して 2-4 × 10 6 セルからの総 RNA の抽出 ' の指示。DNase を含む私の治療ステップです 。
- 次の製造業者のバイオアナライザーを用いた RNA の整合性を確認 ' の指示 。
- を使用して、高品質の総 RNA の 500-1,000 ng (RNA 整合性数鈴 > 8.0) RNA seq 商業 RNA と図書館準備サンプル p次のメーカー担当者キット ' の指示 。
- は、アダプターのそれぞれ 6 bp インデックス部分に基づく個々 の mRNA seq ライブラリをプールし、50 bp/シーケンスでライブラリをシーケンスします。メーカーによると高スループット DNA システムを使用して ' s プロトコル 。
- Fastq ファイルの各サンプルを生成する CASAVA をデマルチプレックスするシーケンスを実行した後。マッピングの読み取り、以前に概説した 11 としてのバイオインフォマティクス解析を実行します 。
- は、すべてのシーケンス読み取り自分の参照ゲノム (UCSC マウスのゲノムのビルド mm9) TopHat2 デフォルト設定 14 を使用して合わせます。HTSeq カウントを使用して、すべてのサンプルの遺伝子あたり数を得ることの配置から bam ファイルを処理します 。
3。高スループット miRNA Seq
- 高品質総 RNA の使用 100 ng 1 μ g の準備として手順市販の小さな RNA シーケンス キットを使用して、小さな RNA シーケンス ライブラリの準備のための 2.1 。
- Ligate 退化した 3 '、5 の上にアダプター ′ 商業ライゲーション キットを開始小さな RNA 分子の両端。退化の 5 を縛る '、3 の上にアダプター ′ 商業ライゲーション キットを開始小さな RNA 分子の両端。逆のトランスクリプションによって RNA を cDNA に変換し、市販キットと PCR 増幅による小さな RNA シーケンス ライブラリを増幅します 。
- は、最後の小さな RNA シーケンス ライブラリを分離するのに 6 %tbe ネイティブ ページのゲルを使用します。ブロモフェノール ブルー染料を追跡バンド ゲル (0.5 - 1 cm) の底に近づくまで、200 V で 1 X TBE バッファーでゲルを実行します 。
- ガラス板からゲルを外し、エチジウム ブロマイド (水に 0.5 μ g/mL) で 2-3 分ゲルは UV transilluminator または他のゲルのマニュアル楽器でバンドの視覚化のための清潔な容器にステインします 。
- カットきれいなかみそりを使用して ~ 150 bp のバンドをして 1.7 mL の管にそれを配置します 。
- 製造元ゲル抽出キットを使用して DNA を抽出します 。
- サイズ商業高感度 DNA 分析と最後のライブラリ メーカーあたり商業 dsDNA アッセイと濃度分布を確認 ' 指示します 。
- 増幅と後続のシーケンスを実行、メーカーごとの商業ハイスループット DNA シーケンス システムのライブラリをプール ' s プロトコル 。
- 、メーカーごとの各サンプルに対して fastq ファイルを生成する CASAVA と Demultiplex ' s プロトコル 。
- 各サンプルの小さな RNA シーケンス解析、小さな RNA の位置が合わせ、メーカーごとのちらつきを使用 ' s プロトコル。
- RRNA、プライマー、ミトコンドリアなどの汚染物質に配置し、読み取りを削除します 。
- 成熟 miRNA 配列にデータを配置します 。
- ヘアピン ループ シーケンス (miRNA 前駆体) にデータを配置します 。
- その他の小さな RNA シーケンス (fRNA データベースを使用して) 15 にデータを整列します 。
- すべてのサンプルは、定量化、別グループ/サンプル間の差分表現 Mirna を定義します。選択した Mrna または TargetScan 16、小宇宙 17、および PicTar などのオンライン miRNA ターゲット予測ツールを使用して選択の miRNA の対象にできる Mrna ターゲット Mirna を予測 18.
- 機能アノテーションまたは経路の解析が必要な場合提出する創意工夫パスウェイ解析 (IPA) に予測された遺伝子やダビデ 。
4。量的な RT-PCR (qRT PCR) Mrna の miRNAs
- mRNA の qRT PCR 解析
- RNA の抽出 0.2 5 × 10 から 6 セル次、small RNA を回復することができます商業トータル RNA 分離キットを使用して、メーカー ' の指示。DNase を含む私の治療ステップです 。
- オリゴ dT プライマーを用いた最初繊維の cDNA の統合システムの総 RNA からの cDNA を合成します 。
- 次のプロトコルとリアルタイム PCR マスター ミックス × 2 を使用して、適切なプライマーを qRT PCR による cDNA を定量化: 95 ° C、15 s、40 サイクル 94 ° C の 10 s、60 ° C、30 s、および 30 のための 72 ° C s.
- 72 ° C の拡張段階のデータ集録を行い、95 72 から融解曲線解析を行う ° C
- miRNA の qRT PCR 解析
- 4.1.1 準備したサンプルから分注の RNA 。
- CDNA に RNA を逆転写。次のメーカー商業マイクロ Rna 逆転写キットを使用して ' の指示 。
- は、SYBR グリーン リアルタイム PCR マスター ミックスの 250 nM の成熟 miRNA の前方普遍的な逆プライマーと組み合わせてプライマーを用いたマイクロ Rna のリアルタイム PCR を実行します。
常温
- 融解 2 x PCR マスター ミックス、miRNA 固有前方プライマーおよび普遍的な逆プライマー。個々 のソリューションをミックスします 。 (96 ウェル PCR プレートで使用) 25 μ L あたりよく反応ボリュームの反応混合物の準備次のように
- :
PCR マスター ミックス 12.5 μ L x 2
miRNA 転送プライマー (2.5 μ M) 2.5 μ L
普遍的な逆プライマー (2.5 μ M) 2.5 μ L
RNase 無料 water5 μ L - 96 ウェル PCR プレートに反作用の組合せの追加 22.5 μ L。個々 の板の井戸に cDNA テンプレート (50 pg 3 ng) の 2.5 μ L を追加します 。
- はしっかりと板フィルムをシールします。1,000 x g と部屋の温度で 1 分のプレートを遠心します 。
- リアルタイム サーマルサイクラーにプレートを置き、次のサイクリング プログラムを起動: 95 ° C、5 分、15 94 ° C の 40 のサイクル s、55 ° C、30 s、および 30 のための 72 ° C s.
- スプレッドシートを qRT PCR のデータ解析のための ΔΔCt メソッドを使用します。小型核・核小体 Rna Rnu6/RNU61/2 の式、Snord61/SNORD61、Snord68/SNORD68、Snord70/SNORD70 に関連する Mirna の発現をノーマライズします 。
- 統計解析
- ペアし、ペアの学生による p 値を決定するために統計分析を実行 ' s t - スプレッドシートを使用してテストし、p 値を考慮する < として 0.05大幅な 。
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Representative Results
組合と B 細胞を浄化のプロトコルを使用して (3 μ g/mL) と IL-4 (5 ng/mL) の 96 h は IgG1 に CSR の 30-40%、形質細胞分化の ~ 10% を引き起こすことができます。プラズマ細胞の分化は ~ 2% に減少に 10-20% に低下した CSR IgG1 を HDI (バルプロ酸 500 μ m) と治療後 (図 1)。HDI 抑制する CSR のさらに後組換え Iμ Cγ1 と成熟した VHDJHの減少数によって確認された-Cγ1 トラン スクリプトは、完成した CSR の認刻極印であります。QRT PCR で測定されるAicda CSR/SHM とPrdm1およびXbp1、形質細胞分化のために重要であるのために重要であるの表現は VPA (図 2) によって抑制すること示されていた。
B 細胞の HDI によって mRNA 発現の調節は、高選択的だった。高発現 mrna 発現量のわずか 0.3% が HDI よりも 2 倍で誘導されると高発現の 0.36% だけ LPS と IL-4 B 細胞で mRNA シーケンスによって測定される (> HDI 治療せず B 細胞の 20 コピー/セル) Mrna、を含むAicda、Prdm1、 Xbp1、 HDI よりも 50% (図 3) によって減ったと。
Aicda、Prdm1、およびXbp1発現のダウンレギュレーションは、Mirna 発現の負の制御因子であるによって媒介される可能性があります可能性があります。MiRNA ターゲット予測ツール (TargetScan.org、miRNA.org、および miRbase.org) を使用して、 AicdaまたはPrdm1を対象可能性のある複数の Mirna がわかりました。HDI で処理した B 細胞における miRNA プロファイリングの miRNA seq 解析または nil 示した定選択的に亢進Aicda -とPrdm1 -Mirna (図 4-6) を対象とします。
図 1.B 細胞マーカー B220、表面抗体 IgG1、およびプラズマ細胞のマーカー CD138 表面発現をフローサイトメトリーによる分析した。
B220+ IgG1+細胞が B 細胞特異的な IgG1 に切り替えました。B220低CD138+細胞形質細胞であった。IgG1 スイッチ B 細胞と 96 h の LPS と IL-4 nil の存在下でまたは HDI (バルプロ酸 500 M) で刺激した B 細胞からプラズマ細胞の割合は、ゲート内で数値として示されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2。完成した CSR; の特徴の表現VHDJHを成熟-Cγ1 トラン スクリプトとポスト組換え Iμ Cγ1 成績証明書;Aicda、 Prdm1、およびXbp1が qRT PCR によって解析、 Cd79b成績に正規化し、ヒストグラムで示します。
500 μ M バルプロ酸の存在下で組合と IL-4 刺激 B 細胞における遺伝子発現と遺伝子発現に関連する B の nil の存在下で同じ刺激で細胞が 1 として描かれていました。データは、3 つの独立した実験からです。p値、対t-テストします。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3。B 細胞は LPS と IL-4 で刺激され HDI (バルプロ酸、500 μ M) で治療またはナシ 60 h. mRNA 発現の mRNA シーケンスを用いて解析しました。
(3 つの独立した実験 (百万のマップされたリードの RPKMs プラスミドあたりヒット) で A) 平均の mRNA 発現レベルは散布に描かれています。各プロットは、1 つの個別 mRNA 発現レベルに対応します。2 本の破線、二重線です。散布上の点線の上にある、または下端の下に破線を示す 2 倍以上を表現する Mrna またはバルプロ酸と nil の場合、それぞれによるとき半分以下。(B) 棒グラフを描く mRNA 発現レベル (3 つの独立した実験から平均 RPKMs) 組合での平均的な変化と B 細胞に比べて HDI、IL 4 刺激 B 細胞処理ゼロ。平均 RPKM で Mrna のみ > 20 LPS および IL 4 刺激 B 細胞 nil が含まれています。それぞれ個々 の実験では、mRNA の発現は散布 (C) や (D)、棒グラフで示すように、(A) と (B) のように同じ方法で描かれています。p値、対t-テストします。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4。B 細胞は LPS と IL-4 で刺激され HDI (バルプロ酸、500 μ M) で治療またはナシ 60 h. miRNA 発現のマイクロ Rna シーケンスを用いて解析しました。
(A) 変更に比べて HDI と B 細胞の平均の miRNA 発現レベルの B 細胞に nil で治療は棒グラフが描かれています。(B) B の miRNA の発現レベルの変化細胞に比べて HDI を B 細胞に nil で 3 つの独立した実験で治療は棒グラフが描かれています。平均 RPM で miRNAs のみ > 0.5 LPS および IL 4 刺激 B 細胞 nil が含まれています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 5。HDI Aicda -Mirna をターゲットの表現を増加は、マイクロ Rna シーケンスによって示すように、
(A) 配列アラインメント、Mirna との 3' UTR Aicda Mrna のターゲット サイトの。(B) B 細胞は 60 h の HDI (バルプロ酸 500 M) の有無で LP と IL 4 を培養しました。ターゲットAicda 3' UTR に予測された Mirna 発現 miRNA seq で分析し、RPM として描かれています。p値、対t-テストします。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 6。HDI Prdm1 -Mirna をターゲットの表現を増加は、マイクロ Rna シーケンスによって示すように、
(A) 配列アラインメント、Mirna との 3' UTR Prdm1 Mrna のターゲット サイトの。(B) B 細胞は、LPS と IL-4 60 h. Prdm1をターゲット 3' UTR に miRNA seq で分析し、RPM として描かれている予測された Mirna の発現の HDI (バルプロ酸 500 M) の有無で培養しました。p値、対t-テストします。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
このプロトコルは、B 細胞クラス スイッチや形質細胞分化を誘導するために包括的なアプローチを提供します。エピジェネティックな変調、すなわち HDI; によってその影響を分析するにはこれらの細胞の mRNA および miRNA の表現に HDI の効果を検出します。これらのアプローチのほとんどは、ヒト B 細胞機能と mRNA/miRNA 発現の後成的要因の影響を分析する使用できます。定などのエピジェネティックな変調器を投与したマウスから分離した B 細胞を分析するは qRT PCR および mRNA seq miRNA seq アプローチが使えます。
エピジェネティックな変調は細胞増殖や生存率は、CSR とプラズマ細胞分化に影響を与えることができるなど、多くの異なる細胞機能に影響を与えます。したがって、細胞増殖、生存率、および HDI 治療の有無、B 細胞の細胞周期を解析する必要があります。HDI による mRNA および miRNA の表現や qRT PCR によって他のエピジェネティックなレギュレータの変調を分析するための課題の 1 つは、適切な家計の遺伝子または小さな RNA を選んでいます。多くの一般的なハウスキーピング遺伝子は、エピジェネティックな変調器によって様々 な程度に変更できます。多くの異なるハウスキーピング遺伝子の発現レベルを測定し、qRT PCR による特異的遺伝子発現を正常化するために使用する必要があります。この問題は、mRNA シーケンスと miRNA seq、ゲノムワイドな mRNA や miRNA レベルが個々 の mRNAs や Mirna の表現を正規化することができますでも対処することができます。
mRNA シーケンスことができますのみ適切なバイオインフォマティクス パイプライン、mRNA 発現プロファイルを定義しませんが、このアプローチは、長鎖非コード RNA (lncRNA) プロファイルを定義することも。mRNA シーケンスは通常多 + ランダムプライマー選択による Rna の濃縮を行います。LncRNA の数は、ポリ a の尾を不足のために知られている、オリゴ (dT) 選択を含む mRNA seq アプローチは lncRNA 式の完全な情報を特定できません。MRNA と lncRNA の両方の発現プロファイルの完全なカバレッジを達成するために rRNA 枯渇を含む RNA シーケンス アプローチを使用してください。我々 の実験のほとんどは、市販のキットを使用して、miRNA seq、mRNA シーケンスおよび qRT PCR のための miRNA を含む、総 RNA を抽出します。高スループット シーケンス ライブラリを構築する前総 RNA の品質、自動化された蛋白質、DNA、RNA サンプル QC システム上、因数を実行することによって検証されます。7.0 の数または小さな RNA ライブラリの準備のため使用する場合は、それ以上、鈴がある RNA サンプルをお勧めします。鈴番号が小さいサンプル小さな RNA 種 (15-30 ヌクレオチド) のサイズの範囲で劣化した RNA 製品のより高いパーセントがあります。凛が 7.0 以下、報道はほど良くなります。MRNA 分離アプローチよりもむしろ rRNA 枯渇のアプローチを実行することより少なくより理想的な RNA サンプルの別のオプションですが、少なくとも 10 ng/mL をサンプルには必要になります。
MRNA シーケンスここで使用のためのプロトコルは総 RNA の 100-1,000 ng に最適です。MiRNA seq 100 未満を使用しての小さな RNA シーケンス ライブラリの準備の総 RNA の ng はより敏感の小さな RNA シーケンス準備・ プロトコル、共通の自然の構造の利点は、ほとんど知られているマイクロ Rna 分子に従う必要があります。最も成熟 Mirna 5'-リン酸およびその生合成経路の結果として 3' ヒドロキシル グループがあります。このため、このキットで 3' と 5' のアダプターが直接 miRNAs に組み合わされて。
B 細胞 mRNA および miRNA 発現体内に HDI の影響を分析するには、マウスがこの HDI を飲料水とした T 依存性抗原 NP CGG または T に依存しないこれらのマウスの腹腔内投与に追加することによってバルプロ酸または他の定と扱うことがNP LPS 抗原を実行できます。予防接種後 10 日以内、脾臓からの B 細胞を浄化することが。
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Disclosures
著者は、彼らは競合する金銭的な利益があることを宣言します。
Acknowledgments
この作品は、NIH 助成金 AI 105813 や AI 079705 (PC) に支えられた、(PC) にループス グラント ALR 295955 でループス研究ターゲット識別のための同盟および関節炎国立研究財団研究は (HZ) に付与します。TS は、xiangya の第 2 UT 医学サンアントニオ校の医学生の訪問プログラムのコンテキストで小児医療センター、第二 xiangya の第 3 病院、中央南大学、長沙、中国によって支えられました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57BL/6 mice | Jackson Labs | 664 | |
| Corning cellgro RPMI 1640 Medium (Mod.) 1X with L-Glutamine (Size: 6 x 500mL; With L-Glutamine) | Fisher Scientific | MT 10-040-CV | |
| FBS | Hyclone | SH300 | |
| HyClone Antibiotic Antimycotic Solution 100 mL | Fisher Scientific - Hyclone | SV3007901 | |
| β-Mercaptoethanol | Fisher Scientific | 44-420-3250ML | |
| Falcon Cell Strainers | Fisher Scientific | 21008-952 | |
| Trypan Blue Stain 0.04% | GIBCO/Life Technologies/Inv | 15250 | |
| ACK Lysis Buffer | Fisher Scientific | BW10-548E | |
| Hausser Scientific Bright-Line Counting Chamber | Fisher Scientific | 02-671-51B | |
| EasySep Magnet | Stem Cell Technologies | 18000 | |
| Falcon Round-Bottom Polystyrene Tubes with Cap | Fisher Scientific | 14-959-1A | |
| EasySep Mouse B cell Isolation Kit | Stem Cell Tech | 19854 | |
| BD Needle Only 18 Gauge 1.5 inch SHORT BEVEL 100/box | BD Biosciences | 305199 | |
| PE/Cy7 anti-mouse CD138 (Syndecan-1) Antibody | BioLegend | 142513 (25 ug) | |
| PE-Cy7 B220 antibody | BioLegend | 103222 | |
| 7-AAD (1 mg) | Sigma Aldrich | A9400-1MG | |
| APC anti-mouse/human CD45R/B220 antibody | Biolegend | 103212 | |
| Mouse APC-IgG1 200 µg | Biolegend | 406610 | |
| FITC anti-mouse IgM Antibody | Biolegend | 406506 | |
| FITC anti-mouse/human CD45R/B220 Antibody | Biolegend | 103206 | |
| PE Anti-Human/Mouse CD45R (B220) (RA3-6B2) | Biolegend | 103208 | |
| HBSS 1X | Fisher Scientific | MT-21-022-CM | |
| Bovine Serum Albumin, Fraction V, Heat Shock Treated | Fisher Scientific | BP1600-100 | |
| LPS 25mg (Lipopolysaccharides from Escherichia coli 055:B5) | Sigma Aldrich | L2880-25MG | |
| Recombinant mouse IL-4 (carrier-free) | BioLegend | 574302 (size: 10 ug) | |
| Valproic acid sodium salt | Sigma Aldrich | P4543 | |
| SterilGARD e3 Class II Type A2 Biosafety Cabinet | The Baker Company | SG404 | |
| Large-Capacity Reach-In CO2 Incubator | Thermo Scientific | 3950 | |
| Isotemp Digital-Control Water Baths: Model 205 | Fisher Scientific | 15-462-5Q | |
| 5mL Round Bottom Polystyrene Test Tube | Fisher Scientific | 14-959-5 | |
| Corning CentriStar 15ml Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 05-538-59A | |
| 1.7 mL Microtube, clear | Genesee | 22-282 | |
| Higher-Speed Easy Reader Plastic Centrifuge Tubes 50ml | Fisher Scientific | 06-443-18 | |
| ELMI SkySpin CM-6MT | ELMI | CM-6MT | |
| Rotor 6M | ELMI | 6M | |
| Rotor 6M.06 | ELMI | 6M.06 | |
| Drummond Portable Pipet-Aid XP Pipet Controller | Drummond Scientific | 4-000-101 | |
| 25 mL serological pipette tips | Fisher Scientific | 89130-900 | |
| 10 mL serological pipette tips | Fisher Scientific | 89130-898 | |
| 5 mL serological pipette tips | Fisher Scientific | 898130-896 | |
| 48-well plates | Fisher Scientific | 07-200-86 | |
| Allegra 6 Benchtop Centrifuge, Non-Refrigerated | Beckman Coulter | 366802 | |
| GH-3.8A Rotor, Horizontal, ARIES Smart Balance | Beckman Coulter | 366650 | |
| Allegra 25R Benchtop Centrifuge, Refrigerated | Beckman Coulter | 369434 | |
| TA-15-1.5 Rotor, Fixed Angle | Beckman Coulter | 368298 | |
| Fisher Scientific AccuSpin Micro 17 | Fisher Scientific | 13-100-675 | |
| Fisher Scientific Analog Vortex Mixer | Fisher Scientific | 02-215-365 | |
| miRNeasy Mini Kit (50) | Qiagen | 217004 | |
| Direct-zol RNA MiniPrep kit | Zymo Research | R2050 | |
| Chloroform (Approx. 0.75% Ethanol as Preservative/Molecular Biology) | Fisher Scientific | BP1145-1 | |
| Rnase-Free Dnase set (50) | QIAGEN | 79254 | |
| NanoDrop 2000 Spectrophotometers | Thermo Scientific | ND-2000 | |
| Superscript III First-strand Synthesis System RT-PCR | Invitrogen | 175013897 | |
| iTaq Universal SYBR Green Supermix | Bio-rad | 172-5121 | |
| Fisherbrand 96-Well Semi-Skirted PCR Plates, case of 25 | Fisher | 14-230-244 | |
| Microseal 'B' Adhesive Seals | Bio-Rad | MSB-1001 | |
| MyiQ Optics Module | Bio-Rad | 170-9744 | |
| iCycler Chassis | Bio-Rad | 170-8701 | |
| Optical Kit | Bio-Rad | 170-9752 | |
| BD LSR II Flow Cytometry Analyzer | BD Biosciences | ||
| FACSDiva software | BD Biosciences | ||
| FlowJo 10 | BD Biosciences | ||
| 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies | G2943CA | |
| S200 Focused-ultrasonicator | Covaris | S200 | |
| SPRIworks Fragment Library System I for Illumina | Beckman Coulter | A288267 | |
| cBot Cluster Generation Station | illumina | SY-312-2001 | |
| HiSeq 2000 Genome Sequencer | Illumina | SY-401-1001 | |
| TruSeq RNA Library Prep Kit v2 | Illumina | RS-122-2001 | |
| TruSeq Small RNA Library Prep Kit | Illumina | RS-200-0012 | |
| NEXTflex Illumina Small RNA Sequencing Kit v3 | Bioo Scientific | 5132-05 | |
| 2200 TapeStation | Agilent | G2964AA |
References
- Allis, C. D., Jenuwein, T. The molecular hallmarks of epigenetic control. Nat Rev Genet. 17, 487-500 (2016).
- Li, G., Zan, H., Xu, Z., Casali, P. Epigenetics of the antibody response. Trends Immunol. 34, 460-470 (2013).
- Zan, H., Casali, P. Epigenetics of Peripheral B-Cell Differentiation and the Antibody Response. Front Immunol. 6, 631 (2015).
- Xu, Z., Zan, H., Pone, E. J., Mai, T., Casali, P. Immunoglobulin class-switch DNA recombination: induction, targeting and beyond. Nat. Rev. Immunol. 12, 517-531 (2012).
- Nutt, S. L., Hodgkin, P. D., Tarlinton, D. M., Corcoran, L. M. The generation of antibody-secreting plasma cells. Nat. Rev. Immunol. 15, 160-171 (2015).
- Bartel, D. P. MicroRNAs: target recognition and regulatory functions. Cell. 136, 215-233 (2009).
- Fabian, M. R., Sonenberg, N., Filipowicz, W. Regulation of mRNA translation and stability by microRNAs. Annu. Rev. Biochem. 79, 351-379 (2010).
- White, C. A., et al. Histone deacetylase inhibitors upregulate B cell microRNAs that silence AID and Blimp-1 expression for epigenetic modulation of antibody and autoantibody responses. J Immunol. 193, 5933-5950 (2014).
- Farh, K. K., et al. Genetic and epigenetic fine mapping of causal autoimmune disease variants. Nature. 518, 337-343 (2015).
- Nagalakshmi, U., Waern, K., Snyder, M. RNA-Seq: a method for comprehensive transcriptome analysis. Curr Protoc Mol Biol. , 11-13 (2010).
- Martin, J. A., Wang, Z.
- Luo, S. MicroRNA expression analysis using the Illumina microRNA-Seq Platform. Methods Mol. Biol. 822, 183-188 (2012).
- Shen, T., Sanchez, H. N., Zan, H., Casali, P. Genome-wide analysis reveals selective modulation of microRNAs and mRNAs by histone deacetylase inhibitor in B cells induced to uUndergo class-switch DNA recombination and plasma cell differentiation. Front. Immunol. 6, 627 (2015).
- Trapnell, C., et al. Differential gene and transcript expression analysis of RNA-seq experiments with TopHat and Cufflinks. Nat Protoc. 7, 562-578 (2012).
- Kin, T., et al. fRNAdb: a platform for mining/annotating functional RNA candidates from non-coding RNA sequences. Nucleic Acids Res. 35, D145-D148 (2007).
- Agarwal, V., Bell, G. W., Nam, J. W., Bartel, D. P. Predicting effective microRNA target sites in mammalian mRNAs. Elife. 4, (2015).
- Griffiths-Jones, S., Saini, H. K., van Dongen, S., Enright, A. J. miRBase: tools for microRNA genomics. Nucleic Acids Res. 36, D154-D158 (2008).
- Anders, G., et al. doRiNA: a database of RNA interactions in post-transcriptional regulation. Nucleic Acids Res. 40, D180-D186 (2012).
